Plexin A1蛋白及mRNA在小鼠卵泡发育过程中的表达

目的:探讨Plexin A1在小鼠卵巢不同发育阶段的表达。方法:选择不同发育时期的C57BL/6j小鼠,采用免疫组织化学方法测定小鼠卵巢中Plexin A1蛋白水平的表达,实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)方法检测Plexin A1mRNA水平的表达。结果:Plexin A1蛋白在小鼠卵巢各级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中均有表达。随着卵泡的不断发育,其在卵母细胞和颗粒细胞中的表达水平均逐渐增强。始基卵泡卵母细胞中的Plexin A1蛋白表达水平明显低于初级、次级和窦状卵泡的卵母细胞。始基卵泡颗粒细胞中未见明显Plexin A1蛋白表达,至初级卵泡阶段可见颗粒细胞开始有Plexin A1蛋白表达,其水平低于次级及窦状卵泡。闭锁卵泡中的Plexin A1呈强阳性表达,明显高于生长卵泡中的表达水平。Plexin A1mRNA在卵巢组织中的表达水平随周(日)龄呈先升高后降低的趋势,5d,7d,3周小鼠卵巢中Plexin A1 mRNA表达水平分别为3d小鼠的1.56、1.26、0.79倍(P<0.05),而2周小鼠卵巢中的Plexin A1mRNA表达水平与3d小鼠相当(P>0.05)。结论:Plexin A1在不同级别的小鼠卵泡中均有表达,且表达水平随卵泡的不断生长发育而增强,但闭锁卵泡中表达最强,提示Plexin A1在卵泡的生长发育及闭锁过程中可能发挥重要的调控作用。     

Peroxiredoxin Ⅱ mRNA 在小鼠卵泡发育中定位的研究

目的:观察PeroxiredoxinⅡmRNA在小鼠卵巢各级卵泡和MII卵中的分布,为了解PeroxiredoxinⅡ在卵母细胞发育及成熟过程 中的功能意义提供形态学依据.方法:原位杂交方法.结果:在小鼠卵巢内,原始卵泡的初级卵母细胞未检到PeroxiredoxinⅡ mRNA的杂交信号,初级卵泡的初级卵母细胞可检到杂交信号,次级卵泡和近成熟卵泡中卵母细胞的信号明显增强.离开卵巢的 GV卵也能检到较强的杂交信号,排到输卵管的次级卵母细胞(MII卵)杂交信号与GV卵相比明显减弱.从原始卵泡到近成熟卵 泡周围的卵泡细胞均可检到杂交信号,其信号强度在卵泡发育成熟过程中未见有明显变化.卵母细胞和卵泡细胞的Peroxiredoxin ⅡmRNA杂交信号均分布在胞质.结论:提示PeroxiredoxinⅡ可能参与了卵母细胞生长发育和卵母细胞成熟过程的调节.     

Peroxiredoxin Ⅱ在小鼠卵巢中卵泡、GV卵、MⅡ卵和植入前胚的表达和定位

目的:观察PeroxiredoxinⅡ在小鼠卵巢中卵泡和植入前胚的表达与定位,为探讨PeroxiredoxinⅡ在小鼠卵母细胞发育成熟和早 期胚发育的作用提供依据.方法:根据小鼠PeroxiredoxinⅡmRNA序列(AccessionNo:BC002034)设计引物,对小鼠生发泡完整 卵细胞(GV卵)中的PeroxiredoxinⅡ可能编码区进行扩增.同时,取生后3d和2mo小鼠的卵巢,免疫细胞化学染色显示Perox iredoxinⅡ蛋白在卵泡中的分布.此外,运用RT PCR和免疫细胞化学染色方法观察PeroxiredoxinⅡ在植入前胚的表达.结果:从 GV卵中扩增所得684bp的cDNA序列,与小鼠PeroxiredoxinⅡ具有99%同源性;其推导的编码氨基酸序列与小鼠Peroxiredoxin Ⅱ氨基酸序列完全相同.免疫细胞化学染色显示:生后3d小鼠卵巢内未见PeroxiredoxinⅡ阳性反应;2mo小鼠卵巢内阳性反应 见于初级卵泡、次级卵泡和近成熟卵泡中卵母细胞的胞质.卵泡细胞未见PeroxiredoxinⅡ阳性反应.RT PCR结果表明:Peroxire doxinⅡmRNA在GV卵中处高水平,从MⅡ卵开始略有下降,在4 细胞胚和早期囊胚期间未检到.免疫细胞化学染色显示:GV 卵、MⅡ卵、1 细胞胚、2 细胞胚、4 细胞胚、8 细胞胚、桑椹胚和早期囊胚均呈PeroxiedoxinⅡ阳性反应.结论:PeroxiredoxinⅡmR NA和蛋白在小鼠植入前胚的表达存在时程差别,     

Cyclin G1在小鼠卵巢的表达及其与卵泡发育的关系

目的观察细胞周期素G1（Cyclin G1）在小鼠卵巢中各级卵泡的表达及其与卵泡发育的关系。方法性成熟前小鼠用孕马血清促性腺激素（PMSG）刺激卵泡生长，用绒毛膜促性腺激素（hCG）刺激卵泡排卵及向黄体转化。于给药后不同时间取出卵巢，用免疫组化方法检测不同发育阶段卵泡Cyclin G1蛋白的表达和分布；用细胞免疫荧光方法检测不同成熟阶段的卵细胞中Cyclin G1蛋白表达。结果免疫组化染色结果显示，颗粒细胞中Cyclin G1的表达水平随卵泡发育成熟而逐渐增强，且一直定位在胞核；Cyclin G1在各个时期卵泡的卵母细胞中均有表达。该表达的定位与卵泡生长发育的不同阶段有关。随着卵泡的发育，Cyclin G1在卵母细胞的表达由胞核转至胞浆。至排卵前卵泡颗粒细胞，Cyclin G1表达水平减弱，当颗粒细胞分化为黄体细胞后表达水平进一步减弱。闭锁卵泡中Cyclin G1的表达水平很弱。细胞免疫荧光染色结果显示，处于生发泡时期（GV）卵母细胞仅有较弱的Cyclin G1表达，当卵母细胞生发泡破裂（GVBD）后，该表达增强；与处于第二次减数分裂中期（MⅡ）的卵母细胞相比，受精卵的Cyclin G1表达明显增强。结论Cyclin G1在小鼠卵泡发育及卵母细胞成熟过程中的表达具有时空特异性，可能作为细胞周期的正调节因子参与了卵泡生长发育和卵母细胞成熟过程的调控。     

Fkbp38基因缺失导致小鼠早发性卵巢功能不全：基于激活mTOR通路并诱导细胞凋亡

目的 探讨他克莫司结合蛋白38（Fkbp38）在卵泡发育中的作用及其缺失导致早发性卵巢功能不全（POI）的机制。方法 采用Cre-loxp系统构建卵母细胞特异性敲除Fkbp38转基因小鼠,并应用PCR鉴定小鼠基因型,然后在蛋白水平上验证Fkbp38在卵母细胞中的敲除效果。通过HE染色在显微镜下计数敲除小鼠与同窝对照小鼠卵巢原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡及窦卵泡数量分析卵母细胞缺失Fkbp38基因对小鼠卵泡发育的影响。通过繁殖实验及ELISA实验检测小鼠繁殖能力及血清性激素水平,明确卵母细胞敲除Fkbp38基因对卵巢功能的影响。TUNEL法检测敲除小鼠与同窝对照小鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况。检测雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路下游靶蛋白磷酸化核糖体S6（PS6）活性验证Fkbp38基因对mTOR信号通路的影响。IF检测凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）及Bcl2-Associated X（BAX）表达明确Fkbp38基因敲除对卵母细胞发育的影响。结果 卵母细胞特异性敲除Fkbp38转基因小鼠模型构建成功。敲除小鼠较对照小鼠表现出生育力下降,性激素水平紊乱,卵巢内原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡数均显著减少（P<0.05）,引起POI样改变。卵母细胞特异性敲除Fkbp38基因后,mTOR信号通路激活,颗粒细胞凋亡增加,卵母细胞内BAX蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达减弱,BAX/Bcl-2蛋白比值显著升高（P<0.05）。结论 Fkbp38在卵泡发育中发挥重要作用,其缺失致POI发生的机制可能是通过激活mTOR信号通路诱导细胞凋亡而引起的。     

卵巢功能调控相关蛋白在不同发育阶段卵泡中的表达及其意义

目的：检测卵巢功能调控相关蛋白在不同发育阶段卵泡中的表达,探讨其在卵泡发育及卵巢功能调控中的作用及其意义。方法：选取包含原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡、闭锁卵泡及白体的育龄期女性卵巢组织,采用免疫组织化学法分析乙二醛酶I （Glyoxalase I）、泛素羧基末端水解酶L1（UCH-L1）、热休克蛋白27（HSP27）和血清淀粉样蛋白P （SAP）在不同阶段卵泡中的表达情况,并比较卵泡中其表达强度。结果：Glyoxalas I和UCH-L1在次级卵泡、成熟卵泡的颗粒细胞及卵泡膜细胞中呈强表达,表达强度高于其在原始卵泡及初级卵泡胞质中的表达;HSP27在原始卵泡及初级卵泡细胞质中呈强表达,表达强度高于其在在次级卵泡和成熟卵泡颗粒细胞及卵泡膜细胞中的表达;Glyoxalase I和HSP27在闭锁卵泡中呈强表达,表达强度高于其在生长卵泡中的表达;SAP在原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡均表达,表达强度无明显差异;4种蛋白在白体中均不表达。结论：UCH-L1强表达和HSP27弱表达与卵泡成熟发育有关;Glyoxalase I强表达及HSP27强表达与卵泡闭锁及卵巢功能衰退有关。     

雄激素对卵母细胞生长分化因子

通过观察雄激素对小鼠卵母细胞生长分化因子 9（growth differentiation factor 9,GDF 9）表达的影响，研究GDF 9参与卵泡生长发育及其表达调控机制，探讨GDF 9与多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)的关系。方法：以性成熟昆明小鼠为研究模型，体内实验分为实验组（注射丙酸睾丸酮）和对照组（注射等体积的生理盐水），每组各20只小鼠，采用原位杂交法检测卵巢组织GDF 9 mRNA的表达水平。体外实验：胶原酶消化加机械法分离性成熟昆明小鼠卵泡进行体外培养，实验组培养液中加睾丸酮,对照组不加睾丸酮,72?h后收集卵泡，免疫组化检测卵母细胞GDF 9的表达水平。结果：体内实验：实验组较对照组卵巢组织GDF 9 mRNA表达水平降低, 差异有统计学意义（P＜0.05）；体外实验：实验组卵母细胞GDF 9蛋白表达较对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：雄激素减弱卵母细胞GDF 9 mRNA和蛋白的表达强度；表达强度降低的GDF 9可能与PCOS卵泡发育停滞有关     

人胎儿卵巢组织异种移植后卵母细胞的发育及成熟能力

目的探讨人胎儿卵巢组织冷冻复苏、体外培养和异种移植后卵母细胞的发育和成熟情况。方法取5例胎龄20周引产的胎儿卵巢,采用丙二醇慢速冷冻保存,复苏后在组织培养条件下进行体外培养,6d后移植到免疫缺陷小鼠的肾被膜下,应用卵泡刺激激素作用23周后取出卵巢组织,机械法取出窦卵泡内的卵母细胞,结合体外成熟培养,观察卵子成熟情况,并通过移植前后组织学和增殖细胞核抗原(PCNA)表达变化观察卵泡发育情况。结果冷冻复苏组织和新鲜卵巢组织中各期卵泡的构成比之间差异无显著性(P>0.05);培养组织与新鲜组织和冻融组织相比,增殖期卵泡的比例显著增加(P<0.05);移植组织与新鲜组织、冻融组织和培养组织相比,增殖期卵泡比例亦显著增加(P<0.05)。各组织中原始卵泡均未见PCNA阳性表达,其表达最早出现于初级卵泡,新鲜组织和冻融组织中偶可见PCNA阳性表达,而培养组织和移植组织中可见明显的PCNA阳性表达。从移植卵巢的窦卵泡中获得未成熟卵子42个,经体外成熟培养有21.43%的卵子可发育到MII期。结论人胎儿卵巢组织能耐受冻融、组织培养和移植过程,其卵泡能够重新生长发育,恢复内分泌功能,且不影响卵母细胞的发育及成熟能力。     

解剖、生理和组胚学

061438 卵巢早衰患者卵泡刺激素受体基因突变的检测；061439 早期原核消失和卵裂对体外受精周期临床结局的影响；061440 未成熟卵母细胞评分系统对人类未成熟卵体外成熟及发育潜能的评价;061441 内毒素对小鼠卵泡发育、成熟及排卵功能的影响及雌性激素的保护作用；061442 PKC、PKB通过p21^CIP1/WAF1蛋白对小鼠受精卵G2期向M期转换的影响。     

奶牛卵泡超数同步发育及其卵母细胞的发育潜能

目的建立促奶牛卵泡超数同步发育的方法,并利用体细胞核移植和分子技术评价来自这些卵泡的卵母细胞发育潜能。方法用E2-P4对淘汰的高产奶牛进行联合处理后,分别对其实施不同组合的外源促性腺激素处理[FSH12h组,FSH48h组,FSH48h-LH6h组（简称LH6h组）,FSH48h-LH26h组（简称LH26h组）]以促进其卵泡超数同步发育;然后从卵泡中回收COCs进行体外成熟,排放第一极体的卵供作优质种牛的体细胞核转移（nucleartransfer,NT）受体,以评价卵的发育潜能。结果E2-P4能成功地诱导奶牛卵巢中产生一个新的卵泡起始波,并能保证卵泡在外源促性腺激素作用下实现超数同步发育;上述四组不同组合外源促性腺激素处理的卵母细胞衍生的NT重构胚经体内培养7d后,后3组的囊胚发育率显著高于FSH12h组和对照组（P〈0.01）;将这些克隆囊胚移植同步发情的受体牛子宫后,仅LH26h组的卵所获得的克隆胚能实现全程发育（直至克隆小牛出生）。经RT-PCR分析颗粒细胞中FSHr、LHr和连接蛋白43（Connexin43,Cx43）等mRNA含量变化,以及Western印迹分析其Bcl-2和Bax蛋白表达水平的变化,证实该组卵巢提供的同步发育卵泡为早期闭锁卵泡。结论E2-P4-FSH48h-LH26h组合处理可人为调控牛卵泡的同步发育;处于早期闭锁状态卵泡的卵母细胞具备较高的发育潜能。     

姜黄素对新生大鼠卵巢卵泡发育和卵母细胞凋亡的影响

目的：探讨姜黄素对新生大鼠卵泡发育和卵母细胞凋亡的影响。方法：雌性SD大鼠分为母鼠灌胃组（受孕11.5d母鼠灌胃姜黄素（100mg·kg^-1·d^-1）直至分娩,分别取出生后1、2和4d龄雌仔鼠卵巢）,新生鼠腹腔注射组（正常出生1d龄雌仔鼠腹腔注射姜黄素（100mg·kg^-1·d^-1）,连续4d,分别取出生后2、4d龄卵巢）和对照组（以母、幼均未用药的正常同天龄新生鼠的卵巢为对照）。卵巢组织切片由苏木精-伊红染色,观察不同发育阶段的卵泡比例,TUNEL染色检测卵巢内卵母细胞凋亡情况。结果：在1d龄卵巢中,母鼠灌胃组未装配卵泡比例明显低于对照组（P〈0.05）,而原始卵泡的比例明显增加（P〈0.05）;在2d龄卵巢中,新生鼠腹腔注射组未装配卵泡比例明显低于对照组（P〈0.05）,而原始卵泡比例则明显高于对照组（P〈0.05）;在4d龄卵巢中,新生鼠腹腔注射组的原始卵泡比例显著下降（P〈0.05）。早期初级和发育卵泡比例显著升高（P〈0.05）。在1、2d龄卵巢中,母鼠灌胃组和新生鼠腹腔注射组卵母细胞TUNEL阳性率均明显低于对照组（P〈0.05）。结论：姜黄素能加快新生大鼠卵母细胞巢破裂,促进原始卵泡的发育启动,同时能抑制卵母细胞凋亡,可能有益于延长卵巢的生殖寿命。     

Localization of cystathionine β synthase in mice ovaries and its expression profile during follicular development

Background In vitro fertilization (IVF) researches have suggested that cystathionine β synthase (CBS) is involved in oocyte development. However, little is known about the regional and cellular expression patterns of CBS in the ovary. The purpose of this study was to analyze the localization of CBS in mice ovaries and to investigate the expression profile during follicular development. Methods We used in situ hybridization and immunohistochemical analysis to determine CBS expression in the ovaries of female Balb/c mice. Then the follicles were collected from F1 (C57BL×Balb/c) mice and cultured in vitro. With the method of semi-quantitative RT-PCR, we also investigated the expression profile of CBS during follicular development. Results CBS was absent in the oocytes, although it was ubiquitously expressed in the ovary with the strongest expression in follicular cells at all stages. In late antral follicles, CBS expression was markedly higher in granulosa cells located close to the antrum and in cumulus cells around the oocyte. The semi-quantitative RT-PCR showed that CBS mRNA was detected in follicles at all stages in vitro. In cumulus-oocyte complexes superovulated, CBS expression also increased rapidly. Conclusions CBS was located mainly in the follicular cells in the ovaries. The level of CBS expression is high in follicles during folliculogenesis in mice. Differences in the CBS expression profile between oocyte and follicular cells suggest a role for CBS as a mediator in interactions between oocyte and granulosa cells.     

护卵汤对GnRHa超排卵大鼠卵巢形态的影响

目的观察护卵汤对GnRHa超排卵大鼠卵巢形态的影响,为护卵汤辅治ART提供相关理论依据。方法模仿人类辅助生殖中的长周期,对大鼠进行GnRHa垂体降调节后再用HMG等药物超排卵(模型组),同时随机给予不同剂量的护卵汤辅助治疗(分别为护卵汤低、中、高剂量组),以自然周期未使用任何药物的大鼠为正常对照(正常组)。在HCG日称体质量并计算各大鼠卵巢指数,光镜观察排卵前卵泡并计算优质卵泡率,电镜观察卵母细胞的超微结构。结果护卵汤中剂量组的卵巢指数明显高于模型组,差异有统计学意义(P<0.01);模型组和护卵汤各剂量组的卵巢指数均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05或<0.01);模型组的优质卵泡率明显低于正常组和护卵汤中、高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05或<0.01);模型组较正常组卵母细胞凋亡及胞浆水肿明显,而护卵汤中剂量组较模型组卵母细胞超微结构改善,胞内脂滴明显增多,细胞凋亡减少。结论 1、GnRHa超排卵对大鼠的卵泡发育及卵子质量可能有不利影响;2、护卵汤能改善GnRHa超排卵大鼠的卵泡发育及卵子质量。     

半翼基因蛋白在实验鼠卵细胞联会复合体中的表达位置

目的探讨半翼基因（wings apart—like,Wapl）蛋白在实验鼠粗线期的卵细胞中联会复合体（synaptonemal complex,SC）的表达位置。方法从受孕18．5d胎鼠的卵巢中分离出处于粗线期的卵细胞,然后用抗-联合复合体蛋白2（anti-synaptonemal complex protein2,SYCP2）和抗-Wapl蛋白进行双免疫染色。结果SYCP2和Wapl在所检查粗线期的卵细胞位置重叠。结论Wapl可能是粗线期卵细胞SC的一部分。     

取卵日卵泡大小对体外受精后胚胎早期发育影响的护理研究

目的 探讨护理人员取卵日监测卵泡大小对体外受精-胚胎移植（IVF-ET）中卵子成熟及胚胎早期发育的影响.方法 以2012年3月～ 2013年12月来山东省枣庄市妇幼保健院生殖中心行IVF-ET的87个患者为研究对象,研究方法以HCG注射日辅助生殖专职护士进行健康支持教育,取卵日经过专职培训的手术室护士监测观察卵泡直径为依据,对取卵日卵泡大小进行监测、评估、测量液体量,按照卵泡大小将其分大卵泡组、中卵泡组和小卵泡组.取卵手术过程中详细告知实验室人员取出卵泡的大小、取出的液体量.结果 取卵日直径大于15 mm的卵泡获得的卵母细胞成熟度较高（P＜0.01）;（2）大卵泡组卵泡优胚率高于中卵泡组,中卵泡组高于小卵泡组,差异极显著（P＜0.01）.结论 在IVF-ET中,手术室护士通过严密观察、监测卵泡的大小,对实验室人员的详细告知,实验室人员将获得的卵子严格按照大、中、小分类培养,对优质胚胎的获得提供了良好的条件,有利于提高卵子的成熟、受精和早期胚胎发育;有利于提高体外受精-胚胎移植成功率.     

山羊卵泡大小对卵母细胞体外发育能力的影响

目的比较不同大小山羊卵泡的卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎发育的能力。方法收集不同大小山羊卵泡的卵母细胞,分3组进行体外培养。Ⅰ组：卵泡直径≥5.0mm;Ⅱ组：卵泡直径3.0～4.9mm;Ⅲ组：卵泡直径〈3.0mm。观察各组卵母细胞体外成熟率、体外受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果3组卵母细胞体外成熟率与受精率差异无统计学意义（均P〉0.05）。Ⅲ组卵母细胞的卵裂率及囊胚形成率分别为53.8%和28.6%,均显著低于Ⅰ组和Ⅱ组（均P〈0.01）。结论在进行山羊未成熟卵体外成熟培养时,卵泡直径≥3mm的卵母细胞体外发育潜能较卵泡直径〈3mm的卵母细胞好。