大鼠下颌下腺内ncNOS及NT-3的表达

目的对大鼠下颌下腺内神经型一氧化氮合酶(ncNOS)及神经营养因子(NT-3)进行定性和定位研究.方法取10只SD大鼠下颌下腺,进行HE染色和免疫组织化学染色.结果大鼠下颌下腺颗粒曲管、纹状管及小叶间导管上皮细胞呈ncNOS及NT-3免疫反应阳性,而腺泡细胞则为阴性.结论大鼠下颌下腺导管上皮中有ncNOS及NT-3的表达,提示下颌下腺具有复杂的分泌功能.     

成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离?培养及鉴定

目的:建立成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养及鉴定的方法.方法:V型胶原酶溶液灌注消化成年大鼠胰腺组织,并经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,而后加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)继续培养,7天可形成单层细胞,用0.25%胰酶-EDTA消化并传代培养.取第2代细胞利用免疫荧光染色和RT-PCR方法检测CK19、Pdx-1、Nestin、insulin及glucagon的表达.结果:经胶原酶灌注消化胰腺导管上皮,再经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,可使胰腺导管细胞得到较好的纯化.免疫荧光结果示:胰腺导管细胞CK19、Pdx-1和Nestin染色呈阳性,阳性细胞率分别为(88.6±6.2)%、(84.6±8.6)%和(79.3±10.5)%,而insulin及glucagon染色为阴性.RT-PCR结果显示该细胞表达CK19、Pdx-1和Nestin基因.结论:该方法可较好的分离出胰腺导管细胞.经鉴定该法培养所获细胞具有胰腺干细胞的特性.     

组织块法培养大鼠颌下腺细胞的实验研究

目的 探讨组织块法培养大鼠颌下腺细胞(RSGC)的方法与细胞生长的特点.方法 采用组织块法培养RSGC,使用酶消化法和差速贴壁法进行细胞纯化,免疫组织化学SABC方法进行细胞角蛋白-8免疫组化染色,进行细胞来源鉴定.倒置显微镜下进行形态学观察,取第2代RSGC,FDA-PI双色荧光法检测细胞活力,MTT法绘制生长曲线.结果 细胞角蛋白-8染色阳性.倒置显微镜下,细胞主要呈3种形态,为圆形亮细胞、多角形暗细胞、梭形暗细胞.细胞活力＞95%,生长曲线表示细胞5 d开始进入对数生长期.结论 此方法简便,易操作,获得了大量的RSGC,为颌下腺细胞作为种子细胞的颌下腺组织工程研究提供了实验基础和理论依据.     

水浸束缚应激对大鼠下颌下腺内瘦素表达的影响

目的:观察应激状态下大鼠颌下腺内瘦素表达的变化,探讨应激反应对颌下腺瘦素分泌的影响及其意义.方法:采用水浸束缚应激(WRS)方法,将20只SD大鼠随机均分为WRS组(n=10)和对照组(n=10),用免疫组织化学方法观察大鼠颌下腺内瘦素的定位与分布;用ELISA法检测两组大鼠血清和颌下腺组织中瘦素水平.结果:瘦素免疫反应阳性细胞主要定位于颌下腺导管的颗粒曲管和纹状管,腺泡细胞为阴性,其中颗粒曲管上皮细胞呈强阳性反应. WRS组大鼠颌下腺导管上皮细胞瘦素免疫反应细胞的染色强度高于对照组. 与对照组相比,WRS组大鼠血清和颌下腺中瘦素水平均显著升高(P＜0.01).结论:瘦素表达于大鼠颌下腺导管上皮细胞;水浸束缚应激可致大鼠血清和颌下腺中瘦素浓度增加,颌下腺内瘦素可能参与应激反应过程的调节.     

大鼠胰岛的分离和纯化

目的 探讨获得足够数量和较高纯度大鼠胰岛的分离和纯化方法.方法 采用V型胶原酶灌注消化法分离成年大鼠胰岛,Ficoll 400非连续密度梯度法纯化胰岛.双硫腙(DTZ)染色鉴定培养的胰岛细胞,锥虫蓝染色检测细胞活性.葡萄糖刺激胰岛素释放试验评价胰岛细胞的功能.结果 分离纯化后大鼠胰岛平均收获量为(480±30)IEQ,纯度大于90%,活性大于90%.在低糖和高糖刺激下,胰岛素分泌量分别为(12.28±0.89)mIU/L、(19.01±1.49)mlU/L,二者相比较.差异有统计学意义(P<0.05),刺激指数为(1.55±0.01).结论 胶原酶V逆行灌注消化胰腺和Ficoll400非连续密度梯度纯化法,可获得高纯度高活率的大鼠胰岛.     

下颌下腺内NT-3的表达及意义

目的　对成人及大鼠下颌下腺内NT 3的定性、定位及生物学意义进行研究。方法　采用HE和免疫组织化学SABC染色方法。结果　成人下颌下腺导管上皮细胞呈NT 3免疫反应阳性 ,其中以纹状管最为明显。大鼠下颌下腺颗粒曲管、纹状管及小叶间导管上皮细胞呈NT 3免疫反应阳性。两者的导管上皮细胞核和腺泡细胞均为阴性。结论　成人及大鼠下颌下腺中有NT 3的表达 ,提示NT 3可能参与了下颌下腺复杂的分泌功能     

人睾丸精原细胞的分离和纯化

目的探讨人睾丸精原细胞的分离纯化.方法用联合二步酶消化法获得人生殖细胞悬液,经Percoll不连续密度梯度离心,再用差异粘附法纯化得到成活率较好、含量较高的人精原细胞.结果所获得睾丸组织细胞悬液内活细胞、死细胞平均所占百分比分别为89.71%、10.29%.Percoll不连续密度梯度中,细胞主要在相邻梯度的界面处形成细胞带,其中精原细胞主要分布于27%～35%Percoll梯度间,根据细胞体外培养时的形态学特征等进行判断和分析,经纯化后精原细胞的纯度达到60.42%.结论应用联合酶消化法、Percoll不连续密度梯度离心和差异粘附等方法可以有效地对人精原细胞进行分离和纯化.     

推进式离心管结合单密度梯度法快速纯化大鼠胰岛

目的 探索用简化的单一密度梯度法建立快速纯化大鼠胰岛细胞的方法.方法 用胶原酶P消化分离SD大鼠胰腺,采用自制的推进式离心管以及单一密度(1.090 g/cm3)的HCA-Ficoll-400密度梯度液来纯化大鼠胰岛细胞.通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能.结果 纯化后平均每条SD大鼠胰腺可获得(731±89)个胰岛细胞当量(IEQ),平均纯度为(73.2±9.4)%.平均活率为(92.8±2.4)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的3.54±O.79倍(P＜o.001).结论 为各种胰岛细胞的实验研究建立了快速分离纯化胰岛细胞的方法,纯化的胰岛细胞功能良好.     

大鼠胰岛细胞的分离纯化及培养

目的　探讨大鼠胰岛细胞分离纯化和培养的方法。方法　采用胰导管逆行灌注Hanks液分离成年大鼠胰岛,Ⅴ型胶原酶消化,不连续密度梯度Ficoll 4 0 0纯化胰岛。用台盼蓝和双硫腙染色检测胰岛活性和纯度,葡萄糖刺激胰岛素释放试验检测胰岛功能。结果　胰岛细胞的收获量为5 4 0±15 0个胰岛 胰腺,活性>90 % ,纯度>90 % ,高糖刺激后胰岛素释放量为低糖刺激的2倍多。结论　胰导管灌注Hanks液,Ⅴ型胶原酶消化和不连续密度梯度葡聚糖纯化胰岛,可以获取数量多,活性和纯度好的胰岛     

大鼠颌下腺细胞培养方法建立及生物学特性研究

目的:建立大鼠颌下腺细胞体外培养的方法,为涎腺细胞的体外扩增及基因治疗涎腺疾病奠定基础。方法:无菌条件下取1日龄Wistar大鼠颌下腺,经LB3、胰酶联合消化后原代细胞接种于含2%胎牛血清、表皮生长因子、胰岛素等的DMEM/F12培养液,相差显微镜观察原代及传代细胞的形态特征,免疫组织化学染色鉴定细胞来源,PAS染色观察体外培养第2代细胞合成、分泌多糖功能。结果:体外培养的大鼠颌下腺原代细胞为圆形、三角形、多边形。细胞传至第2代生长良好,形态未发生改变。体外培养的第2代细胞角蛋白、E-钙联蛋白免疫组织化学染色、PAS染色均为阳性,表明细胞为上皮来源且具有合成、分泌多糖类物质的功能。结论:酶联合消化法成功地分离、体外培养了大鼠颌下腺细胞,第2代细胞仍可保持腺细胞的生物学特征。     

缺血性心脏病患者外周血中内皮祖细胞数量和功能的变化

目的:观察缺血性心脏病(ischemic heart disease, IHD)患者外周血中内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)数量及功能的变化.方法:IHD患者和对照者各23例,用密度梯度离心法从外周血中分离单个核细胞,用流式细胞仪测量外周血中CD 细胞以鉴定EPCs.分别观察EPCs的粘附能力、迁移能力和体外生成血管能力.结果:IHD患者外周血中EPCs数量明显低于对照组,其粘附能力、迁移能力和体外生成血管能力也明显受损.结论:IHD患者外周血中EPCs数量降低且功能减退.     

小鼠肝脏细胞质膜蛋白质组的提取和二维液相色谱分离

目的 提取小鼠肝脏细胞质膜蛋白并建立一种利用二维液相色谱法分离细胞质膜蛋白质组的方法.方法 采用差速离心结合蔗糖密度梯度离心分离和富集分小鼠肝脏细胞质膜蛋白,样品经脱盐及用起始缓冲液置换后,进行一维色谱聚焦分离,然后收集pH 8.5～4.0之间的组分进行二维反相高效液相色谱分离,最后将获得的二维UV图通过ProteoVue软件转换成UV/pI图谱.结果 成功提取了肝脏细胞质膜蛋白,并通过二维液相色谱成功建立了小鼠肝脏细胞质膜蛋白的二维UV/pI图谱,收集了一维色谱聚焦分离的pH 8.5～4.0区间的16个组分,并将每个组分分进行二维色谱分离后转换为UV/pI图谱.结论 为进一步全面研究小鼠肝脏细胞质膜蛋白功能和疾病差异蛋白质组研究打下了基础.     

VEGF,b-FGF诱导的人外周血单个核细胞向血管内皮祖细胞分化的研究

目的:研究在VEGF, b-FGF诱导下人外周血单个核细胞向血管内皮祖细胞(EPCs)分化的方法. 方法: 采集健康志愿者外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在加有VEGF, bFGF的M199培养基中培养,培养第7 d,免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达. 结果: 人外周血单个核细胞(MNCs)经体外VEGF, b-FGF的诱导分化,表达EPCs的表面标志KDR, CD133和CD34. 结论: 外周血来源的MNCs能在一定的培养条件下可以诱导分化为EPCs.     

c-kit在血液病中的表达

目的 :探讨原癌基因c -kit在血液病中表达的情况。方法 :用Ficoll分离液分离 ,收集骨髓单个核细胞。c -kit的表达采用RT -PCR法。结果 :在不同血液病中c -kit的表达情况不一 ,在急性髓细胞性白血病 (AML)为 5 7.8% ,急性淋巴细胞性白血病 (ALL)为 8.3 % ,骨髓增生异常综合征 (MDS)为 40 %。结论 :c -kit主要在AML中表达 ,提示c -kit表达是粒细胞的一个特异性标志。     

胎儿生长受限孕妇外周血及新生儿脐血中内皮祖细胞数量与功能的变化

目的:观察胎儿生长受限(FGR)孕妇外周血及新生儿脐血中内皮祖细胞(EPCs)数量与功能的变化.方法:选择FGR孕妇及新生儿15例和对照组健康孕妇及新生儿15例,密度梯度离心法收集外周血及脐血中单个核细胞(MNCs),接种在人纤维连接蛋白包被的培养板,诱导分化培养9 d后收集贴壁细胞进行细胞化学分析.激光共聚焦显微镜下...     

VEGF,b-FGF诱导人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞分化的研究

目的:研究VEGF, b-FGF诱导下人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞(EPCs)分化.方法:从新鲜脐血中用Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在加有VEGF,bFGF的M199培养基中培养,培养7 d,免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达.结果:人脐血血单个核细胞(MNCs)经体外VEGF, b-FGF的诱导分化,表达内皮祖细胞的表面标志KDR, CD1133和CD34.结论:人脐血单个核细胞在一定的培养条件下可诱导分化为内皮祖细胞.     

弓形虫速殖子和包囊的分离纯化

采用植物血凝素P(PHAP)亲和凝集分离法自小鼠腹腔液内分离弓形虫速殖子,纯度达99.5％,收获率为73.2％。与胰蛋白酶消化法相比,前法对虫体无损伤。此外,应用淋巴细胞分离介质Ficoll-Paque密度梯度离心法自鼠脑组织内分离出较纯净的包囊。     

兔外周血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

目的研究兔外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPCs）的分离、培养方法,并鉴定其功能。方法从兔耳中央动脉采集兔外周血30ml,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,接种于人纤维连接蛋白包被的培养板上,分别予含20％胎牛血清低糖的DMEM培养基诱导培养,培养2周后通过免疫荧光、免疫组化、体外血管成形实验鉴定内皮祖细胞。结果兔外周血单个核细胞体外培养可成功获得内皮祖细胞,稳定表达内皮祖细胞相关抗原,并能在matrigel凝胶上形成稳定的血管腔样结构。结论兔外周血单个核细胞采用密度梯度离心及一定的培养条件能成功诱导、分化为内皮祖细胞。     

Persantine improves acute pancreatitis in vitro

Persantine combined with TNF-a enhances antiproliferative activity in human tumor cells. We hypothesized that the vasodilator persantine would ameliorate acute pancreatitis (AP) in vitro. Rat pancreatic ductal cells were cultured using standard techniques. Acute pancreatitis was induced by adding cerulein (10(-9) M) or TNF-a (200 ng/ml). AP was verified by increased amylase production. Persantine was added at concentrations from 0.1 uM to 100 uM post cerulein or TNF-a treatment. Statistical analysis was achieved by ANOVA. Amylase production was significantly increased (p < 0.05) compared with control upon stimulation with either cerulein or TNF-a. When persantine was added in graded concentrations from 0.1 uM to 100 uM to cerulein treated cells, it decreased amylase production significantly (p < 0.05) at 100 uM. However, when persantine was added to TNF-a treated cells, it decreased amylase production (p < 0.05) at the lower concentrations of 0.1 uM and 1 uM. We have shown for the first time that AP, resulting from either mild (cerulein) or severe (TNF-a) stimulation, is significantly improved by treatment with persantine.     

高浓度软脂酸体外抑制人外周血内皮祖细胞的增殖

目的 观察软脂酸对体外培养的人外周血内皮祖细胞(EPCs)增殖的影响.方法 采用密度梯度离心法分离培养人外周血单个核细胞,经FITC标记荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)双染色鉴定为正在分化的EPCs,并进一步通过流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD133和VEGFR2.分别以不同浓度(0、50、100、200、400、800 μmol/L)软脂酸溶液作用48 h,以及400μmol/L软脂酸溶液作用不同时间(0、12、24、36、48和60 h)后,CCK-8法观察EPCs增殖的情况.结果 与对照组比较,400 μmol/L组及800 μmol/L软脂酸组均抑制了EPCs的增殖功能(P<0.05),在400μmol/L时最为显著;且400μmol/L软脂酸对EPCs增殖抑制作用随时问延长逐渐增强.48 h达到高峰(增殖抑制率为58.59%(P<0.05).结论 高浓度软脂酸体外能显著抑制外周血内皮祖细胞的增殖.