PCR技术在快速筛选DNA文库中的应用

目的探讨运用PCR(polymerase chain reaction)方法快速筛选DNA文库的可行性.方法以猪α-1,3GT cDNA片段为探针,用cDNA上的特异性序列合成的引物,采用噬菌斑原位杂交和PCR相结合的方法,对猪的gDNA文库进行α-1,3GT基因筛选,经酶切、Southern Blot、测序和荧光原位杂交定位.结果经过两次杂交和一次PCR即得信号很强的7个阳性单克隆,插入子均在8kb以上,且包含第三内含子,其中3个片段测序证实含第三、第四外显子;荧光原位杂交证实该基因位于染色体1q2.10-q2.11.结论PCR可以应用于快速筛选DNA文库.     

聚合酶链反应和DNA探针联合检测临床标本中结核杆菌的研究

解放军第309医院吴雪琼等,为提高聚合酶链反应(PCR)检测未培养临床标本中结核杆菌的敏感性和特异性,将PCR和DNA探针联合使用。首先通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,然后用Southern法转移至硝酸纤维膜上,与地高辛标记的人型结核杆菌DNA探针杂交。 结果显示,PCR电泳检测的灵敏度为1Pg,而DNA探针检测将灵敏度提高到100fg;24种受试菌     

人脑髓鞘碱性蛋白cDNA重组质粒pRK41转化及全长编码区体外扩增

作者将含人脑髓鞘碱性蛋白(MBP)编码区和3’端非翻译区(1.2kb)的重组质粒pRK41—1.2转化宿主菌E.coli JM109,用非同位素标记鼠MBP cDNA克隆片段作探针,经菌落原位杂交筛选出阳性克隆并以此为模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出含21.5kd MBP全长编码序列(600bp),又经限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ消化,电泳结果进一步证实该PCR产物的特异性,为人MBP全长编码序列。     

实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的研究

目的 采用TaqMan探针建立检测沙眼衣原体的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法.方法 根据沙眼衣原体外膜蛋白A的基因(ompA)序列设计引物和探针,以克隆的ompA部分基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量检测方法.结果 建立的荧光定量PCR检测方法的最低检出限为5 copies/反应,检测线性范围100107线性关系良好(r2=0.997),比巢式PCR敏感100倍;且与鹦鹉热衣原体、淋球菌、解脲脲原体、大肠杆菌等病原菌DNA以及人基因组DNA均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性.以巢式PCR作参比,建立的荧光定量PCR法检测沙眼衣原体的阳性符合率为100.00％,阴性符合率为95.09％,总符合率为96.81％.结论 建立的检测沙眼衣原体实时荧光定量PCR具有特异性强和敏感性高的特点,可快速检测样本中微量沙眼衣原体DNA,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.     

用PCR技术检测慢性HBsAg携带者血清的传染性(附91例分析)

用聚合酶链反应(PCR)技术。对91例慢性 HBsAg 携带者的血清进行体外基因扩增检测 HBV-DNA,阳性率为75. 82%,用生物素探针(Bio-HBV 探针)斑点杂交法直接检测 HBV-DNA 作对比,其阳性率为40. 66%。另外,用 Bio-HBV 探针直接检测 HBV-DNA阴性的61例血清,经 PCR 扩增后仍有39例可检出 HBV-DNA,阳性率为63. 9%。本文同时用 PHSA-R(多聚人白蛋白受体)血凝法进行检测,阳性率为17. 58%,但在 HBeAg阳性的37例中,其阳性率高达37. 84%,与探针直接法检测 HBV-DNA 阳性率无显著差异。     

大鼠Egr-1探针的制备及应用

目的：制备大鼠早期生长反应基因（Egr）-1分子探针,为进一步应用其研究Egr-1在病变组织的表达奠定基础。方法：提取大鼠心肌组织总RNA,PCR扩增基因片段,克隆入pGEM-T Easy载体,行酶切和基因测序。用随机引物DNA标记法制备α-32P标记的Egr-1和β-actin探针。Northern blot和Western blot法分析验证探针的信号强度及特异性。结果：PCR扩增所得目的基因片段大小与理论预期一致,测序证实获得基因序列与实验设计吻合。Northern blot显示该探针可检测心肌组织中目标mRNA水平,Western blot法检测到大鼠心肌组织中Egr-1蛋白的存在。结论：本研究成功制备大鼠Egr-1 cDNA探针,可用于进一步研究Egr-1与相关心血管疾病病理机制的关系。     

PCR制备地高辛配基标记的探针检测登革病毒核酸

用聚合酶链反应(PCR)技术,以重组质粒PDEⅡ305 DNA为模板,在底物中补充标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(DIG-dUTP),经扩增反应制备了地高辛配基标记的登革病毒2型(DEN_2)cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交表明该探针有DEN_2型特异性,可检出0.1Pg DEN_2-RNA。PCR扩增标记只用10 ng模板DNA,数小时内可制备约Iug标记的cDNA探针,而用六聚核苷酸随机引物(RHP)标记,从质粒DNA酶切、片段回收到标记获得探针,至少需数10 h。可见PCR技术直接制备地高辛配基标记的cDNA探针较方便,快速、标记率高、特异性强,具有一定的应用前景。     

α变形菌纲磁螺菌属TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种快速有效检测环境中α变形菌纲磁螺菌属细菌的方法。方法本研究以α变形菌纲磁螺菌属保守且特异的16SrRNA片段为靶序列,化学合成基因序列,制备重组质粒作为磁螺菌属检测的标准品;用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术,针对目的片段基因设计特异性引物和TaqMan荧光探针,进行实时荧光定量PCR检测,运用统计学方法评价该方法的特异性、敏感性及重复性。结果本实验成功构建了质粒PUC19-QC,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.10×101~5.10×107拷贝数之间具有较好的线性关系,相关系数R2=0.999。该法最低可检测到5.10×10个DNA拷贝数,灵敏度明显高于普通PCR;重复性试验表明,荧光定量PCR检测结果 Ct值波动范围较小,Ct值的标准差均小于0.23,表明该法重复性好,可靠性高。析因方差分析表明不同稀释度之间的Ct值差异有统计学意义(F=3 125.305,P0.001),三个批次的再现性良好,差异无统计学意义(F=0.057,P=0.945),而浓度分组与时间之间也无交叉效应(F=0.533,P=0.873)。结论本实验所建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术,能够快速有效地检测α变形菌纲磁螺菌属细菌,且检测结果稳定,受外界条件如时间、气温等影响小。     

聚合酶链反应-微孔板杂交技术检测人乳头瘤病毒

目的　建立HPV诊断及分型技术。方法　用HPV通用型引物和型特异性探针作PCR 微孔板杂交检测法(PCR ELISA)。结果　特异性探针只与HPV阳性标本显色 ,A值为 0 32 7± 0 0 2 9;阴性标本均不显色 ,A值为 0 0 0 3± 0 0 0 1,与性传播性疾病相关的病原微生物 (淋球菌、解脲支原体、沙眼衣原体、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒 )均不显色。该法能检出 3 6个HeLa细胞含HPV 18型 144个拷贝 ,A值 0 2 37～ 0 2 0 6 ;空白对照A值为 0 0 0 5～ 0 0 15。结论　PCR ELISA方法快速、敏感、特异且可用自动化酶标仪多量标本检测 ,适合临床实验使用。     

荧光定量PCR与免疫荧光法定量定性检测牛血清中呼肠孤病毒

目的采用TaqMan荧光探针定量PCR技术与免疫荧光技术定量定性检测牛血清中呼肠孤病毒。方法以携带有Reovirus保守系列的重组质粒作为标准品,优化定量PCR体系,建立标准曲线,用Vero细胞培养不同病毒评价方法的特异性;用FITC标记的抗Reovirus病毒蛋白单克隆抗体对感染不同滴度Reovirus的Vero细胞培养物进行直接免疫荧光检测,用Vero细胞培养不同病毒评价方法的特异性。结果 Taq Man Real-time PCR方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/l,线性范围为109～103;免疫荧光法对Reovirus检测具有很高的特异性。结论以TaqMan荧光探针检测Reovirus荧光定量PCR方法,灵敏度高、特异性强,辅以免疫荧光定性检测方法,可以作为牛血清感染Reovirus的定量和定性检测。     

蓖麻毒素及其A、B链的提取分离纯化的研究

本文研究蓖麻毒素及其A、B链的提取、分离、纯化,根据B链能与Sepharose-6 B上的半乳糖结合,而A链不具有这一性质,用β-巯基乙醇使蓖麻毒素直接在Sepharose-6B柱上断链,然后分别用Tris-HCl和Tris-HCl-半乳糖溶液洗脱,首次把蓖麻毒素的制备、纯化以及A、B链的断链、分离结合起来,大大简化了工艺。     

缺口连接酶链反应检测沙眼衣原体DNA的实验研究

目的:建立缺口连接酶链反应方法检测沙眼衣原体.方法:根据编码CT主要外膜蛋白的基因(ompl)的稳定区设计2对互补的寡核苷酸探针.采用G-LCR和常规PCR扩增CT标准株DNA,并对二者检测CT的敏感性进行比较.结果:对5种CT标准株进行G-LCR扩增,均出现54bp长度的DNA片段.敏感性实验可检测出2个CT原体,而PCR可检测出20EBs.G-LCR较PCR敏感10倍;在特异性方面,不扩增肺炎衣愿体及其他细菌DNA,具有很高的特异性.结论:G-LCR用于检测沙眼衣原体特异、敏感、快速、准确,可为CT感染的临床诊断提供依据.     

急性心肌损害对心肌肌球蛋白磷酸化系统的影响

为探讨急性心肌损害对心肌肌球蛋白磷酸化系统的影响，选择对于心肌有特异性损害作用的异丙基肾上腺素（ＩＳＰ），造成大鼠实验性心肌损害的动物模型，动态观察心肌损害时肌球蛋白磷酸化系统的变化规律。研究结果表明，低剂量ＩＳＰ导致心肌匀浆中肌球蛋白轻链激酶（ＭＬＣＫ）和肌动球蛋白ＡＴＰ酶的活性下降，但心肌组织病理切片基本正常；高剂量注射ＩＳＰ，ＭＬＣＫ和ＡＴＰ酶活性显著下降，与正常对照组和低剂量组相比，差异十分显著（Ｐ＜０．０１）。在病理形态学上大鼠心肌组织有多处较大的坏死灶。提示，在未发生明显的病理性变化前，心肌细胞内就已发生了一系列的代谢紊乱，如酶活性下降，心肌细胞的收缩功能发生改变；当心肌组织出现病理形态学改变时，细胞内酶活性显著下降，表明已由可逆性损害发展到不可逆的心肌坏死。     

基于区块链的智慧图书馆用户隐私保护

将区块链技术应用到智慧图书馆用户的隐私保护,借鉴时间戳、哈希函数、Merkle 可信树及共识机制等技术构建集智慧链的防篡改、隐私加密和安全存储机制于一体的用户隐私保护架构模型,并分别从数据层、网络层、共识层、激励层、合约层和应用层阐述了隐私保护机制,提出了解决智慧图书馆用户隐私保护问题的途径。     

基于时间耗费的供应链系统物流过程研究

物流过程是供应链管理的重要环节。文章首先对供应链的物流过程进行了扼要描述,然后分析了物流过程时间耗费的结构,并运用马尔柯夫链理论构建相应的计算模型。在此基础上,参照某企业产品物流过程的实际情况,运用所构建模型对物流过程的时间耗费进行计算和分析,为企业进行供应链管理提供了理论依据。     

应用PCR检测石蜡包埋骨髓活检标本B淋巴细胞克隆性增生

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测慢性Ｂ细胞性白血病、多发性骨髓瘤及Ｂ细胞恶性淋巴瘤骨髓浸润的石蜡包埋骨髓活检标本克隆性免疫球蛋白重链（ＩｇＨ）基因重排共１９例，其中１６例检测出ｌｇ基因单克隆性重排，总阳性率为８４％。非肿瘤大致正常骨髓标本和急性粒细胞白血病骨髓标本则出现多克隆性弥漫带或无扩增产物。以上结果表明：石蜡包埋骨髓活检标本来源的ＤＮＡ可用于ＰＣＲ检测单克隆性ＩｇＨ基因重排。     

人内皮细胞特异性分子-1表达载体的构建、体外表达及初步纯化

目的探讨人内皮细胞特异性分子-1(hESM-1)表达载体的构建、体外表达及表达产物的初步纯化.方法从人脐静脉内皮细胞中提取总RNA,用反转录-PCR扩增出hESM-1的cDNA.插人质粒pET-28b中构建成表达载体,转化人大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达,表达产物用电洗脱的方法初步纯化.结果经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为含hESM-1的重组质粒,经SDS-PAGE分析证实获得产物为分子量23 808 u的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的24%.结论成功构建了重组hESM-1表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,为进一步研究及临床应用奠定了良好基础.     

医院药库供应链管理方案设计

针对医院药库与药品供应商之间存在的供应信息传递效率低、手工重复操作多等问题,设计了以药库和采购为核心环节的供应链信息管理系统。利用安全网关和条码扫描等手段,使药品采购计划和配送信息在医院内网HIS系统、外网服务器平台和供应商业务系统之间及时传输。药品实物可以直接配送到终端子库房,配送信息则逐级传递,既减少了人工核对的工作强度,实现快速验收,又可以加强药品监管和绩效评估,有效提高药库的物流工作效率。     

实时荧光定量PCR与酶联定量PCR技术在 HBV-DNA载量检测中的比较研究

目的:比较实时荧光定量PCR(RQ-PCR)与酶联定量PCR(ELQ-PCR)技术在检测HBV感染血清HBV-DNA载量的灵敏度,精确性.为乙型肝炎临床抗病毒治疗和评价药物疗效提供可靠的依据.方法:应用RQ-PCR方法检测212例(4组)HBV感染者血清,ELQ-PCR方法检测228例(4组)HBV感染者血清.结果:RQ-PCR和ELQ-PCR方法检测HBV-DNA,其阳性检出率分别为HBsAg,HBeAg,HBcAb-IgG( )组100%和82.61%;HBsAg,HBeAb,HBcAb-IgG( )组90.63%和73.21%;HBsAg,HBcIgG,HBcAb-IgM( )组80.00%和57.58%;HBsAg,HB-cAb-IgG( )组70.15%和51.43%.HBV-DNA载量的阳性检出率,经统计学处理有显著性差异(P＜0.05).结论:RQ-CPR方法检测HBV-DNA载量在实时监测,节时快速,高灵敏,高精确度等方面都更优于ELQ-PCR.     

抗肌球蛋白重链和轻链抗体在扩张型心肌病与冠心病鉴别诊断中的价值

目的　旨在探讨抗肌球蛋白重链和轻链抗体,在扩张型心肌病（DCM）和冠心病中鉴别诊断的价值。方法对21例DCM患者,14例冠心病患者及正常健康组18例,进行临床免疫学检测,应用ELISA法,免疫转印法检测数值予以分析。结果ELISA法DCM组阳性率43．9％,冠心病组28．6％,正常对照组均为阴性。免疫转印法21例的DCM患者抗肌球蛋白重链抗体（200KD）10例阳性,阳性率47.6％,冠心组抗肌球蛋白轻链抗体（27．SKD）阳性4例,阳性率28．6％,PBS替代试验均为阴性。结论抗心肌肌球蛋白重链和轻链的抗体检测有助于DCM和冠心病的鉴别诊断。