温阳通络方对硬皮病成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及MMP-1mRNA的影响

目的：观察温阳通络方对系统性硬皮病（SSc）患者皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA及MMP-1mRNA的影响。方法：12例SSc患者分成SSc对照组（初诊未治疗者）、西药组、中药组和中西药联合组,每组3例。除对照组外,其他三组分别给予青霉胺和强的松、温阳通络方煎剂、青霉胺和强的松加温阳通络方煎剂口服,疗程2个月。SSc对照组在治疗前取血分离血清备用;西药组、中药组和中西药联合组治疗2个月后取血分离血清。另取正常及SSc患者皮肤进行成纤维细胞原代培养并以上述血清处理,正常对照组不予处理,然后提取总RNA,以设计的引物逆转录生成cDNA,然后PCR扩增、凝胶电泳后图像分析Ⅰ、Ⅲ型胶原及MMP-1mRNA表达。结果：与正常皮肤比较,SSc皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及MMP-1mRNA表达量明显增多（P〈0.01）;与SSc对照组比较,20%含药血清处理后各组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达量明显减少（P均〈0.01）;中药组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达量显著高于西药组和中西药组（P均〈0.01）,中西药组显著低于西药组（P〈0.01）;各组间SSc皮肤成纤维细胞MMP-1mRNA表达量差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：SSc患者皮肤成纤维细胞胶原合成量增加,温阳通络方在一定程度上干扰SSc患者皮肤成纤维细胞I、III型胶原mRNA表达,而对MMP-1干预作用不明显。     

黄芪甲苷对人成纤维细胞光老化的抑制作用

目的：观察黄芪甲苷对长波紫外线（ultraviolet A,UVA）辐射导致的人成纤维细胞衰老的抑制作用,以及对基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1,MMP-1）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）等老化相关基因表达的影响。方法：分离培养人原代成纤维细胞,将亚融合状态的培养细胞分为空白对照组、黄芪甲苷组、UVA组和UVA＋黄芪甲苷组,以10J/cm2UVA进行照射,并加入20μg/mL黄芪甲苷干预处理。采用组织化学染色法检测衰老相关β半乳糖苷酶表达,以酶联免疫吸附法检测上清液中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的含量,实时聚合酶链反应法检测MMP-1和TIMP-1的mRNA表达水平变化。结果：空白对照组及黄芪甲苷组β半乳糖苷酶阳性细胞均较低,UVA组β半乳糖苷酶阳性细胞数则显著升高,加入黄芪甲苷处理可使β半乳糖苷酶阳性细胞比率明显降低（P〈0.05）。黄芪甲苷处理可以促进成纤维细胞分泌TGF-β1;UVA照射成纤维细胞后TGF-β1分泌量明显降低,UVA照射前加入黄芪甲苷可增加TGF-β1分泌量（P〈0.05）。此外,UVA能够诱导MMP-1和TIMP-1的mRNA表达水平升高,而黄芪甲苷可在一定程度上抑制MMP-1mRNA表达,并诱导TIMP-1mRNA表达（P〈0.05）。结论：黄芪甲苷可有效延缓人成纤维细胞光老化进程,其机制可能与促进TGF分泌和抑制胶原降解相关。     

真皮与脂肪组织来源成纤维细胞致纤维化能力的比较研究

目的初步探讨真皮与脂肪组织来源的成纤维细胞的致纤维化能力及其作用机制。方法自同一杜洛克雌性猪真皮和皮下脂肪组织中分别分离和培养成纤维细胞,利用倒置显微镜和透射电子显微镜观察细胞形态和超微结构,采用Real-TimePCR技术检测细胞Ⅰ型和Ⅲ型前胶原、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子β1（TGF-β1）和类胰岛素样生长因子1（IGF-1）mRNA的相对表达量。结果与脂肪来源的成纤维细胞比较,真皮组织来源的成纤维细胞胞体较大,粗面内质网扩张明显。Real-Time PCR检测结果显示：真皮组织来源的成纤维细胞中Ⅰ型前胶原和α-SMA的mRNA相对表达量均显著高于脂肪来源的成纤维细胞（P〈0.05）,而Ⅲ型前胶原和IGF-1的mRNA相对表达量显著低于脂肪来源的成纤维细胞（P〈0.05）;两种不同组织来源成纤维细胞中TGF-β1 mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论真皮与脂肪组织来源的成纤维细胞在与致纤维化相关的细胞形态和功能方面均存在差异。在真皮和脂肪组织受到创伤后的纤维化进程中,两种组织来源的成纤维细胞致纤维化的起点已存在差异。     

诱发癫痫持续状态后基质金属蛋白酶-2在小鼠海马与皮层中的表达

目的：观察氯化锂-匹罗卡品所致癫痫持续状态（status epilepticus,SE）小鼠皮层和海马基质金属蛋白酶-2（matrix met－alloproteinases-2,MMP-2）的表达变化,探讨 MMP-2在癫痫发病机制中的作用。方法：选用成年雄性C57/BL6小鼠 48只,并随机分成实验组和对照组。实验组小鼠腹腔注射氯化锂-皮罗卡品制备SE模型,在确定模型成功后8 h采取动物标本进行检测。使用 RT-PCR测定 MMP-2 mRNA含量变化,Western blot检测 MMP-2蛋白表达变化,免疫组化观察 MMP-2分别在海马与皮层的分布规律与特点。结果：（1）海马组织中,对照组与实验组MMP-2 mRNA的表达分别为 0.155 5±0.018 1和 0.743 1±0.014 4,皮层组织中的表达分别为0.204 9±0.018 5和0.871 6±0.037 0,实验组MMP-2 mRNA的表达均比对照组高,差异有统计学意义（t=-45.60,P=0.000;t=-71.83,P=0.000）。（2）MMP-2蛋白水平的表达,在海马组织中分别为 0.084 5±0.009 6和 0.728 4±0.245 1,在皮层组织中对照组与实验组分别为 0.155 6±0.003 9和0.912 5±0.027 7,实验组MMP-2蛋白的表达均明显高于对照组,差异有统计学意义（t=-76.52,P=0.000;t=-6.99,P=0.000）。（3）免疫组化结果显示,实验组MMP-2在皮层广泛表达,在海马的表达增加主要以 CA1、齿状回、CA3区为主。结论：SE后小鼠海马及皮层内MMP-2在mRNA和蛋白水平的表达均明显升高,表达增加的区域以海马CA1、齿状回及CA3区为主,提示 MMP-2与癫痫的发生、发展可能有着密切的关系。     

5-氮杂-2-脱氧胞苷对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的影响

目的：探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷对人瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的抑制作用及对人瘢痕疙瘩成纤维细胞相关因子的影响。方法：收集人瘢痕疙瘩以及周围正常皮肤标本原代培养成纤维细胞,分为瘢痕疙瘩成纤维细胞5-氮杂-2-脱氧胞苷药物干预组、瘢痕疙瘩成纤维细胞对照组、正常皮肤成纤维细胞5-氮杂-2-脱氧胞苷药物干预组及正常皮肤成纤维细胞对照组4组,用RT-PCR检测各组转化生长因子－β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）mRNA、Smad7mRNA的表达,流式细胞术（flow cytometry,ＦＣＭ）检测各组细胞的周期及凋亡。结果：人瘢痕疙瘩成纤维细胞较正常皮肤成纤维细胞TGF-β1mRNA表达增高（P=0.001）,Smad7mRNA表达降低（P=0.001）,细胞周期停滞于G0/G1期（P=0.035）及细胞凋亡（P=0.006）比例降低;5-氮杂-2-脱氧胞苷干预人瘢痕疙瘩成纤维细胞后,TGF-β1mRNA表达降低（P=0.003）,Smad7mRNA回升（P=0.000）,ＦＣＭ显示瘢痕疙瘩成纤维细胞停滞于G0/G1期比例增加（P=0.000）并且细胞凋亡率增加（P=0.047）,而正常皮肤成纤维细胞组无明显变化（P均>0.05）。结论：甲基化酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷可影响瘢痕疙瘩形成相关因子的表达并且可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖及促进其凋亡,而对正常皮肤的成纤维细胞无明显影响。瘢痕疙瘩的发病可能与相关基因甲基化有关,5-氮杂-2-脱氧胞苷可能成为瘢痕疙瘩治疗的新选择。     

稳定敲低人脐带间充质干细胞EPCR基因对其向成纤维细胞分化能力的影响

目的：构建稳定敲低人内皮细胞蛋白C受体（endothelial cell protein C receptor,EPCR）的人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）,检测敲低EPCR对hUC-MSCs向成纤维细胞分化能力的影响。方法：根据EPCR基因mRNA序列,合成3条小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）导入hUC-MSCs,通过检测EPCR蛋白表达筛选干扰效果最佳的siRNA。根据最佳siRNA序列构建慢病毒载体,包装重组慢病毒,感染hUC-MSCs,Real-time PCR和Western blot验证敲低效率。体外构建转化生长因子-β1（transforming growth factor beta1,TGF-β1）诱导hUC-MSCs向成纤维细胞分化模型,Real-time PCR和Western blot检测诱导前后α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和Ⅰ型胶原（type Ⅰ collagen,Col Ⅰ）表达水平,以反映诱导效果。结果：以EPCR最佳siRNA序列构建EPCR基因RNAi慢病毒载体,成功敲低hUC-MSCs内EPCR的mRNA（t=28.86,P=0.000）和蛋白（t=88.60,P=0.000）表达水平。EPCR敲低后,hUC-MSCs合成的COL1A1和COL1A2在mRNA（P=0.044,P=0.000）和蛋白（P=0.000,P=0.000）水平减少。体外TGF-β1诱导可增加hUC-MSCs内α-SMA（F=369.713,P=0.000;F=451.060,P=0.000）、COL1A1（F=42.051,P=0.000;F=759.041,P=0.000）及COL1A2（F=359.205,P=0.000;F=764.348,P=0.000）在mRNA和蛋白水平的表达,促进其向成纤维细胞分化。但敲低EPCR,α-SMA（P=0.002,P=0.002）、COL1A1（P=0.002,P=0.000）及COL1A2（P=0.000,P=0.000）在mRNA和蛋白的升高水平明显降低。结论：成功获得EPCR稳定敲低的hUC-MSCs,证实敲低EPCR可减少hUC-MSCs内Col Ⅰ表达,并减弱其向成纤维细胞分化的能力。     

人参皂苷Rg1、Rb1及Re对人皮肤胶原代谢作用的研究

目的以人成纤维细胞为载体对三种皂苷Rg1、Rb1、Re进行研究。方法MTT法测定三种药物在不同浓度下对人成纤维细胞增殖的影响,消化法检测羟脯氨酸含量。ELISA法测定细胞分泌I型前胶原、基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1,MMP-1）、基质金属蛋白酶抑制酶-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）的蛋白表达情况,RT—PCR法观察上述三种蛋白的mRNA表达水平。结果与空白组比较,三种单体均能显著提高细胞增殖水平,羟辅氨酸含量、I型前胶原的蛋白质及mRNA表达量,显著降低MMP—1蛋白质及mRNA表达量。结论人参皂苷Rg1、Re、Rb1通过影响成纤维细胞的基因及蛋白质的表达,均显著促进胶原合成、抑制胶原降解,从而提高胶原蛋白总量,改善胶原代谢。     

促肝细胞再生磷酸酶1基因对舌癌细胞侵袭的影响

目的：探讨促肝细胞再生磷酸酶1（phosphatase of regenerating liver cell-1,PRL-1）对舌癌细胞侵袭能力的影响及其可能的机制。方法：应用 siRNA-PRL-1慢病毒载体转染处理舌癌 TCA8113细胞株后,分别采用荧光定量PCR和蛋白质印迹检测PRL-1基因和基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9） mRNA和蛋白水平;采用 Transwell小室模型实验检测癌细胞的侵袭能力。结果：siRNA-PRL-1慢病毒转染组癌细胞PRL-1在RNA（0.425 0±0.010 0）和蛋白（2.720 0±0.110 0）水平明显下调（P=0.000,P=0.000）,同时MMP-2及MMP-9在RNA（0.562 2±0.180 0,0.617 1±0.100 0）及蛋白（0.592 4±0.010 0,0.476 2±0.020 0）表达水平降低（P=0.024,P=0.010,P=0.000,P=0.000）;Transwell实验siRNA-PRL-1慢病毒转染组细胞通过数（64.33±4.04）明显减少（P=0.000）。结论：siRNA-PRL-1转染可抑制舌癌细胞侵袭,其机制可能与PRL-1基因下调MMP-2及MMP-9的表达有关。     

京尼平苷对大鼠前列腺成纤维细胞增殖的影响

【目的】研究京尼平苷对大鼠前列腺成纤维细胞增殖的影响,并探讨其机制。【方法】培养SD大鼠前列腺成纤维细胞,取对数生长期的细胞随机分成4组：对照组、京尼平苷10mg/L、20mg/L和40mg/L组。不同浓度的京尼平苷孵育大鼠前列腺成纤维细胞48h后,采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,ELISA法测定Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原与转化生长因子β1（TGF-β1）蛋白的含量。【结果】与对照组比较,京尼平苷20mg/L和40mg/L可显著抑制大鼠前列腺成纤维细胞的增殖（P〈0.01）,促进其凋亡（P〈0.01）,同时减少TGF-β1的分泌和胶原的合成（P〈0.05或P〈0.01）。【结论】京尼平苷可抑制大鼠前列腺成纤维细胞的增殖,可能与其减少TGF-β1的分泌和胶原的合成、促进前列腺成纤维细胞的凋亡有关。     

人乳头瘤病毒在人大肠癌中检出

用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)法对28例大肠癌(均为分化程度不同的腺癌)及18例相应癌旁组织中人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16和18型DNA分别进行检测。在28例大肠癌组织中分别检测到3例(10.8％)呈HPV16DNA阳性和18例(64.5％)呈HPV18DNA阳性。而相应的18例癌旁组织中仅检测到3例(16.7％)呈HPV18DNA阳性,未检测到HPV16DNA。为了证实扩增产物的特异性,我们用限制性内切酶对PCR产物分别进行了酶切分析,结果与预期的完全相符。本文提示HPV感染可能是大肠癌的发病因素之一。     

赖氨酰氧化酶样基因3在人皮肤成纤维细胞株中的表达

目的研究体外培养的人皮肤成纤维细胞株中赖氨酰氧化酶样基因3（lysyloxidase-likegene3,LOXL3）的表达模式。方法提取不同生长阶段的人皮肤成纤维细胞株的不同组分,用NorthernBlot和WesternBlot分别从mRNA和蛋白水平分析LOXL3表达,并以免疫荧光方法观察LOXL3的分布部位。结果 LOXL3mR-NA和蛋白含量在细胞汇合前低于细胞汇合期,汇合后最高,且LOXL3分布在整个细胞浆和细胞核。结论 LOXL3的表达量在细胞生长的不同阶段有所不同,可能与其功能有关。     

人皮肤真皮在增生性瘢痕形成中作用的实验研究

目的验证人皮肤真皮层在增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)形成中的决定作用,探讨HS的发病机制.方法在裸鼠背部体表分别移植人的全厚皮片、刃厚皮片和中厚皮片,以及大鼠的全厚皮片,观察皮片干痂脱落后局部瘢痕增生的大体情况及组织学变化.结果只有移植人的全厚皮片才会发生明显的瘢痕增生,而移植人的刃厚皮片以及大鼠的全厚皮片则根本不发生瘢痕增生,移植人中厚皮片虽然部分可以发生一定程度的瘢痕增生,但增生程度及发生率均明显不如移植人的全厚皮片.结论人皮肤内在的因素是HS发生的决定因素,这种决定因素存在于人皮肤的真皮层.     

重组人内皮抑素诱导人脐带静脉血管内皮细胞凋亡

目的观察人内皮抑素重组蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞增殖的影响。方法采用细胞凋亡的荧光检测法检测对内皮细胞凋亡的影响。MTT法观察不同浓度的重组人内皮抑素对人脐带静脉血管内皮细胞（ECV304）增殖的抑制作用。结果重组人内皮抑素具有明显的抑制内皮细胞增殖的作用，ED50=550ng／ml，随重组蛋白浓度的增加抑制作用更为明显。结论重组人内皮抑素对细胞增殖的抑制与其浓度呈正相关，存在剂量效应关系；内皮抑素抗血管生成的机制与其抑制内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡有关。     

人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养

目的: 培养纯度较高的人绒毛膜滋养层细胞, 为胎盘绒毛在妊娠期间的作用及其机制研究提供细胞学基础.方法: 胰蛋白酶-DNase消化法培养人绒毛膜滋养层细胞,间接免疫染色进行细胞纯度检测,透射电镜观察细胞内部结构.结果: 倒置显微镜下,可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长.细胞角蛋白染色阳性,波型蛋白染色阴性,表明不含污染细胞.透射电镜观察示所获细胞有典型滋养层细胞结构.结论: 该法简便易行,可获得合乎试验要求的人绒毛膜滋养层细胞.     

基于人胚胎干细胞健康安全评价体系的构建

食品、药品、医疗器械和材料、生物制剂以及环境的质量和健康安全是政府和民众十分关注的热点问题。目前国际标准的健康安全评价检测方法以微生物、动物及其细胞作为载体,不能准确反映人类的生物学特征,预测人体心、肝等靶器官毒性及发育毒性的准确率偏低,在技术层面严重制约了人类健康安全的评价和监控。如何建立准确反映人类生物学特征的健康安全评价体系是关系国民健康安全的重大科学问题［1］。 人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）可真实反映人类生物学特征,并利用其无限增殖和定向分化的特点,可达到检测载体的高度标准化,hESCs技术的发展为体外健康安全评价体系的升级提供了有力支持。 由北京大学牵头,联合浙江大学、中国医学科学院整形外科医院和军事医学科学院,与新加坡国立大学合作,我们完成了科技部国际科技合作一期项目“基于人胚胎干细胞健康安全评价新载体的构建”,并就相关研究成果作为科研工作综述进行发表［2］。在此基础上,合作团队顺利完成了二期项目“创建人胚胎干细胞健康安全预测新体系”,取得了系列成果,现综述如下。