雪旺氏细胞体外培养方法研究

为在短时期内培养大量的雪旺氏细胞，本文对目前常用的两种培养方法进行了比较。方法：采用植块反复种植法和酶消化法分别进行雪旺氏细胞的体外培养。结果表明两种方法都能得到雪旺氏细胞。但酶消化法所培养的雪旺氏细胞生长一致，相同条件下达到一定细胞数量所需时间短于植块反复种植法。酶消化法比植块反复种植法更适用于大量雪旺氏细胞的培养。     

β-1，4半乳糖基转移酶-Ⅰ对雪旺氏细胞增殖的影响

目的：探讨周围神经雪旺氏细胞表达β-1，4-半乳糖基转移酶-Ⅰ(β-1，4-galactosyltransferase Ⅰ，β-1，4-GalT-Ⅰ)对其增殖的影响。方法：构建正、反义β-1，4-GalT-Ⅰ表达质粒，将其转染到分离培养的雪旺氏细胞中；运用细胞计数分析转染细胞倍增时间、培养细胞3H-TdR掺入检测转染细胞增殖程度；应用流式细胞仪分析转染细胞的细胞周期变化。结果：转染正义β-1，4-GalT-Ⅰ后雪旺氏细胞的增殖受到抑制，且这种抑制作用随转染浓度增大而增强。而转染反义β-1，4-GalT-Ⅰ有相反的作用。转染正义β-1，4-GalT-Ⅰ后，雪旺氏细胞周期主要被阻滞在G1／G0期。结论：β-1，4-GalT-Ⅰ对雪旺氏细胞的增殖有抑制作用，可能在周围神经雪旺氏细胞的有序增殖过程中发挥重要作用。     

雪旺氏细胞的体外培养及鉴定

采用分散培养法对新生SD大鼠的坐骨神经进行体外培养，成功地培养出了细胞．用抗S-100、抗Fibronectin抗体进行了免疫学鉴定，证实所培养的细胞为雪旺氏细胞。并对雪旺氏细胞的形态进行了观察。     

β-1,4半乳糖基转移酶-I对雪旺氏细胞增殖的影响

目的 :探讨周围神经雪旺氏细胞表达 β -1,4-半乳糖基转移酶 -Ⅰ (β -1,4-galactosyltransferaseⅠ ,β -1,4-GalT -Ⅰ )对其增殖的影响。方法 :构建正、反义 β -1,4-GalT -Ⅰ表达质粒 ,将其转染到分离培养的雪旺氏细胞中 ;运用细胞计数分析转染细胞倍增时间、培养细胞 3H -TdR掺入检测转染细胞增殖程度 ;应用流式细胞仪分析转染细胞的细胞周期变化。结果 :转染正义 β -1,4-GalT -Ⅰ后雪旺氏细胞的增殖受到抑制 ,且这种抑制作用随转染浓度增大而增强。而转染反义 β -1,4-GalT -Ⅰ有相反的作用。转染正义 β -1,4-GalT -Ⅰ后 ,雪旺氏细胞周期主要被阻滞在G1/G0期。 结论 :β -1,4-GalT -Ⅰ对雪旺氏细胞的增殖有抑制作用 ,可能在周围神经雪旺氏细胞的有序增殖过程中发挥重要作用     

培养的周围神经组织特殊三色染色法

目的；以特殊三角染色法显示培养的周围神经组织中轴索及雪旺氏细胞等结构。方法：大鼠背根神经体外培养后，用苏木素精，固绿ＦＣＦ，变色素２Ｒ及磷钨酸等配制三色染色液染色。结果：神经轴索呈蓝绿色，雪旺氏细胞核为红色或紫红色，胞质为浅灰色。结论：特殊的三色染色法能区别显示培养的周转神经组织中轴索及雪旺氏细胞。     

兔坐骨神经电损伤后区域雪旺氏细胞增殖变化及分析

目的 比较成年兔坐骨神经分别受到75V电压损伤和横断伤后雪旺氏细胞增殖变化情况.方法 建立兔坐骨神经电损伤和横断伤实验模型,选择损伤后第3、7、10天作为观察点.应用双酶消化法分离神经受损区域神经雪旺氏细胞并计数.结果 75V电损伤后雪旺氏细胞数量明显要多于横断伤后的雪旺氏细胞数量.结论 75V电损伤不能损伤雪旺氏细胞正常功能,电损伤后坐骨神经Wallerian变性比较快而全面是雪旺氏细胞数量增多的原因.     

雪旺氏细胞和成纤维细胞体外培养的实验研究

目的：本实验通过雪旺氏细胞（Ｓｃ）和成纤维细胞（Ｆｂ）不同培养方法的研究来获得不同比例共存的雪旺氏细胞和成纤维细胞。方法。分散培养（１）差速贴壁法。（２）阿糖胞苷自理法。观察（１）相差显微镜，（２）Ｓ－１００免疫细胞化学染色。（３）细胞计数。结果：被Ｓ－１００染色染上雪旺氏细胞在相差显微镜下观察到的活体雪旺氏细胞的开矿是一致的，细胞呈梭形，经差速壁法和阿糖包苷处理后３天雪旺氏细胞所占比例为９５％，     

雪旺氏细胞源活性物质对周围神经再生影响的实验研究

采用１６４０培养液体外培养ＳＤ乳鼠雪旺氏细胞，吸取其培养液，内含雪旺氏细胞分泌的活性物质。以硅胶管桥接３组ＳＤ大白鼠２ｃｍ有神经缺损，第一组硅胶管内注入雪旺氏细胞培养液，第２组注入１６４０培养液，第３组空白对照，术后４个月第１组，第２组髓鞘直径，动作电位传导速率比较差异有极显著性（Ｐ〈０．０１），实验结果显示雪旺氏细胞泊活性物质对周围神经再生有益。     

人雪旺氏细胞的培养及吞噬麻风菌的观察

体外培养了6例人胚外周神经的雪旺氏细胞,均经传代繁殖,1例传至第11代,存活期达110天。雪旺氏细胞与麻风菌混合培养,定期取出部分细胞进行抗酸染色观察。感染10小时后,可见少量(10％)细胞吞噬了抗酸菌。72小时后吞菌细胞数达到高峰(95％以上),在细胞内可形成菌团——麻风球。电镜下雪旺氏细胞表面的微绒毛间及胞浆内见有多量麻风菌。96小时后,雪旺氏细胞出现明显变性及坏死,但细胞内的麻风菌却无明显改变。     

肿瘤坏死因子和干扰素对体外培养乳鼠雪旺氏细胞的增殖影响

目的 :探讨肿瘤坏死因子 (TNF -α)与干扰素 (IFN -γ)联合应用对体外乳鼠雪旺氏细胞增殖的抑制作用。方法 :建立体外乳鼠雪旺氏细胞培养体系 ;经分离、纯化、传代的雪旺氏细胞通过免疫组化、电镜鉴定后 ,纯度达到90 %以上后进行实验。实验分为空白组、对照组、TNF -α组、IFN -γ组及TNF -α +IFN -γ组 ,分别作用 72h后 ,应用四氮唑蓝 (MTT)比色法测定各组的OD值 ,计算其抑制率。结果 :TNF -α和IFN -γ对乳鼠雪旺氏细胞生长增殖均有直接抑制作用 ,其中TNF -α在 10 0～ 2 0 0 0U/ml浓度范围内对正常雪旺氏细胞增殖有抑制作用 ,呈剂量依赖关系 ,在10 0 0U/ml抑制率达到最大。联合用药能明显提高TNF -α对乳鼠雪旺氏细胞生长增殖的抑制效应。结论 :TNF -α对乳鼠雪旺氏细胞生长增殖起抑制作用 ,并呈剂量依赖性。IFN -γ与TNF -α联合用药有明显的协同抑制效应。     

穴位针刺预处理脑组织提取液对小鼠缺氧存活时间的影响

目的:探讨穴位针刺预处理脑组织提取液的抗缺氧损伤作用,为针刺效应物质的探讨提供初步的实验依据。方法:大鼠肾俞、百会穴针刺后不同时间段断脑提取脑组织液,行小鼠腹腔注射,广口瓶密闭缺氧,记录小鼠缺氧存活时间。结果:生理盐水腹腔注射对小鼠标准缺氧存活时间没有影响(P>0.05);大鼠正常脑组织提取液使小鼠标准缺氧存活时间缩短(P<0.05);穴位针刺预处理后不同时间段脑组织提取液均可使小鼠标准缺氧存活时间明显延长(P<0.05),且呈现明显的时间变化规律,穴位针刺预处理后0.5小时脑组织提取液效果最好,使小鼠标准缺氧存活时间延长至(49.2961±4.9740)分钟(是空白组的2.3倍)。结论:穴位针刺预处理脑组织提取液可提高机体的缺氧耐受能力,具有抗缺氧损伤作用。     

碱性成纤维细胞生长因子缓释微球对许旺细胞在小肠粘膜下层细胞粘附活性的影响

目的观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）缓释微球对许旺细胞（SC）在小肠粘膜下层（SIS）上的粘附影响。方法运用双酶两步消化法对SC进行体外分离、培养、纯化,将bFGF-PLGA缓释微球（bFGF-PLGA-MS）与SC及SIS进行体外复合培养,并以游离bFGF组及单纯培养液组进行对比,观察bFGF-PLGA缓释微球对SC在SIS上粘附影响。结果运用双酶两步消化的体外原代培养方法获取的雪旺细胞数量较多,细胞纯度可达90%以上。细胞的体外增殖活性良好,细胞增殖周期约为6～7天,培养后2～7天为对数生长期,第7天后进入生长平台期;bFGF缓释微球能持续地促进雪旺细胞在SIS上的粘附、增殖及迁移;细胞增殖周期缩短,细胞能较稳定地保持着良好的活性;提高了细胞增殖指数,并使SIS上的SC持续保持较高的增殖活性;细胞数量与bFGF含量的相关系数为0.988（P=0.02）,表明两者间有明显正相关关系。结论 bFGF-PLGA微球的药物缓释促进了SC在SIS上持续而稳定的粘附,为以SC复合SIS构建人工神经提供了有利条件。     

碱性成纤维细胞生长因子缓释微球对许旺细胞在小肠粘膜下层增殖活性的影响

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）缓释微球对许旺细胞（SC）在小肠粘膜下层（SIS）上增殖影响。方法运用双酶两步消化法对 SC 进行体外分离、培养、纯化,将 bFGF-PLGA 缓释微球（bFGF-PLGA-MS）与 SC 及 SIS进行体外复合培养,并以游离 bFGF 组及单纯培养液组进行对比,观察 bFGF-PLGA 缓释微球对 SC 在 SIS 上增殖影响。结果运用双酶两步消化的体外原代培养方法获取的许旺细胞数量较多,细胞纯度可达90%以上。细胞的体外增殖活性良好,细胞增殖周期约为6～7d,培养后2～7d 为对数生长期,第7d 后进入生长平台期; bFGF 缓释微球能持续地促进许旺细胞在 SIS 上的增殖;细胞增殖周期缩短,细胞能较稳定地保持着良好的活性;提高了细胞增殖指数,并使 SIS 上的 SC持续保持较高的增殖活性;细胞数量与 bFGF 含量的相关系数为0.988（P =0.02）,表明两者间有明显正相关关系。结论bFGF-PLGA 微球的药物缓释促进了SC 在SIS 上持续而稳定的增殖,为以SC 复合SIS 构建人工神经提供了有利条件。     

失神经骨骼肌提取液对雪旺细胞体外增殖的作用

目的：观察去神经支配骨骼肌粗提液在体外培养条件下对雪旺细胞（Schwann cells,SCs)增殖的作用,了解外周神经损伤后SCs大量增殖的机理。方法：将新生大鼠SCs培养标本分为加正常骨骼肌提取液组,加失神经支配骨骼肌提取液组和正常对照组,每组10个标本。通过活细胞计数和S－100免疫细胞化学染色证实,观察两种肌肉提取液对SCs增倍时间的影响。结果：对照组SCs增倍时间为8天,正常骨骼肌提取液组为7天,而去神经支配骨骼肌提取液组为5．5天。结论：周围神经损伤后SCs可能受失神经支配骨骼肌产生的某些物质的刺激而增殖加快。     

雪旺细胞在局灶性脑损伤大鼠脑内的存活和迁移

目的 :了解雪旺细胞移植入局灶性脑损伤大鼠脑内后的存活、迁移情况。方法 :SD大鼠采用 Feeney's自由落体撞击法制成局灶性脑损伤模型。雪旺细胞以 Hoechst33342荧光素进行荧光标记 ,在大鼠损伤后即刻移植入脑损伤区。移植后 3天、7天、14天、2 8天、6 0天、90天处死大鼠 ,观察细胞标记荧光情况。结果 :3天、7天时移植的雪旺细胞大量存活于损伤区、海马、侧脑室的脉络丛组织中。 14天后可观察到细胞沿软脑膜、室管膜、血管周间隙迁移 ,并在胼胝体部位排列成索条状。 6 0天时雪旺细胞的标记荧光减弱 ,细胞密度减少。 90天时已观察不到荧光。并在雪旺细胞存活区有巨噬细胞浸润。结论 :雪旺细胞移植入大鼠脑损伤区后可存活并沿特定部位迁移 ,可能由于血脑屏障破坏等因素 ,机体对其有免疫排斥反应     

鹿茸多肽联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对人骨髓间质干细胞体外增殖的影响

目的：探讨鹿茸多肽（PAP）联合胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因修饰的雪旺细胞对人骨髓间质干细胞（BMSCs）体外增殖的影响。方法：按常规方法抽取10 mL健康志愿者骨髓,接种于培养瓶中进行培养,原代培养细胞完全融合前进行传代,传至第3代时收获BMSCs,调整细胞浓度为5×10⁶ mL^-1备用。加入4 μL GDNF基因修饰的雪旺细胞为GDNF组,加入4 μL （10 mg·L^-1） PAP联合GDNF基因修饰的雪旺细胞作为联合组,对照组未加入任何药物仅加入等量的培养基。采用酶联免疫检测法检测各组细胞细胞增殖活力,ELISA法检测各组BMSCs中增殖细胞核抗原（PCNA）水平,AnnexinⅤ-FIFC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。结果：原代培养48 h后大部分细胞贴壁,形态转变为多角形,少数呈梭形。传代细胞几乎呈梭形,为BMSCs,且均为非造血干细胞。与对照组比较,GDNF组和联合组细胞增殖活力和BMSCs中PCNA水平升高（P<0.05）,细胞凋亡率降低（P<0.05）;与GDNF组比较,联合组细胞增殖活力和BMSCs中PCNA水平升高（P<0.05）,细胞凋亡率降低（P<0.05）。结论：PAP联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对人BMSCs体外增殖具有明显的促进作用。     

成年兔坐骨神经雪旺细胞的分离纯化培养

目的：探讨从成年新西兰兔坐骨神经分离培养获得大量雪旺细胞的有效手段,方法：利用成年免发生Wallerian变性的坐骨神经用植块法进行培养,通过相差显微活细胞计数和S－100细胞化学标记相结合鉴定了雪旺细胞增值和纯化程度。结果：通过上述方法获得大量雪旺细胞纯度达95％,并绘制其生长曲线,体外培养的雪旺细胞倍增时间为8d。结论：本方法能获得大量高纯度的雪旺细胞,为组织工程修复周围神经缺损打下基础。     

轴突影响施万细胞分化与整合素α6β4表达

目的：探讨轴突对施万细胞(Schwann cells, SC)分化成熟与髓鞘形成的影响,及在SC的极向分化过程中整合素α6β4的表达。方法：用Wistar乳鼠坐骨神经分离SC,用其脊髓分离神经细胞。经纯化后分别培养及共同培养。用扫描电镜观察二者的形态及髓鞘形成情况;分别用髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、神经微丝(neurofilament,NF）抗体进行免疫标记;采用原位杂交技术检测整合素α6β4 mRNA的表达。结果：单独培养的SC MBP抗原表达阴性;原位杂交检测α6β4表达阴性。SC与神经细胞共同培养时其MBP阳性（说明其已转变为髓鞘形成细胞）,在神经突起周围表达阳性;扫描电镜可见SC与神经细胞贴附、融合、包绕轴突形成髓鞘;原位杂交显示α6β4在SC与神经轴突相贴附处呈线状阳性表达。结论：SC的分化成熟及髓鞘形成呈轴突依赖性,仅在与神经细胞共同培养时,才开始形成髓鞘。它在包绕轴突形成髓鞘时,α6β4在SC表面沿基膜呈方向性表达,在SC与基膜、细胞外基质之间起信号传导作用,使增生的SC具有极性并发生形态结构的改变。在SC的分化成熟及髓鞘形成的过程中,轴突及细胞外基质的作用不可忽视。     

施万细胞分泌物对面神经运动神经元营养活性的实验研究

目的：比较培养的面神经和坐骨神经来源施万细胞（Schwann cell, SC）的可溶性分泌物对面神经运动神经元（facial motoneuron, FMN）的营养活性作用。方法：收集1～4代大鼠沃勒变性段和乳鼠面神经及坐骨神经SC体外无血清条件培养液,超滤浓缩,测定分离纯化的FMN细胞在含不同来源的SC分泌的可溶性物质的条件培养液中的生长活性。结果：在含4种SC条件培养浓缩液（concentrated conditioned media, SC-CMC）的培养液中,FMN生长活性均明显高于在含血清或无血清培养液中,不同来源的SC-CMC间差异无显著性（P>0.05）;其活性主要来自相对分子质量大于30 000组份的蛋白多肽物质,FMN的活性在高蛋白浓度时明显高于低蛋白浓度组（P<0.01）。结论：面神经和坐骨神经SC-CMC中含有促FMN存活、生长的蛋白或多肽,相对分子质量大于30 000,其活性作用与使用的蛋白浓度有关;在研究SC分泌物对FMN营养活性作用时,可考虑选择坐骨神经SC。     

大鼠脑损伤运动障碍模型中移植脂肪干细胞来源的施旺细胞后细胞缝隙连接在神经功能修复中的作用

目的证明移植脂肪干细胞及其诱导分化而来的施旺细胞有利于急性脑损伤动物模型的功能恢复。探索细胞移植后缝隙 连接在脑损伤修复过程中的作用机制。方法在运动皮层损伤偏瘫大鼠模型中,将培育分化得到的脂肪干细胞及施旺细胞以及 RNAi技术沉默Cx43基因的施旺细胞移植损伤灶处行原位培养,术后观察大鼠运动功能恢复情况并予评分。移植7 d后处死取 鼠脑组织,RT-PCR和Western blot验证神经生长因子（NGF）的表达水平。结果在建立的运动皮层损伤的偏瘫大鼠模型,细胞 移植组大鼠优于对照组运动评分。WB结果中对照组NGF表达明显低于各移植组,Cx43基因沉默的施旺细胞移植后组织NGF 表达低于未沉默组,Cx43基因未沉默组与脂肪干细胞移植组无显著性差异。RT-PCR法测得对照组NGF mRNA水平明显低于 各移植组,施旺细胞组水平高于脂肪干细胞组、高于Cx43基因沉默施旺细胞组。结论移植脂肪干细胞和其经诱导分化而来的 施旺细胞,都有利于动物模型的脑损伤后功能恢复。在脑损伤修复期功能性缝隙连接形成过程中,缝隙连接蛋白Cx43发挥了 重要作用,可能通过促进神经生长因子NGF的表达有关。