医用PLGA（聚乳酸／羟基乙酸）／脱细胞软骨支架的研制与性能分析

目的在不同实验条件下制备多孔PLGA／脱细胞软骨基质支架，分析其结构与性能及作为软骨组织工程支架材料的可行性。方法将PLGA与猪脱细胞软骨基质按不同比例混合，在三种实验温度下，应用冷冻干燥法制备生物多孔复合物支架，并对各支架材料孔径、孔隙率、亲水性、生物力学强度和降解率进行研究。结果多孔PLGM脱细胞软骨基质支架平均孔径为100～300um，脱细胞软骨基质在PLGA三维结构中均匀分布，其结构和性能均符合软骨组织工程支架材料的要求。结论PLGM脱细胞软骨基质支架可用于软骨组织工程研究。     

多孔细菌纤维素-聚乳酸乙醇酸-羟基磷灰石复合支架的制备及性能研究

目的制备多孔细菌纤维素（bacterial Cellulose,BC）-聚乳酸乙醇酸（poly lactic-co-glycolic acid,PLGA）-羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）复合支架并研究其相关性能。方法溶液浇铸/粒子沥滤法制备多孔BC-PLGA-HA复合支架,扫描电镜观测所得支架表面形貌并测定其抗张强度和孔隙率;体外接种成骨样细胞MG-63培养,以细胞培养板作对照组,通过扫描电镜（SEM）、四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法以及碱性磷酸酶（ALP）检测来初步评价支架对MG-63细胞黏附、增殖活性以及ALP活性的影响。结果多孔BC-PLGA-HA支架抗拉强度为（8.923 1±0.901 2）N/mm2,孔隙率为（64.73±5.65）%;扫描电镜、MTT及ALP检测结果显示支架对成骨样细胞MG-63具有较高的增殖活性及ALP活性。结论多孔BC-PLGA-HA复合支架具良好的力学性能、孔隙率和生物相容性,有望作为一种新型组织工程支架材料。     

新型聚乳酸/骨基质多孔复合支架材料制备及初步研究

目的采用CO2超临界法(SC-CO2)制备一种新型的聚乳酸(PLA)/骨基质(BMG)多孔复合型生物活性骨支架材料,并评价其理化性能及细胞相容性,确定材料最佳复合比例,为进一步的实验提供实验依据。方法采用SC-CO2法制备不同比例的PLA/BMG多孔复合型骨植入材料,通过大体观察、孔隙率测定,力学检测、SEM观察评价其理化性能,并结合体外细胞相容性检测选择最佳复合比例。结果采用SC-CO2法制备的PLA/BMG多孔复合支架材料中BMG的比例与材料的孔隙率及细胞相容性成正相关,与力学性能成负相关;含30%BMG的复合材料具有良好的综合性能。结论采用SC-CO2法制备的PLA/BMG(7/3)多孔复合支架材料具有良好的理化性能及细胞相容性,可作为骨植入材料及骨组织工程支架进一步研究。     

复合软骨修复材料支架的构建

目的：构建一种脱细胞软骨/GelMA复合材料支架用于修复软骨缺损。方法：对α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除（GTKO）猪肋软骨脱细胞处理,得到低免疫原性脱细胞软骨基质,进行4,6-脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色、DNA含量检测评估脱细胞效果,苏木素-伊红（HE）染色、Masson三色染色分别评估细胞外基质结构及蛋白保留情况。再将脱细胞软骨冷冻研磨成粉末状,选取聚合物甲基丙烯酰化明胶（GelMA）溶液与脱细胞软骨粉末按不同比例均匀混合,制备一种可注射型生物材料,经紫外交联后获得可生物降解的复合支架,通过溶胀性能、储能模量检测对支架进行表征,并观察支架上细胞增殖情况。结果：天然软骨DNA含量为161.2 ng/mg,脱细胞软骨DNA含量仅为15.27 ng/mg,该种脱细胞方法效果良好。HE染色显示细胞外基质结构完整,Masson三色染色显示脱细胞组织保留了大部分细胞外基质成分。与纯GelMA相比,脱细胞软骨/GelMA复合支架溶胀率低,力学强度稍强。骨髓间充质干细胞能在支架上黏附并增殖。结论：通过可注射型脱细胞软骨/GelMA复合材料制备的支架具有低免疫原性,适宜的储能模量,良好的生物相容性,适用于软骨修复。     

兔脱钙骨基质材料复合骨髓间充质干细胞的体外培养

目的:制备兔脱钙骨基质材料,研究脱钙骨基质作为软骨组织工程支架材料的可行性。方法:参照Ursit方法制得兔脱钙骨基质材料,扫描电镜观察脱钙骨基质的结构,将兔骨髓基质干细胞与兔脱钙骨基质体外复合培养,第2、4、6、8、10、12天时行MTT法测定及扫描电镜观察。结果:兔脱钙骨基质支架材料外观均呈乳白色,SEM观察脱钙骨基质呈天然的高密度孔隙网架结构,平均孔隙率为(65.86±5.15)%;平均孔径大小为(124.82±42.79)μm;兔脱钙骨基质材料接种于骨髓基质干细胞后可见大量骨髓基质干细胞粘附,随培养时间延长,骨髓基质干细胞增殖明显,MTT法检测显示复合培养8d骨髓基质干细胞增殖达稳定状态。结论:兔脱钙骨基质支架材料具有天然孔隙网架结构,利于细胞的粘附生长,具有良好的生物相容性,是一种较好的软骨组织工程支架材料。     

Ⅱ型胶原糖胺聚糖复合支架对 hUCM SCs成软骨诱导的实验研究

目的：探讨以人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）作为软骨组织工程种子细胞,Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架材料作为细胞载体及其细胞‐支架复合体成软骨的可行性。方法制备Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖多孔支架,电镜观察测定支架材料的孔径、孔隙率和亲水性,对支架材料进行相应的组织学分析。培养鉴定 P3代的hUCMSCs ,将hUCMSCs混悬液接种到Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架上,不加诱导剂进行培养,3周后取出样品行甲苯胺蓝、番红精O染色,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及扫描电镜观察。结果第3代hUCMSCs高度表达CD29、CD105等间充质细胞标志,几乎不表达CD34等内皮细胞、造血细胞标志。Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架材料呈白色多孔泡沫状,孔隙率为（91．8±2．17）％,孔径110～230μm ,分布均匀,相互贯通。吸水膨胀率为（213．71±1．31）％,亲水性良好。甲苯胺蓝、番红精O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性。细胞‐支架复合体在培养过程中可观察到有软骨样组织形成并逐步增多,甲苯胺蓝、番红精O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性,电镜观察显示细胞在支架上增殖活跃,与材料黏附紧密,可见软骨样细胞及其周围大量交错连接的胶原纤维。结论 hUCMSCs与Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架材料复合,可在体外不经诱导而初步构建组织工程软骨,为软骨损伤的修复奠定了一定的实验基础。     

重组人骨形态发生蛋白2对壳聚糖-明胶多孔复合支架理化性能的影响

目的 以组织工程学技术为基础,制备壳聚糖-明胶/骨形态发生蛋白2(BMP-2)多孔复合支架,讨论壳聚糖与明胶的不同配比及向复合材料中加入BMP-2对支架的微观结构和理化性能的影响.方法 分别用不同配比的壳聚糖和明胶制备复合支架,并向1组配比中加入BMP-2.以扫描电镜观察支架的表面特征,测定支架的孔径值、材料的吸水率及表观密度.结果 壳聚糖-明胶多孔复合支架比表面积大,内孔结构多形性高、且大量连通;壳聚糖与明胶配比为4∶1时的复合支架孔径最小,孔壁最厚;配比为1∶4时孔径最大,孔壁最薄;壳聚糖与明胶配比为1∶1时吸水率及表观密度达到最大,分别为(318±75)%和(0.085±0.013)g/cm3;向复合支架中加入BMP-2对支架的微观结构、吸水率及表现密度无明显影响.结论应用冷冻干燥法可以成功制备壳聚糖-明胶多孔复合支架,支架的微观结构与理化性能与壳聚糖与明胶的配比密切相关,向支架中加入BMP-2对材料的理化性能无明显影响.     

壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料的制备及其性能的研究

目的：探讨壳聚糖／Ⅰ型胶原复合物作为软骨组织工程支架材料的物理性能和生物学特性。方法：将壳聚糖溶液与Ⅰ型胶原溶液混合,梯度冷冻后通过冷冻干燥法制备成复合支架。以纯壳聚糖支架材料作为对照。扫描电镜检测支架材料的形貌,检测支架材料的孔径、孔隙率和吸水率。酶消化法培养滑膜细胞,将第3代滑膜细胞接种于支架材料中,检测滑膜细胞在支架材料中的粘附情况,并通过噻唑蓝（MTT）法检测支架材料对滑膜细胞增殖的影响。结果：制备的支架材料呈孔隙分布均匀的海绵状。支架材料的平均孔径为（119．32±38．67）μm,孔隙率为（91．40±1．41）％,吸水率为（69．10±5．61）水g／支架于重g。滑膜细胞在壳聚糖／Ⅰ型胶原支架材料中的粘附率为98．73％,并且该支架材料对滑膜细胞的增殖具有明显促进作用。结论：壳聚糖／Ⅰ型胶原支架材料可作为细胞载体应用于软骨组织工程。     

骨髓基质干细胞在兔DBM上增殖作用的研究

目的 分析骨髓机制干细胞在兔DBM上增殖作用.方法 2014年3月—2015年7月,以3只大白兔为研究对象,根据Urist方法 制备出DBM(同种脱钙骨基质),测定光密度(OD)值,绘制增殖曲线,分析复合培养后最佳修复软骨移植时机.结果 SEM观察呈现高密度空隙网架结构,平均孔隙率为(60.19±6.1)%;平均孔径大小为(119.42±6.46)μm;兔DBM材料BMSCs体外复合培养后可见大量骨髓基质干细胞粘附,MTT法检测复合培养6d骨髓基质干细胞增殖达到稳定状态.结论 兔脱钙骨基质具有三维网状结构和良好的细胞相容性是一种较好的软骨组织工程支架材料,最适合移植.     

壳聚糖与Ⅰ型胶原制备组织工程复合支架材料的扫描电镜研究

【目的】通过扫描电镜观察壳聚糖和Ⅰ型胶原在不同温度下以不同比例制备成冻干状组织工程复合支架材料的微观结构,以获得最佳浓度、比例、温度匹配组合,制备理想的组织工程复合支架材料。【方法】在-5℃、-20℃和-80℃将不同浓度的壳聚糖、Ⅰ型胶原以及它们不同比例的混合液冷冻12h后冻干24h,扫描电镜观察不同材料表面和内部的微观结构,并计算其平均孔径和孔隙率。【结果】壳聚糖、Ⅰ型胶原以及它们的混合液冻干后都形成白色海绵状固体,冷冻温度越低冻干后材料的孔径越小,孔隙率越低;材料的浓度越高冻干后孔径越小,孔隙率越低;壳聚糖-Ⅰ型胶原混合液中壳聚糖含量越高,材料冻干后孔径越小,孔隙率越低。【结论】壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架的孔径和溶液浓度、二者配比以及冻干前的冷冻温度密切相关。     

大块异种脱细胞骨基质的制备及生物相容性研究

目的：探讨大块异种脱细胞骨基质的制备及生物相容性,为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。方法：取牛股骨下端松质骨切割制作4.0 cm×2.0 cm×1.0 cm大小的骨块,用10%NaCl和0.5%曲拉通X-100联合脱细胞处理,分为48 h、72 h、96 h三个时间段;处理后的大块异种脱细胞骨基质行HE染色、Masson染色及扫描电镜观察,观察大块异种脱细胞骨基质的脱细胞程度;用处理后的大块脱细胞骨基质制作浸提液,行急性毒性实验、热源实验,观察大块异种脱细胞骨基质有没有毒性反应及热源性;用处理后的大块异种脱细胞骨基质材料与SD大鼠骨髓间充质干细胞体外复合培养,观察细胞生长、细胞增殖及蛋白质含量测定。结果：4.0 cm×2.0 cm×1.0 cm骨块经过10%NaCl和0.5%曲拉通X-100联合处理72 h组及96 h组的异种脱细胞骨基质经HE染色及扫描电镜观察未见细胞成分,Masson染色观察胶原纤维基本结构未被破坏,材料浸提液急性毒性实验、热源实验符合规定标准,且骨髓间充质干细胞能够贴附在异种脱细胞骨基质孔隙内生长,细胞生长及蛋白合成功能不受异种脱细胞骨基质的影响。结论：大块异种脱细胞骨基质具有良好的生物相容性,可作为骨缺损修复的支架材料。     

脱细胞松质骨/骨形态发生蛋白-2/胶原海绵重建兔上颌窦外侧骨壁伴黏膜缺损实验研究

目的利用胶原海绵及复合骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的脱细胞松质骨,原位修复兔上颌窦外侧骨壁伴黏膜缺损,观察BMP-2原位诱导成骨及上颌窦外侧骨壁、黏膜修复状况。方法制备复合BMP-2的片状脱细胞松质骨,单侧以生物蛋白胶固定薄层胶原海绵作为修复材料,未加BMP-2材料用做对照。手术去除兔上颌窦外侧骨壁及附着黏膜,胶原海绵侧面向窦腔,原位修复缺损,术后3个月进行大体标本及病理切片观察,了解其修复效果及成骨情况。结果兔术后健康状况良好,术后3个月大体观察兔上颌窦外侧壁缺损修复良好,窦腔内侧面有新生黏膜覆盖。病理学检查发现实验组脱细胞松质骨内有新骨形成,对照组仅有纤维结缔组织长人。结论BMP-2具有诱导成骨能力,胶原海绵可用作黏膜再生支架,脱细胞松质骨／BMP-2／胶原海绵,可用于修复上颌窦局部骨壁伴黏膜缺损。     

脱蛋白骨为支架材料体外构建的组织工程骨

目的观察脱蛋白骨与成骨细胞在体外复合培养情况。方法用胎兔颅骨培养的成骨细胞与兔干骺端松质骨制成的脱蛋白骨体外复合培养,通过酶消化法、倒置显微镜及扫描电镜观察其生长情况。结果成骨细胞在脱蛋白骨外表面及孔隙内表面均可贴附生长,增殖、分化良好。结论体外构建的成骨细胞与脱蛋白骨的复合体具有组织工程骨的一部分生物学特性,为进一步观察其在体内的再血管化和成骨活性,用于大段骨缺损修复奠定了实验基础。     

骨组织工程研究的新进展：修复骨缺损的完美技术

骨组织工程自20世纪80年代诞生以来,取得了飞速的发展,为临床上骨缺损的治疗带来新的希望。纵观骨组织工程研究的二十多年里,其构成的三大要素：种子细胞方面、支架材料方面和组织构建方面都取得了一定的进展。但是距离组织工程骨在临床中正式使用尚有一定距离,有待进一步的研究。本文就目前骨组织工程研究的现状及最新进展作一综述。     

转化生长因子β1诱导时间对骨髓基质细胞体外成软骨分化的影响

目的：探讨转化生长因子β1（TGF-β1）诱导时间对骨髓基质细胞（BMSC）体外成软骨分化,及构建组织工程化软骨的影响。方法：将体外培养扩增的第二代猪BMSC按5．0×10^7个／ml的密度接种于聚羟基乙酸（PGA）制成的圆柱形支架材料上,第5天开始应用含TGF-β1（10μg/L）、IGF-I（50μg/L）和地塞米松（40μg/L）的软骨诱导液培养。按TGF-β1诱导时间的不同分为A（诱导2周）、B（诱导4周）、C（诱导6周）、D（诱导8周）和E（诱导10周）5组。体外培养10周后取材行大体观察、组织学和组织化学检测、聚合蛋白多糖（GAG）定量分析和生物力学测定,同时利用Western印迹和免疫组织化学进行Ⅱ型胶原表达的分析。结果：随诱导时间延长,软骨陷窝由周边开始逐渐向内部增多,排列渐趋均匀,蛋白聚糖等软骨特异性基质成分积聚。免疫组化染色及Western印迹结果均显示Ⅱ型胶原含量随诱导时间延长逐渐递增。这种情况至诱导6周后逐渐稳定,诱导6周和诱导10周间差异无统计学意义。诱导6周以上组弹性模量和抗压强度均明显高于A、B两组。结论：利用BMSC作为种子细胞构建组织工程化软骨,诱导持续时间与形成的软骨质量相关,6周的诱导时间基本可以形成具有良好组织结构、化学组成和力学性质的软骨组织。     

脱钙骨颗粒骨水泥骨形成蛋白复合材料配方优化研究

目的 探讨脱钙骨基质颗粒（DBM）、骨水泥（BC）、牛骨形成蛋白（bBMP)的最佳比例和最方便的复合方法。方法 提取bBMP,制备狗DBM,二者按1：25的质量比用直接掺合法和吸附法复合后,再用BC按不同的质量比复合,将复合后的材料行体外生物力学测定和扫描电镜观察,体内成骨诱导活性测定和植入实验。结果 bBMP与DBM直接掺合和吸附法复合后,所得材料的成骨诱导活性无差别。复合材料中DBM的质量比≤40%时,材料内部的大部分间隙＜100μm,空隙率＜20％,不利于新生血管长入和新骨形成。DBM的质量比≥80％时,DBM和BC不能复合在一起,从而失去塑形性,DBM的质量比在50％－75％的范围内,随DBM质量比的增加生物力学强度逐渐降低而成骨诱导和血运重建的质量越好。结论 bBMP与DBM复合以直接掺合法最方便而不影响复合材料的成骨诱导活性。DBM的质量比为50％－60％时,复合材料既具有相当的生物力学强度,又利于诱导新骨形成和血运重建,适宜于修复承重部位的骨缺损,比例为75％时可用于修复非承重部位的骨缺损。     

可长时间缓释骨形态发生蛋白2的聚己内酯复合支架的制备及应用

目的 制备一种可长时间缓释骨形态发生蛋2(BMP-2)的聚己内酯(PCL)复合支架,并通过检测其对人源骨髓间充质于细胞(BMSC)成骨分化的影响探讨其在骨组织工程中的应用.方法 将磷脂(PL)和BMP-2混合形成的BMP-2/PL混合物(B/P)分散在二氯甲烷中,与PCL混合后,采用相分离法制备负载BMP-2的三维PCL-B/P复合支架和PCL-B传统支架,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两种支架的BMP-2缓释效果.将BMSC种植在PCL-B传统支架和PCL-B/P复合支架中,分别采用CCK-8法和实时定量PCR(qPCR)检测两种支架上BMSC的增殖和成骨分化能力.结果 与PCL-B传统支架对比,PCL-B/P复合支架对BMP-2缓释效果更佳,缓释时间更长,可达22 d.在BMSC培养的第7、14和21天,PCL-B/P复合支架上BMSC的增殖能力均优于PCL-B传统支架(P＜0.05),且PCL-B/P复合支架上BMSC中碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原蛋白、骨钙、骨桥蛋白3种成骨基因mRNA的表达均高于PCL-B传统支架(P＜0.05,P＜0.01).结论 成功地制备出一种可长时间缓释BMP-2的高分子三维PCL-B/P复合支架,其较PCL-B传统支架能更好地诱导BMSC的增殖和成骨分化.     

髓核去细胞基质复合骨髓间充质干细胞体外构建组织工程髓核的研究?

目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)-髓核去细胞基质支架(NPAMS)复合体(rBMSCs-NPAMS)构建组织工程髓核。方法制备若干 NPAMS,接种 BMSCs 至 NPAMS 体外培养分为 NPAMS 组、实验组和正常对照组(正常髓核)。肉眼及显微镜观察复合体形态变化,并行扫描电镜(SEM)、苏木素-伊红(HE)染色、免疫组织化学、实时定量 PCR(qRT-PCR)、支架的生物力学等检测。结果肉眼下 rBMSCs-NPAMS 形态接近正常髓核;SEM 显示细胞在支架表面大量黏附、并向深部迁移,表面细胞密度比横截面细胞密度大;HE 染色表明随时间延长,rBMSCs-NPAMS 内细胞量递增,分布更广泛;免疫组织化学显示细胞外基质2型胶原(CollagenⅡ)分泌量随时间递增,且实验组 CollagenⅡ表达量大于 NPAMS 组,小于正常对照组;qRT-PCR结果：NPAMS 组未提取到 mRNA,实验组 CollagenⅡ、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA 相对表达量呈时间依赖性递增,但均小于正常对照组(P <0.01),支架与正常髓核在相同位移下的压缩载荷差异无统计学意义(P >0.05)。结论采用髓核体外 NPAMS复合 rBMSCs 可成功构建组织工程髓核。     

脱细胞真皮联合骨髓间充质干细胞修复糖尿病大鼠皮肤全层缺损创面的研究

目的研究以骨髓间充质干细胞为种子细胞、脱细胞真皮为支架的组织工程皮肤对糖尿病大鼠皮肤全层缺损创面愈合的影响。方法 36只大鼠随机分为3组,A组：骨髓间充质干细胞＋脱细胞真皮实验组;B组：脱细胞真皮对照组;C组：空白对照组。观察创面愈合及5-BrdU阳性细胞表达角蛋白的表达情况。结果 A组第3、5、7及14 d创面愈合率分别为（19.10%±3.52%）、（29.80%±4.10%）、（56.71%±8.07%）与（88.12%±5.31%）,明显快于B、C两组（P〈0.05）。A组新生皮肤的细胞结合有序,排列紧密,真皮层较厚,有大量皮肤附属器及血管形成,明显多于B、C两组。免疫组化检测BrdU阳性细胞表达角蛋白。结论骨髓间充质干细胞联合ADM可有效促进糖尿病大鼠创面的愈合。     

脱细胞鼠肾生物支架的制备及其体内相容性

目的：制备一种抗原封闭完全,蛋白成分保留完好,生物性能较好的鼠肾脱细胞基质支架,并对其体内生物相容性进行分析。方法：取健康SD大鼠,采用腹主动脉在体灌注去污剂的方法制备全肾脱细胞基质支架,对处理后的支架材料进行形态结构观察,主要成分分析;将其支架进行皮下包埋检测体内细胞相容性。结果：经脱细胞处理后,肾支架形态上具有三维立体空间结构,肉眼可见其内血管脉络;DNA残留量不及正常组3%;HE、透射电镜（TEM）、PAS等观察细胞成分已完全去除,细胞外基质网络结构保留完整;免疫荧光显示细胞外基质成分Ⅳ型胶原（collagen Ⅳ）、层黏连蛋白（laminin）及纤维黏连蛋白（fibronectin） 均呈强阳性表达,未见明显细胞核成分残留;皮下植入结果显示,初期炎症反应明显,随着时间推移,炎症减轻,支架内逐渐有血管长入,基质逐渐降解。结论：经去污剂灌注处理的脱细胞肾基质,可有效清除肾内所有细胞成分,较好地保留细胞外基质支架且形态完好,具有良好的组织相容性。