重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性

目的探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素(IL2-PE664Glu)融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法采用该所发明的新方法提纯包涵体,包涵体复性后,样品经DEAE-SepharoseFF离子交换层析,获得融合蛋白纯品。结果获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95%,复性回收率为80%。结论此包涵体分离纯化技术简便、实用,可为中试研究和规模化生产提供基础。     

免疫毒素IL-2-PE66抑制小鼠角膜移植免疫排斥反应的研究

目的 观察新型免疫抑制毒素白细胞介素-2-绿脓杆菌外毒素(interleukin-2-pseudomonas exotoxin66,IL-2-PE66)对小鼠角膜移植排斥反应的免疫抑制疗效.方法 建立小鼠同种异体穿透性角膜移植模型.36只鼠随机分为IL-2-PE66治疗组及生理盐水对照组,临床观察两组角膜植片免疫排斥反应发生的时间和程度,并在术前及术后第10、15、25、35天分别取出鼠眼行组织病理学检查,同时收集外周血行T淋巴细胞亚群及T淋巴细胞集落形成数分析.结果 治疗组与对照组植片存活时间分别为(31.2±2.9)d和(15.8±2.1)d,术后第15天治疗组与对照组T淋巴细胞亚群CD_4~+/CD_8~+比率分别为(1.26±0.23)和(2.01±0.23),T淋巴细胞集落形成数分别为(201±18.2)和(286±16.8). 结论 IL-2-PE66可推迟角膜移植排斥反应的发生时间;有明显减少外周血中辅助T淋巴细胞百分率的作用;并能减弱小鼠外周血T淋巴细胞集落形成能力.提示IL-2-PE66是一种高特异性的免疫抑制剂.

Abstract：

Objective To study the immunosuppressive effect of the interleukin-2-pseudomonas exotoxin 66(IL-2-PE66) on murine corneal allograft rejection. Methods Thirty-six recipient female BALB/c mice received corneal allografts from C57BL/6 mice and were divided randomly into treatment and control groups. The condition of the grafts was observed twice a week. On days 10, 15, 25 and 35 after the transplantation, the operated eyes were removed for pathological examinations. Peripheral blood samples were also collected for analysis of T cell subsets and T lymphocyte colony forming unit (T-CFU) assay. Results The survival time of corneal allograft averaged 15.8±2.1 days in the control group and 31.2±2.9 days in the treatment group. The CD_4~+/CD_4~+ of the T cell subsets 15 days after the operation was 1.26±0.23 in the treatment group and 2.01 ±0.23 in the control group, with T-CFU of 201 ±18.2 and 286+16.8, respectively. Conclusion IL-2-PE66 can delay the development of comeal graft rejection, significantly reduce the percentage of T helper cells, and weaken the aggregation of the peripheral T cells.     

构建靶向杀伤白血病细胞的新型重组白细胞介素6D24-PE40KDEL融合蛋白

目的　构建能高度特异地靶向杀伤高表达白细胞介素 6受体 (IL 6R)白血病细胞的新型重组IL6 PE4 0KDEL(绿脓杆菌外毒素 )融合蛋白。方法　通过定点诱变将绿脓杆菌外毒素PE4 0基因羧基端最后 5个氨基酸REDLK替换成内质网蛋白滞留序列 (KDEL) ,采用重叠延伸的基因融合技术将N 末端缺失 2 4个氨基酸的人IL6 (IL6D2 4 )cDNA与PE4 0KDEL基因进行重组融合构建 ,利用HB10 1/pBV2 2 0表达系统实现该新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 ,经MonoQ柱层析纯化后 ,以四甲基偶氮唑类似物 (MTS)法检测IL6D2 4 PE4 0KDEL的靶向杀伤活性。结果　构建的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白在大肠杆菌中的表达水平达到 4 0 %左右 ;经包涵体分离、复性、变性及纯化所得该融合蛋白纯度 >95 % ;纯化的融合蛋白能与IL6抗体及绿脓杆菌外毒素A(PEA)抗体发生特异性结合 ;IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白能高度特异地选择性杀伤高表达IL6R的U937细胞 ,IC5 0约为 2 5 0ng/ml,而对不表达IL6R的人T淋巴白血病细胞系则无杀伤作用。结论　成功构建了具有靶向杀伤高表达IL6R白血病细胞的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白 ,为深入地探索利用IL6 /IL6R系统介导靶向治疗高表达IL6R白血病奠定了坚实的基础。     

重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究

目的研究重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条件。方法常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得融合蛋白。结果获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。     

重组 CARDs TX 融合蛋白的表达纯化与复性

目的:构建 pET28α-CARDs TX 重组质粒,诱导 CARDs TX 融合蛋白表达,并对其进行纯化与复性研究。方法:将 CARDs TX 基因（MPN 372）克隆入 pET28α 载体,经 8 次点突变获得 pET28α-CARDs TX 重组质粒。转化大肠杆菌 BL21,IPTG 诱导表达。利用亲和层析技术纯化蛋白并通过 SDS-PAGE 和 Wetern Blot 检测 CARDs TX 的表达和纯化效果。利用尿素梯度复性法和扩大体积透析法对蛋白进行复性研究。结果:酶切和测序结果证明 pET28α-CARDs TX 重组质粒的 DNA 序列完全正确,在 BL21 中 CARDs TX 融合蛋白可高效表达,并可获得高纯度目的蛋白。利用扩大体积透析法对目的蛋白复性有较好的效果。 结论:成功构建出 pET28α-CARDs TX 重组质粒,且 CARDs TX 可在大肠杆菌中高效表达,并可获得高纯度的目的蛋白,为深入研究 CARDs TX 的生物学特性奠定了基础。     

从基因重组大肠杆菌分离纯化重组人白介秦－2

从ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＭ５２４８（Ｂｉｏ２７５ｃＩ８５７ＨＩ）中，经发酵培养，离心，超声破碎，溶解，二次凝胶过滤层析，复性处理及冷冻干燥，一次获得了３６ｍｇ较高纯度的重组人白介素－２。     

IL-2-PE66~(4Glu)融合蛋白生物学活性测定

ＩＬ－２－ＰＥ６６４Ｇｌｕ是由白介素２同改构的绿脓杆菌外毒素通过基因融合构成的嵌合蛋白。我们研究了它对ＣｏｎＡ诱导的小鼠脾母细胞和ＰＨＡ激活的人外周血淋巴细胞的细胞毒活性，结果显示其半数抑制剂量（ＬＤ５０）分别是５０ｎｇ／ｍｌ和２０ｎｇ／ｍｌ，而对ＩＬ－２Ｒ细胞则无明显的作用；同时，探讨了ＩＬ－２的浓度、ＭＴＴ浓度及作用时间对实验结果的影响     

IL6(23)-PE40重组毒素的表达和对肿瘤细胞的杀伤效果

目的: 以IL-6作为导向载体,PE40作为杀伤毒素,构建重组毒素对肿瘤细胞具有特异的杀伤功能. 方法: 通过构建IL6(23)-PE40重组毒素质粒,经大肠杆菌高效表达,纯化表达产物,进行细胞的毒性试验. 结果: 表达产物具有杀伤骨髓瘤细胞、急性髓样白血病细胞,胃癌细胞,肝癌细胞和喉癌细胞的毒性,当重组毒素浓度为0.6 μg *L-1时可杀伤50%的SP2/0细胞,而对其他细胞无毒性. 结论: 表达的重组毒素可特异杀伤骨髓瘤细胞等5种肿瘤细胞,而对试验中其他5种肿瘤细胞及5种正常细胞无杀伤作用.     

HSA/IL1ra融合蛋白的纯化及生物学活性研究

目的:纯化HSA/IL1ra融合蛋白并对其生物学活性进行检测.方法:采用亲和层析及离子交换层析分离纯化HSA/IL1ra融合蛋白,检测其对IL1引起的对A375 S2的杀伤保护作用.结果:获得的HSA/IL1ra融合蛋白HPLC纯度在98%以上,并且具有与天然IL1ra相似的、对IL1杀伤A375 S2细胞的保护作用.结论:获得高纯度的HSA/IL1ra融合蛋白并且具有相应的生物学活性.     

应用重组腺病毒载体制备人CTLA4Ig融合蛋白

目的在实验室水平制备并鉴定人CTLA4Ig融合蛋白.方法将人CTLA4Ig cDNA片段构入重组腺病毒载体中,用该表达载体感染293细胞并在其中表达人CTLA4Ig,再应用SPA亲合层析柱自细胞培养上清中纯化出该融合蛋白,以WESTERN印迹验证后,观察了所制备CTLA4Ig对混合淋巴细胞反应的影响.结果经亲合层析柱洗下的蛋白为分子量为53.0kd的单一组分,经WESTERN印迹证实为CTLA4Ig,并发现所制备CTLA4Ig能呈剂量依赖性抑制混合淋巴细胞反应.结论本法成功制备了具有生物学活性的重组人CTLA4Ig融合蛋白.     

融合蛋白EGF-TCS的纯化及体外靶向杀伤肿瘤细胞的研究

目的 在大肠杆菌中表达并纯化EGF-TCS融合蛋白,观察该融合蛋白对肿瘤细胞的靶向选择性杀伤作用.方法 将重组表达质粒PQE30/EGF-TCS转化至大肠杆菌M15中,表达该融合蛋白(EGF-TCS).产物经Ni-NTA Agrose亲和层析柱纯化;用流式细胞仪检测肿瘤细胞株和正常肝LO2细胞株的EGFR表达量;进行细胞杀伤实验,验证EGF-TCS的选择性杀伤能力;用流式细胞仪检测细胞凋亡的方法进一步考察EGF-TCS的靶向选择性杀伤能力,并用电镜观察细胞形态.结果 重组表达质粒PQE30/EGF-TCS在大肠杆菌M15中获得稳定、高效的融合表达,表达上清柱纯化纯度达95%以上;肝癌BEL-7402细胞表面EGFR表达量最高(72.33%),正常肝LO2细胞表面EGFR表达量最低(5.51%),重组的融合蛋白对肿瘤细胞具有较大的杀伤能力(BEL-7402、MCF-7和BGC-823的IC50分别为11.40、22.47、12.53 μg/ml),对正常细胞的杀伤能力微弱(IC50为53.19 μg/ml).结论 应用基因工程技术,成功构建了融合蛋白EGF-TCS,该融合蛋白可明显促进肿瘤细胞的凋亡.     

人血清白蛋白与促红细胞生成素融合蛋白的构建及表达

目的 构建重组人血清白蛋白促红细胞生成素融合蛋白(HAS-EPO)表达载体,用CHO细胞表达该重组蛋白.方法 PCR扩增出人血清白蛋白基因(HAS)和促红细胞生成素基因(EPO);合成编码多肽GS (GGGGS)3的DNA片段作为接头(Linker),采用重叠PCR的方法将Linker与EPO基因拼接成LEPO基因.H...     

SA/hIL-15融合蛋白的制备及生物学活性鉴定

目的 制备链亲和素(SA)/人白细胞介素-15 (hIL-15)融合蛋白SA-hIL15和hIL-15-SA,并鉴定其生物学活性.方法 构建原核表达质粒pET24a-6His-SA-hIL-15和pET32a-hIL-15-SA-6His,转化大肠杆菌BL21(DE3),用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,并对其进行复性.CCK-8检测融合蛋白PHA刺激的人外周血淋巴细胞增殖的活性,流式细胞仪分析融合蛋白对生物素化的B16.F10细胞锚定修饰率.结果 成功构建了两种重组融合蛋白的表达质粒并在大肠杆菌实现了高效表达,目标蛋白的表达约占细菌总蛋白的20%.经纯化、复性的SA/hIL-15融合蛋白具有双重活性,即:能促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖的hIL-15活性,和SA介导的高效结合至表面已生物素化的B16.F10肿瘤细胞的功能(表面锚定修饰效率大于95%).SA-hIL-15双功能融合蛋白促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖活性高于hIL-15-SA双功能融合蛋白.结论 SA/hIL-15双功能融合蛋白的制备为hIL-15表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制打下了基础.     

幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白包涵体的纯化及活性鉴定

目的：建立一种有效的纯化幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位-尿素酶B亚单位(HspA-UreB)融合蛋白包涵体的方法。 方法：基因工程重组大肠杆菌BL21(pET-HU27)诱导表达的HspA-UreB融合蛋白包涵体经洗涤、变性、复性,在A¨KTA FPLC上运用HiTrap Chelating HP分离纯化,用SDS-PAGE和Bradford法检测目的蛋白的纯度和含量,用Western blotting对纯化后蛋白进行免疫学活性鉴定。 结果：纯化后HspA-UreB融合蛋白的纯度＞90%,含量达0.25 g•L^-1,并可以被HspA-UreB融合蛋白免疫小鼠血清识别。 结论：成功地建立了从包涵体中纯化高纯度HspA-UreB融合蛋白的方法。     

幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白可溶性表达产物的纯化及活性鉴定

目的 :建立一种有效的纯化幽门螺杆菌HspA UreB融合蛋白可溶性表达产物的方法。方法 :基因工程重组大肠杆菌BL2 1(pET HU2 7)诱导表达产物 ,超声破碎后收集上清 ,上清经盐析初步纯化后 ,在 ¨AKTAFPLC上运用HiTrapChelatingHP分离纯化 ,用SDS PAGE和Bradford法检测目的蛋白的纯度和含量 ,用West ern blot对纯化后蛋白进行免疫学活性鉴定。结果 :纯化后HspA UreB融合蛋白的纯度 >90 % ,含量达 0 15mg/ml,并可以被免疫小鼠血清识别。结论 :建立了从BL2 1(pET HU2 7)可溶性表达产物中纯化高纯度HspA UreB融合蛋白的方法 ,为进一步的动物实验研究奠定了基础。     

非融合型重组人白细胞介素-18的纯化及鉴定

目的　获得高纯度的重组人白细胞介素 18(rhIL 18)。方法　采用溶菌酶加超声破菌的方法抽提包涵体 ,以8mol/L尿素溶解包涵体 ,变性条件下以阴离子柱层析进行首步纯化 ,复性后再进行凝胶过滤层析。对纯化的样品进行了SDS PAGE、HPLC、N端氨基酸序列、免疫印迹及生物学活性分析。结果　rhIL 18在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在 ,所提取的包涵体中重组蛋白纯度可达到 80 %以上 ,包涵体经二步柱层析纯化后 ,HPLC分析纯度达 98%以上 ,SDS PAGE测定其分子质量约 19× 10 3 ,N端 15个氨基酸序列与预期一致 ,生物学活性分析证实纯化的rhIL 18具有诱导人外周血单个核细胞 (PBMC)产生IFN γ的能力。结论　所建立的纯化rhIL 18的方法简便有效 ,为开展rhIL 18的结构活性关系研究及其大规模纯化打下了良好的基础。     

重组人胶原绑定骨形态发生蛋白2在大肠杆菌中的表达、纯化与复性

目的: 利用大肠杆菌表达体系制备带有胶原结合结构域(CBD)的骨形态发生蛋白2(BMP2),研究CBD-BMP2表达、纯化及复性的条件和方法。方法: 将具有胶原结合能力的CBD基因序列克隆入BMP2基因序列的N端,构建重组蛋白表达质粒pet21b/CBD-BMP2,转化入工程性大肠杆菌BL21菌株内;37℃条件下添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)持续诱导表达;采用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化;运用超纯水稀释复性法对纯化后的CBD-BMP2进行复性;0.22 μm微孔滤膜对复性后蛋白除菌,通过除菌前后蛋白浓度比值计算回收率;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白表达、纯化以及复性;BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。结果: 重组质粒pet21b/CBD-BMP2在工程性大肠杆菌中得到充分表达;CBD-BMP2以包涵体形式表达;SDS-PAGE分析,8 mol·L^-1尿素存在条件下目的蛋白溶解于裂解液上清中,经纯化后目的蛋白单体存在于洗脱液B中,单体相对分子质量约为14000;稀释复性后SDS-PAGE分析,相对分子质量14000及28000处可见2条清晰条带,重组蛋白单链成功复性为二聚体结构,相对分子质量约为28000;过滤除菌前后目的蛋白浓度分别为110和80 mg·L^-1,回收率约为73%。结论: 重组CBD-BMP2载体成功转化至大肠杆菌内,CBD-BMP2蛋白得到了高效的表达和复性。建立了利用原核表达体系制备重组CBD-BMP2蛋白的实验方法。     

SA/hIL21双功能融合蛋白的表达、纯化及生物学活性检测

目的 制备链亲和素(SA)标记的人白细胞介素21融合蛋白(SA-hIL-21),检测其生物学活性.方法 构建hIL21-SA-pET21及pET24a-SA-hIL21质粒,利用大肠杆菌BL21(DE3)表达两种双功能融合蛋白,并利用镍金属螯合层析柱(Ni-NTA)纯化,之后透析复性,Western blotting进行鉴定,最后利用MTT法检测hIL21-SA及SA-hIL21融合蛋白与抗CD3单克隆抗体(anti-CD3)共刺激人外周血淋巴细胞的增殖活性,流式细胞仪分析两种融合蛋白对生物素化的MB49肿瘤细胞的锚定修饰效率.结果 hIL21-SA及SA-hIL21重组融合蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,约占菌体蛋白的30%,经复性后hIL21-SA及SA-hlL21具有了双重活性,即不仅可以与抗CD3单抗共刺激淋巴细胞的增殖,而且具有了SA介导的高效结合已生物素化的MB49肿瘤细胞表面的功能(表面修饰效率95.18%,96.91%).结论 本实验成功研制了具有双重活性的hIL21-SA及SA-hlL21融合蛋白,两种融合蛋白的双功能活性无显著性差异,该项研究为SA/hIL21双功能融合蛋白应用于肿瘤疫苗以及肿瘤局部治疗奠定了基础.     

重组人bFGF蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

【目的】构建人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因的原核表达载体,并对其进行诱导表达和蛋白质纯化,以获得大量重组人bFGF蛋白。【方法】人工合成bFGF基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pET22b中,转化感受态细胞大肠杆菌RPX,经IPTG诱导表达重组bFGF蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blotting检测分析。【结果】成功构建了人重组bFGF表达质粒pET22b-rhbFGF,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,分子量约在18×103Da处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的28%,纯化后的蛋白质灰度扫描检测,纯度为95%。【结论】成功构建了重组人bFGF原核表达载体,并成功纯化了该基因的原核表达产物,为下一步人bFGF的产业化打下了基础。