应用CRISPR/Cas9技术敲除Trib3基因大鼠的基因型鉴定

目的构建Trib3基因敲除大鼠模型及基因型鉴定。方法靶向敲除大鼠Trib3基因后,通过基因测序和PCR技术对大鼠Trib3基因的第3号外显子删除情况进行检测与基因型鉴定。结果得到阳性F0代首建大鼠Trib3-/+,通过自交得到F1与F2代大鼠,筛选出F2代Trib3-/-大鼠。结论成功制备Trib3基因敲除大鼠模型,依次鉴定出Trib3-/-、Trib3-/+和Trib3+/+大鼠,并可以稳定遗传,为后续的实验开展提供理论依据。     

利用CRISPR/Cas9敲除大鼠胰岛素受体底物1（Irs1）基因

目的为研究胰岛素受体底物1(Irs1)基因与代谢病之间的关系,我们利用CRISPR/Cas9系统敲除大鼠Irs1基因,为研究代谢病提供基因敲除大鼠。方法针对Irs1第一外显子,设计CRISPR/Cas9作用靶点,构建sgRNA表达质粒。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9。将Cas9 mRNA和sgRNA混合物注射入SD大鼠的受精卵中,实现靶基因敲除。用T7EN1实验初步检测靶基因的修饰情况,再经过测序分析确定突变。结果获得了5个在Irs1基因突变的首建鼠,突变效率为83%。结论得到了稳定遗传的Irs1基因敲除大鼠。     

应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA-301a敲除小鼠

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA敲除小鼠模型.方法 根据miRNA基因序列,设计针对miR-301a的gRNA引物序列(双靶点),PCR扩增获得针对miR-301a的体外转录模板DNA和构建Cas9体外转录模板,然后进行Cas9和gRNA体外转录.利用体外转录的gRNA/Cas9 mRNA对小鼠受精卵显微注射,并利用T7E1酶切和基因测序对miR-301a突变进行检测和鉴定.结果 PCR扩增、凝胶电泳和基因测序鉴定证实,获得序列正确的用于体外转录的模板DNA;体外转录获得gRNA/Cas9 mRNA,顺利完成对小鼠受精卵的显微注射;利用T7E1酶切对miR-301a突变进行检测,发现8只新生小鼠中有7只(87.5％)被鉴定在miR-301a位点携带突变;基因测序结果显示,各小鼠均有不同程度的碱基插入或缺失突变,其中缺失碱基数目最多的4号小鼠产生31个碱基缺失.结论 成功建立miR-301a基因高效敲除小鼠模型.     

应用CRISPR/Cas9技术制备MrgD基因敲除小鼠模型

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立MrgD基因敲除的小鼠模型,为研究MrgD基因在糖、脂代谢中的作用提供实验工具。方法 根据MrgD基因第一外显子碱基序列,设计针对MrgD基因的sgRNA（single guide RNA）,构建sgRNA表达质粒,利用T7RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9后,将Cas9 mRNA和sgRNA对C57BL/6J小鼠的受精卵进行显微注射。使用基因测序检测MrgD基因碱基的突变情况。结果 获得了MrgD基因突变的F2代纯合子小鼠,即MrgD基因缺失173bp的小鼠。并且,初步研究显示MrgD基因纯合突变小鼠在普通饲料喂养下糖、脂代谢正常。结论 成功构建了MrgD基因敲除小鼠动物模型,为探讨MrgD基因在糖尿病发生发展中的作用提供研究平台。     

利用CRISPR/Cas9技术建立RelB敲除小鼠模型

目的：利用CRISP/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠中的RelB基因,为核因子（nuclear factor,NF）?κB转录因子蛋白家族的RelB基因与肿瘤转移等方面的研究提供RelB基因敲除实验动物模型。方法：利用基因编辑技术CRISPR/Cas9系统,设计并构建针对目的基因RelB第4外显子sgRNA,同时利用T7 RNA聚合酶体外转录Cas9 mRNA。取C57BL/6小鼠受精卵体外注射sgRNA和Cas9 mRNA后,进行胚胎移植,实现靶基因敲除。待小鼠出生后提取DNA并进行PCR鉴定,获得F0代,后与野生型交配后繁殖,取样提取DNA,测序分析鉴定后获得F1代小鼠,并在蛋白质水平和基因组水平分别验证敲除效果。结果：获得了4个在RelB基因突变的首建鼠,并得到了稳定遗传的RelB基因敲除小鼠。基因组测序结果示,敲除实验组中RelB的mRNA出现无义突变,令其mRNA翻译终止。与对照组相比,敲除实验组检测不到RelB蛋白表达。同时,Western blot结果显示,NF?κB家族中其他成员RelA、p50和p52的蛋白表达不受影响。结论：成功获得特异性敲除RelB的C57BL/6小鼠,为RelB在肿瘤转移、耐药中的研究提供了重要工具。     

利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠的研究

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法 针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果 设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论 应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。     

利用CRISPR/Cas9 系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。方法:设计针对敲除CBX2的short guide RNA（sgRNA）,并克隆到载体PX459中。将测序正确的重组质粒转染到A549细胞中,利用嘌呤霉素筛选转染阳性细胞并分离得到5个单克隆细胞系,通过Western blot方法检测构建的细胞系中CBX2蛋白表达情况。结果:成功构建了靶向CBX2的CRISPR/Cas9重组质粒,筛选出的5个单克隆细胞系中CBX2蛋白表达水平均显著下降。结论:成功利用CRISPR/Cas9 系统构建了稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。     

应用CRISPR/Cas9技术建立敲除AIFM1基因的稳定肺癌细胞株

目的 利用CRISPR/Cas9技术在肺癌细胞系A549和NCI-H3255中敲除凋亡诱导因子1(AIFM1)基因,并通过筛选,获得稳定的细胞株。方法 利用在线数据库GEPIA、CPTAC、Prognosis和SangerBox分析AIF在肺癌的表达和功能。以AIFM1基因为靶点,设计向导RNA(sgRNA)并利用CRISPR RGEN Tools分析其脱靶效率,CRISPR/Cas9技术敲除肺癌细胞的AIFM1基因和倍比稀释法筛选稳定的单克隆细胞株。采用Western blot检测细胞AIF表达水平。结果 TCGA和GTEx数据集结果显示,AIF蛋白在肺癌组织阳性表达率比正常组织高,差异有统计学意义（P<0.05）;单因素cox和多因素cox分析发现,pT分期和pN分期是独立危险因素（P<0.05）;CPTAC数据库显示,与正常阶段相比,AIF蛋白在肺癌的不同分级分期阶段的表达增加（P<0.05）。AIFM1基因在TCA循环、亨廷顿氏症疾病、氨基酸-核苷酸-糖的代谢和氧化性磷酸化通路中富集显著,差异有统计学意义（|NES|>1,P<0.05）;3条sgR...     

利用CRISPR/Cas9系统构建SIRT1基因敲除的K562细胞株

目的 构建去乙酰化酶SIRT1基因敲除的K562单克隆细胞株,研究SIRT1基因对细胞增殖的影响。方法设计靶向SIRT1酶活性中的sgRNA编码序列,构建CRISPR/Cas9载体并转染K562细胞,嘌呤霉素筛选后单克隆化并扩增;采用基因组测序、PCR和免疫印迹的方法进行基因敲除效果鉴定;对选定的SIRT1基因敲除的单克隆做生长曲线检测。结果 目标质粒测序符合,质粒转染细胞后检测到基因组靶序列位置杂合峰,获得SIRT1基因敲除的单克隆3个,SIRT1基因敲除导致细胞增殖明显减缓。结论 成功构建了SIRT1基因敲除的细胞株,该细胞可作为血液系统疾病研究的有力工具。