结核分支杆菌ESAT6蛋白的表达、纯化及抗原性研究

目的：获得重组ESAT6蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法：分别用生理盐水和卡介苗免疫小鼠8周后,以结核分支杆菌接种小鼠。应用基因工程技术表达、纯化ESAT6蛋白,分别以结核分支杆菌PPD或纯化的rESAT6蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测小鼠或人血清中抗结核抗体。结果：重组质粒pET24b-ESAT6在大肠杆菌BL2（DE3）细胞内以包涵体形式存在,分子量约6kDa,每100ml培养菌可获得约18mg纯化的重组蛋白。生理盐水和卡介苗免疫小鼠血后血清中抗ESAT6抗体无区别。结论分支杆菌攻击后,两组小鼠血清中抗ESAT6抗体均明显升高,但只有卡介苗组小鼠抗体水平超过平均值＋2标准误。以33例正常人血清的OD值＋2S为正常界限值,33例正常人和32例结核病人血清一步法和PDD、rESAT6 ELISA检测抗结核抗体的特异性和敏感性分别为：一步法87.9%(29/33),65.6%(21/32),PPD93.9%(31/33),62.5%(20/32);rESAT6 97%(32/33),18.2%(4/32)。结论：pET24b-ESAT6大肠杆菌工程菌能以包涵形式高效表达重组ESAT6蛋白,卡介苗免疫对血清中ESAT6抗体无影响,结核病人血清中抗ESAT6抗体阳性率低,rESAT6纯化蛋白可作为结核病血清学诊断的混合抗原之一。     

结核杆菌分泌蛋白Ag85A基因的克隆、表达及其诊断价值

目的：获得重组抗原85A(rAg85A)，研究其免疫学特性，评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法：应用基因工程技术克隆、表达、纯化Ag85A蛋白，通过Western印迹分析其抗原性。分别以结核分支杆菌纯蛋白衍生物（PPD）或纯化的rAg85A蛋白为抗原，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）及结核病一步检测血清中抗结核抗体。结果：重组质粒pET30a-Ag85A测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的2％左右，Western印迹分析它与抗结核分支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化的rAg85A样品纯度约85％左右，每100ml培养菌可获得2mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值 2s为正常界限值，一步法的特异性和敏感性分别为87.9％和65.6％；PPD分别为93.9％和62.5％；rAg85A分别为93.9％和15.6％。结论：pET30a-Ag85A大肠杆菌工程菌能以包涵 体形式表达rAg85A蛋白，该蛋白具有较高的抗原特异性，但检测抗结核抗体的灵敏度低。     

结核分支杆菌MPT63抗原的表达及其血清学诊断价值的研究

目的：获得结核分支杆菌重组MPT63蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。寻找更有效的结核病诊断试剂,方法：应用基因工程技术表达,纯化MPT63蛋白,通过Western blotting和免疫双扩散试验春抗原性,通过斑点免疫试验,结明试验和结核病一步法检测血清中的抗结核抗体。结果：重组质粒pET24b-MPT63测序表明具有正确的编码序列,MPT63蛋白在大肠杆菌细胞内以可溶性蛋白的形式高效率表达,表达量占菌体总蛋白的40％左右,分子量的kDa,Western blotiing和免疫双扩散试验检测抗结核,抗体的阳性率分别为46．7％和50％,结核病一步法检测的阳性率为70％,结明试验的阳性率为80％,在34例正常血清中,MPT63和PPD斑点免疫试验检测抗结核抗体的阳性率分别为38．2％和35．3％,结论病一步法检测的阳性率也为23．5％,结论：pET24b-MPT63大杆菌工程菌能以可溶性蛋白的形式高效表达,重组的MPT63也许可作为结核病血清学诊断的一组抗原之一。     

结核分枝杆菌重组MTB48蛋白抗原血清学诊断价值的研究

目的 研究重组MTB48(recombinant MTB48,rMTB48)蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,寻找更有效的结核病诊断试剂.方法 应用基因工程技术表达、纯化rMTB48蛋白,通过酶联免疫吸附试验方法检测402例血清中抗结核抗体.结果 rMTB48蛋白在大肠杆菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量占菌体总蛋白的30%左右,分子量约57.6 kD,具有良好的抗原特异性.在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗MTB48抗体的阳性率分别为41.7%和24.3%,总的灵敏度为32.9%.在192例正常人血清中,95例PPD阴性者和97例PPD阳性者抗MTB48抗体的阳性率分别为0.0%和11.3%,总的特异性为5.7%.结论 rMTB48蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一.     

结核分枝杆菌重组蛋白CFP-10-ESAT-6-PPE68的表达、纯化与多克隆抗体的制备

目的构建重组质粒pET32a(+)-cfp-10-esat-6-ppe68,得到重组结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白及兔抗结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白的多克隆抗体,为下一步应用于临床结核病的检测奠定基础。方法将结核分枝杆菌cfp-10-esat-6-ppe68基因转入质粒pET32a,将经PCR、酶切、序列测定鉴定为阳性的质粒转入大肠杆菌DE3,IPTG诱导表达重组蛋白,经亲和层析法纯化重组蛋白后用凝血酶切除载体蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体并进行纯化。结果成功构建重组质粒表达体系pET32a(+)-cfp-10-esat-6-ppe68,制得去除载体蛋白的高纯度重组蛋白CFP-10-ESAT-6-PPE68,并成功得到高纯度抗结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白的抗体。结论成功表达结核重组蛋白并制得高纯度多克隆抗体。     

结核分支杆菌MPT64基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达、纯化和诊断运用

目的利用大肠杆菌表达系统大量获得重组MPT64蛋白,分析其生物学、免疫学特性,并初步评估其在结核病血清学诊断方面的价值.方法用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分支杆菌H37Rv中获得了MPT64基因,并构建大肠杆菌表达株;聚丙烯酰胺凝胶电泳重组蛋白;Western印迹及酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析重组蛋白免疫原性,并检测血清的抗结核抗体.结果构建了能表达重组MPT64的大肠杆菌工程菌,表达的重组蛋白蛋白为可溶性形式,表达量占细胞总蛋白的30%,分子量约23kD.经离子交换柱纯化后,重组蛋白纯度达90%以上.Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应.ELISA分析表明该纯化的重组抗原能区别抗结核抗体阳性患者血清及正常人血清.结论该实验获得了能高效表达MPT64蛋白抗原的大肠杆菌工程菌.纯化的该重组蛋白具有特异的免疫原性,有一定的诊断运用价值.     

人钠泵α2亚基M4～M5区片段的克隆、原核表达与纯化

目的 构建钠泵α2亚基第4跨膜区与第5跨膜区之间的蛋白结构域M4～M5的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化.方法 通过PCR反应和酶切技术,构建表达载体pET28b( + )-M4-5,并于大肠杆菌E.coli Rosetta 2进行表达,用6 mol/L盐酸胍对表达形成的不溶包涵体进行变性,梯度稀释复性后,用Ni-NTA亲和柱进行纯化,得到目的 蛋白,用Western blot分析表达产物,并采用无机磷法测定其ATP酶活性.结果 重组表达载体pET28b( + )-M4-5经酶切与测序鉴定证实构建成功;导入大肠杆菌Rosetta 2进行表达,表达产物相对分子质量为52×103左右,与预期值相符,表达量占细胞全蛋白的30%左右;SDS-PAGE分析表明,表达产物主要以包涵体形式存在,亲和柱纯化后,目的 蛋白的纯度在95%以上;Western blot分析表明表达产物与抗His抗体特异性结合;重组蛋白的ATP酶活性为(15.3±1.8)mmol·(g·h)-1.结论 构建了原核表达载体pET28b( + )-M4-5,并在大肠杆菌Rosetta 2中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的M4～M5融合蛋白.     

结核分枝杆菌特异性蛋白片段Rv3388和6种特异抗原在结核抗体检测中的应用价值

目的 对结核分枝杆菌( MTB) PE家族的所有成员的结构进行分析,预测其抗原表位,截取Rv3388蛋白的优势抗原片段,对重组Rv3388蛋白及其它6种MTB特异性抗原进行评估,探讨不同结核特异性抗原与血清抗体的反应模式,评价血清学检测在结核病诊断中的价值. 方法 利用基因合成技术重叠延伸PCR扩增Rv3388蛋白637~731位的编码基因片段, 原核表达并纯化重组蛋白pET32a/Rv3388637-731 ,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA法对该抗血清进行免疫原性分析. 同时对这7种MTB特异性蛋白的特异性及敏感性进行评价. 结果 重组蛋白pET32a/Rv3388637-731在大肠杆菌中的表达量占全菌蛋白的80%,ELISA显示有较强的免疫原性. 7 种 MTB特异性抗原具有不同的反应模式,单个抗原检测敏感性较差. 结论 对MTB PE家族的蛋白结构分析,表达并纯化重组蛋白pET32a/ Rv3388637-731 ,7种蛋白在血清抗体检测中具有抗原互补性,不同抗原与机体反应存在不同反应模式,提高结核抗体检测敏感性应多种抗原联合检测.     

重组人血红蛋白δ链的制备与鉴定

目的克隆人血红蛋白δ(delta)链蛋白基因,并在大肠杆菌中进行表达,经纯化与鉴定,获得δ链蛋白,为建立β-地中海贫血的免疫学筛查方法提供特异性抗原。方法从K562细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术获得目的片段并将其克隆到pET-32a及pET43.1a载体中,经PCR、酶切及测序验证,以IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。包涵体经变性、复性后以Ni2+亲和层析柱纯化,可溶性蛋白直接以Ni2+亲和层析柱纯化。采用Western Blot和ELISA分析鉴定表达产物。结果成功构建两种融合表达载体pET32-Hbδ及pET43.1-Hbδ,分别为包涵体表达和可溶性表达,纯化产物经Western blotting和ELISA鉴定均为δ链蛋白。结论克隆表达并获得了纯化的人血红蛋白δ链,为后续的抗体制备及地中海贫血的免疫筛选方法的建立提供了抗原。     

人腺苷激酶在大肠杆菌中的表达与纯化

目的 诱导人腺苷激酶组组蛋自在大肠杆菌中表达,并对表达的重组蛋白进行纯化.方法 将由人腺苷激酶基因开放阅读框与原核表达载体pET30a(+)连接构建的重组蛋白表达载体pET30a(+)/ADK转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞.1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达.离心收集菌体后结合使用溶菌酶、冻融和超声破碎的方法裂解菌体.用含2 mol/L和4 mol/L尿素的结合缓冲液洗涤包涵体去除部分杂蛋白.随后用含8 mol/L尿素的结合缓冲液变性溶解剩余包涵体沉淀.用Ni-NTA柱通过亲和层析纯化重组蛋白,用含8 mol/L尿素的洗脱缓冲液洗脱.收集样品透析复性.结果 成功构建人腺苷激酶原核表达载体且目的 蛋白以包涵体形式表达.经包涵体洗涤、变性溶解,亲和层析及分步透析复性获得纯度达85%以上的重组蛋白.结论 人腺苷激酶表达载体的成功构建以及重组蛋白的纯化.为进一步进行其结构和功能的研究奠定了基础.     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

87株幽门螺旋杆菌VacA等位基因的分析

目的以研究方法LiPA（Line Probe Assay）分析VacA等位基因的表达,了解幽门螺旋杆菌致病机理的理解。方法从三个不同城市87位进行胃镜检查患者的胃粘膜中培养出幽门螺旋杆菌,提取DNA,用LiPA方法分析VacA等位基因。结果（1）87位患者以sic（88．5％）和m2a（63．2％）分布为主,未发现s1b和s2;（2）混合菌株感染率为41．4％,远远高于西方国家,其中上海的混合感染率最高（62．5％）,与北京（41．0％）和南宁（20．8％）相比具有显著性差异,P〈0．01;（3）北京、海、南京三个不同城市s1、m等位基因亚型分布率存在差异;（4）溃疡病和非溃疡病患者m1和m2的分布率没有显著性差异。结论我国幽门螺旋杆菌多重菌株感染率较高,不同的m基因型与消化性溃疡的发生无显著性相关。     

十二指肠损伤的治疗体会

目的：提高十二指肠损伤的诊治水平，方法：回顾总结该院1999年－2001年间收治的十二指肠损伤7例临床经验。结果：合并其他腹部脏器损伤86％（6／7），单纯十二指肠损伤14％（1／7）。损伤部位以十二指肠降部为多占71％（5／7），水平部和球部各占14％（1／7），术后并发症发生率28％（2／7）、病死率14％（1／7）。结论：掌握十二指肠损伤的特点，早诊断、早手术、术中认真探查，掌握好检查指征，选择合理恰当术式，加强术后管理，可提高治愈率。     

断指再植的护理体会

随着医疗水平的提高,显微手外科技术在各基层医院已得到广泛开展,所收治的此类患者在逐年增加.随机统计了近两年我院20份34指的病例,通过观察认为手术的成功与否不但取决于损伤的局部条件、术中的操作和术后的治疗,同时与术前、术后的护理也密不可分.对离断指及伤口的妥善处理,积极的术前准备和术后的精心护理,特别是术后对血运的密切观察,同时通过术前术后的健康教育使患者对该疾病的知识有了一定的掌握,认识了康复训练的重要性从而使功能达到最大限度的恢复.     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。