MiR-122稳定转染细胞系的建立及其脂代谢特征

目的:利用稳定表达人miR-122前体的表达载体,转染低表达miR-122的人肝癌细胞系HepG2细胞,获得过量表达miR-122的稳定转染细胞系,探讨miR-122对肝脏细胞脂代谢的影响及其机制。方法:对已构建完成的表达质粒pEZX-hsa-mir-122和对照质粒pEZX-mir-control进行酶切鉴定,对酶切正确的克隆进行DNA测序,测序正确的克隆应用脂质体试剂转染,绿色荧光蛋白表达监测转染效率,应用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞系,实时定量PCR在RNA水平鉴定miR-122的表达,蛋白质印迹法从靶分子水平验证miR-122的抑制功能,尼罗红染色观察细胞内脂质。结果:pEZX-hsa-mir-122质粒成功转染HepG2细胞,质粒携带的miR-122前体序列整合到细胞基因组中,获得过量表达miR-122的HepG2细胞株,细胞内成熟体miR-122可抑制靶基因的翻译,细胞内脂质明显增加。结论:人miR-122前体序列可整合在HepG2细胞基因组中,过量表达miR-122的HepG2细胞出现脂质代谢异常。     

小鼠微小RNA miR-22真核表达载体的构建及功能初步研究

目的 从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段并克隆到pIRES2-EGFP,构建miR-22的真核表达载体.方法 利用PCR技术从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段,克隆到质粒pUCm-T,测序正确后构建到真核表达载体pIRES2-EGFP中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行序列测定.脂质体Lipofectamin 2000法转染Hela细胞后G418筛选获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过RT-PCR方法对neo片段进行鉴定,采用Northern blot技术检测miR-22的表达.结果 PCR扩增得到的334 bp片段与预期的miR-22前体对应的基因组片段序列一致;成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/miR-22,测序结果正确.重组质粒转染Hela细胞后,经G418筛选成功获得阳性克隆.Northern blot分析显示miR-22在Hela细胞内高效表达.结论 本实验成功克隆了miR-22的前体对应的基因组片段,构建其真核表达载体,并在Hela细胞内获得高表达,为深入研究微小RNA miR-22的功能奠定了基础.     

miR-146a前体多态性对宫颈癌细胞增殖的影响

目的:通过转染miR-146a前体(Pre-miR-146a)多态性真核表达质粒,观察miR-146a多态性对miR-146a表达情况和宫颈癌HeLa细胞增殖能力的影响并探讨可能的作用机制?方法:PCR扩增含多态性位点的Pre-miR-146a目的片段,连接入pcDNA3.1(+)质粒表达载体得到Pre-miR-146a-G及Pre-miR-146a-C重组质粒,将重组质粒转染宫颈癌HeLa细胞?实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测miR-146a的表达,CCK8法检测HeLa细胞的增殖情况,real-time PCR以及Western blot检测miR-146a靶基因肿瘤坏死因子受体相关激酶-6(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)的表达?结果:成功将miR-146a多态性前体片段克隆入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,获得Pre-miR-146a-G及Pre-miR-146a-C重组质粒;转染重组质粒能够在HeLa细胞内高效和特异地表达miR-146a(P < 0.05),且转染Pre-miR-146a-C质粒组miR-146a表达量较Pre-miR-146a-G质粒组高,差异有统计学意义(P < 0.05);HeLa细胞转染重组质粒48 h后,其细胞存活率较对照组显著增加(P < 0.05),细胞内TRAF6的蛋白水平显著下降(P < 0.05),但TRAF6的mRNA水平无变化,差异无统计学意义(P > 0.05)?结论:Pre-miR-146a多态性位点能影响成熟miR-146a表达,过表达miR-146a可能通过下调TRAF6基因抑制NF-κB信号通路,从而促进HeLa细胞增殖?     

ERK2-siRNA质粒的构建及其诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的实验研究

目的:合成、克隆、筛选ERK2-siRNA干扰片段,构建含有ERK2-siRNA的骨架质粒。明确其抑制基因ERK2在HeLa细胞中表达及诱导HeLa细胞凋亡。方法:利用RNA干扰方法构建真核表达载体pGenesil1.1-ERK2-siRNA。体外培养人宫颈癌HeLa细胞,利用脂质体法将该质粒转染HeLa细胞。利用western blot法检测该质粒转染后ERK2基因的表达,筛选最佳干扰质粒。通过TUNEL法HeLa细胞凋亡染色及HeLa细胞Caspase-3表达的免疫组化染色检测其诱导HeLa细胞的凋亡。结果:成功构建及筛选出ERK2-siRNA质粒。该质粒在体外能够有效诱导HeLa细胞凋亡。结论:干扰ERK2基因的表达能够诱导HeLa细胞的凋亡,应用该方法可以为宫颈癌的治疗提供新思路。     

miR-122表达载体的构建及其对Bcl-xL,Bcl-2基因的抑制作用

目的构建miR-122真核表达载体并检测其表达对BEL-7402/5-FU细胞中耐药相关基因Bcl-xL,Bcl-2基因表型的作用。方法人工合成miR-122成熟cDNA序列,以质粒载体pSilencer 3.1-H1 neo为母本,构建miR-122真核表达载体,空载体作为对照,利用脂质体2000和G418筛选稳转至BEL-7402/5-FU细胞中。其中转染miR-122载体的细胞为miR-122转染组,转染空载体的细胞为空载体转染组,通过实时荧光定量RT-PCR检测未转染组、转染空载体组和miR-122转染组细胞中miR-122表达水平。验证miR-122载体是否在细胞中稳定表达。并通过实时荧光定量RT-PCR检测未转染组、空载体转染组和miR-122转染组中耐药相关基因Bcl-xL,Bcl-2的基因表达情况。结果 miR-122真核表达载体在BEL-7402/5-FU细胞中稳定表达,与未转染组和空载体转染组比较,miR-122转染组中Bcl-xL,Bcl-2的基因表达水平显著降低。结论 miR-122可下调耐药相关基因Bcl-xL,Bcl-2的基因表达,MiR-122是降低BEL-7402/5-FU细胞的5-氟尿嘧啶药物敏感性影响的潜在因素。     

hTERT siRNA表达载体的构建及对转染的HeLa细胞生长抑制作用

目的:通过RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达,探讨干涉后对肿瘤细胞生长的抑制作用. 方法:根据人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA编码序列,设计RNA干涉靶点,构建siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并转染HeLa细胞,通过RT-PCR法观察重组质粒转染肿瘤细胞后端粒酶mRNA、蛋白含量及细胞生长情况. 结果:构建的siRNA表达载体可以使HeLa细胞端粒酶逆转录酶mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度减慢. 结论:成功构建了针对人端粒酶逆转录酶的siRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中端粒酶的表达,并引起细胞生长抑制.     

中电导钙激活钾通道渊IKCa通道冤在HeLa细胞中的表达及其对细胞增殖的影响

目的：本研究旨在探讨中电导钙激活钾通道(IKCa通道)在宫颈癌HeLa细胞中的表达及其对细胞增殖的作用。方法：以宫颈癌HeLa细胞株为研究对象,构建包含IKCa通道特异性shRNA片段的pGenesil-IK质粒;运用荧光定量PCR和Western Blotting比较pGenesil-IK质粒转染干预前后宫颈癌HeLa细胞中IKCa通道基因和蛋白表达水平的变化;运用WST-1检测技术和流式细胞术观察转染干扰质粒后对HeLa细胞增殖的影响。结果：[1]转染pGenesil-IK干扰质粒后HeLa细胞IKCa通道mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低(P<0.05)。[2]转染pGenesil-IK1干扰质粒显著抑制HeLa细胞增殖和细胞周期(P<0.05)。结论：宫颈癌HeLa细胞上有较高的IKCa通道表达,抑制宫颈癌HeLa细胞株IKCa通道表达能有效抑制癌细胞增殖,提示IKCa通道可能是宫颈癌的治疗靶点之一。     

miR-122表达载体的构建及其对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用

目的构建miR-122表达载体并检测其表达对HepG2.2.15细胞恶性表型的逆转作用。方法以HepG2.2.15细胞基因组DNA为模板,PCR扩增miR-122前体cDNA序列,以质粒pSilencer3.1-H1 neo为母本,构建miR-122表达载体将其转染HepG2.2.15细胞。表达后,利用ELISA检测HepG2.2.15细胞HBV复制和表达的变化,利用CCK8检测细胞增殖的变化。结果构建的miR-122表达载体可在HepG2.2.15细胞中表达。转染后HepG2.2.15细胞中HBV复制、表达以及细胞增殖均被抑制。结论 miR-122表达载体可在HepG2.2.15细胞中有效表达,其表达可抑制HBV复制、表达以及细胞增殖。     

RNA干扰技术用于survivin基因表达的研究

目的：构建pSUPER-SVV表达载体,并在真核细胞中进行表达,验证survivin基因表达是否受到抑制。方法：设计特异性以survivin基因为靶序列的寡核苷酸序列,退火后将其连接于pSUPERbasic载体中,经测序鉴定插入序列的正确性。以脂质体转染方法将pSUPER-SVV干扰质粒转染人类宫颈癌（HeLa）细胞,应用流式细胞术和RT-PCR方法检测survivin基因的表达情况。结果：成功构建survivin的RNAi表达载体。该载体可以使HeLa细胞中survivin基因在mRNA转录水平明显降低,与转染空质粒组相比差异具有显著性（P<0.05）。利用流式细胞术检测蛋白表达水平,转染pSUPER-SVV组抑制率可达31.62%,与转染空质粒组相比差异具有显著性（P<0.001）。结论：成功构建干扰survivin基因表达的载体,转染HeLa细胞后survivin基因在mRNA转录水平、蛋白表达水平均受到明显抑制。     

siRNA靶向Rac1真核表达载体的构建与效应检测

目的 构建、纯化并鉴定Rac1特异性siRNA的真核表达载体,并在HeLa细胞中初步检测其转染率及对Rac1基因的抑制率.方法 体外合成含针对人、鼠的Rac1特异基因序列的siRNA链,定向克隆至pSUPER质粒中, 对重组质粒进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.将抽提的质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜观察转染效率,荧光定量RT-PCR法鉴定其抑制Rac1基因表达的效果.结果 利用RNAi技术成功构建抑制 Rac1 表达的小干扰 RNA 重组载体,并成功转染到HeLa细胞中(载体转染率达到70%以上).在mRNA水平对Rac1基因的表达产生明显抑制作用(抑制率为87%以上).结论 成功构建了针对Rac1的siRNA真核表达载体,为进一步研究Rac1的功能奠定了基础.     

小鼠肝脏特异的微RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的利用分子克隆技术,构建微RNA(microRNA,miRNA)真核细胞载体.方法人工合成小鼠肝脏特异的微RNA(miR-122)前体基因序列,并添加酶切位点及polyT转录终止序列,经退火处理后形成双链结构,插入小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体pAVU6 27中,经酶切鉴定和测序证实后,构建成为miR-122真核表达载体(pAVU6 27-mir122).结果合成的基因序列完全正确并成功克隆到真核表达载体pAVU6 27上.结论 miR-122真核表达载体的构建,为进行真核细胞转染及miR-122表达的研究奠定了基础.     

PYK_2小干扰RNA对成年大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响

目的以富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,探讨PYK2小干扰RNA表达载体对心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的影响。方法以pAVU6 27质粒为载体,以PYK2为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,行酶切和测序鉴定。用PYK2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的成年大鼠心脏成纤维细胞,反转录聚合酶链反应和Westernblot法检测PYK2基因和蛋白表达的改变,四唑盐比色法和3H-TdR掺入率检测转染后细胞的增殖和DNA合成情况。结果酶切鉴定和测序分析表明靶向PYK2的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染CFs后,PYK2的mRNA和蛋白水平较空载体转染的对照组显著下降;重组体转染CFs后MTT比色A值和3H-TdR掺入率均明显低于对照组。结论PYK2小干扰RNA表达载体是抑制心脏成纤维细胞增殖和DNA合成的有效手段,有利于深入探讨PYK2在心肌纤维化发生发展中的作用。     

miRNA-155表达对人肺癌细胞A549增殖的影响

【目的】探讨miRNA-155在正常肺组织和非小细胞肺癌组织中的表达及miRNA-155对人肺癌细胞A549增殖的影响。【方法】采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术检测15例非小细胞肺癌组织及其癌旁组织中miRNA-155的表达;A549细胞分别转染miR-NC和miRNA-155 mimic ,采用Real-time PCR技术检测转染后A549细胞中的miRNA-155表达水平,同时采用MTT 技术和流式细胞技术检测转染后A549细胞增殖情况,Western印迹法检测转染后A549细胞中Akt、p-Akt（Ser473）、p27、bcl-2、bax的表达。【结果】miRNA-155在非小细胞肺癌组织中的表达情况明显高于癌旁组织（ P ＜0．05）;与转染 miR-NC 组相比, A549细胞转染miRNA-155 mimic后miRNA-155表达水平明显增高（ P ＜0．001）,MTT实验和流式细胞技术显示miRNA-155促进A549细胞的增殖;Western印迹法结果显示：转染miRNA-155的A549细胞p-Akt （Ser473）,bcl-2的表达水平增高,p27、bax的表达水平降低。【结论】miRNA-155可能通过促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,上调p-Akt（Ser473）、bcl-2表达,同时抑制p27、bax的表达来促进非小细胞肺癌的发生发展。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗的影响

目的：研究抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗敏感性的影响。方法：以脂质体法将抗HPV16E6－Ribozyme，空载体质粒分别导入CaSKi细胞，命名为CaSKi-R,CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在我的表达，Northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达。用克隆形成试验控制3种细胞对化疗的敏感性，Annexine/PI双标法检测细胞凋亡率。结果：点杂交证实核酶能在CaSKi－R细胞中稳定表达，Northern杂交证实CaSKi－R中表达E6较CaSKi－P，CaSKi明显降低。CaSKi－R细胞的生长速率较CaSKi－P，CaSKi明显减慢，泰索作用后相对克隆形成率和凋亡率在3种细胞间亦无差异（P＞0．05）；顺铂作用后CaSKi－R细胞的相对克隆形成率较CaSKi－P，CaSKi明显下降（P＜0．01），而凋亡率明显增加（P＜0．01）。结论：转染抗HPV16E6－ribozyme的CaSKi－R细胞出现一定程度的生长抑制，且对顺铂的敏感性增加，而对泰素的敏感性没有发生改变。     

稳定表达的人自身免疫调节因子HeLa细胞的建立及鉴定

目的 :建立稳定表达人自身免疫调节因子 ( autoimmune regulator,AIRE)的细胞株。方法 :用 Fu GENE6转染试剂将含 AIRE c DNA的真核表达载体转染 He La细胞 ,经 G41 8筛选阳性克隆。继续培养 4周 ,用荧光显微镜观察、流式细胞仪 ( FACS)检测和免疫印迹法检测 AIRE基因在 He La细胞中的稳定表达情况。结果 :经荧光显微镜、流式细胞仪及免疫印迹法检测 ,证实 AIRE基因得到了稳定表达。结论 :在 Fu GENE6转染试剂的介导下 ,AIRE基因在 He La细胞内获得稳定表达     

miR-122-5p通过靶向NOP14抑制黑素瘤的细胞增殖

目的探讨在黑素瘤组织中miR-122-5p的表达情况,同时研究miR-122-5p对人黑素瘤细胞株SK-MEL-110和A375细胞 增殖、细胞周期及凋亡的调控效应。方法荧光定量PCR检测miR-122-5p在黑素瘤和色素痣组织中的表达;培养SK-MEL-110 和A375细胞,瞬时转染miR-122-5p inhibitor及阴性对照inhibitor后,荧光定量PCR检测miR-122-5p的表达,MTT及流式细胞 仪方法检测对细胞增殖、周期和凋亡的影响,荧光定量PCR和Western Blot法检测NOP14的mRNA和蛋白水平;应用双荧光素 酶基因报告法进一步验证NOP14是否为miR-122-5p的靶基因。结果miR-122-5p在人色素痣和黑素瘤组织中的相对表达量 分别为1.23±0.270和7.65±1.37。转染miR-122-5p inhibitor后,miR-122-5p在SK-MEL-110和A375细胞中的相对表达量分别 为0.21±0.08和0.17±0.05。miR-122-5p inhibitor可以显著抑制黑素瘤细胞株SK-MEL-110和A-375细胞的增殖能力,明显增加 G1期细胞的比例,但对SK-MEL-110和A-375细胞的凋亡没有明显影响。转染miR-122-5p inhibitor对NOP14 mRNA水平没 有明显的影响,但可以显著提高NOP14的蛋白水平表达。荧光素酶报告基因检测显示,共转染miR-122-5p mimics和野生型 psi-CHECK2-3′UTR质粒组相对荧光素酶活性为0.21±0.14,较NC和野生型psi-CHECK2-3′UTR质粒转染组（0.56±0.1）显著下 降（P<0.01）。结论miR-122-5p在黑素瘤组织中高表达,提示miR-122-5p可能参与黑素瘤的发生发展过程。miR-122-5p 可能 通过NOP14影响SK-MEL-110和A-375细胞的周期,进而抑制细胞的增殖。     

PYK2小干扰RNA对成年大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响

目的以富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,探讨PYK2小干扰RNA表达载体对心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的影响.方法以pAVU6 27质粒为载体,以PYK2为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,行酶切和测序鉴定.用PYK2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的成年大鼠心脏成纤维细胞,反转录聚合酶链反应和Western blot法检测PYK2基因和蛋白表达的改变,四唑盐比色法和3H-TdR掺入率检测转染后细胞的增殖和DNA合成情况.结果酶切鉴定和测序分析表明靶向PYK2的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染CFs后,PYK2的mRNA和蛋白水平较空载体转染的对照组显著下降;重组体转染CFs后MTT比色A值和3H-TdR掺入率均明显低于对照组.结论PYK2小干扰RNA表达载体是抑制心脏成纤维细胞增殖和DNA合成的有效手段,有利于深入探讨PYK2在心肌纤维化发生发展中的作用.     

真核表达载体pEGFP-VASP-lC的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-VASP-lC并稳定转染人宫颈癌细胞系HeLa细胞,为进一步探讨VASP-lC区介导的VASP的寡聚化在HeLa细胞迁移中的作用奠定基础。方法:用RT-PCR技术从人内皮细胞株ECV304细胞中获得VASP-lC区的cDNA并将其插入表达载体pEGFP-C1中,构建的重组质粒经脂质体介导转染HeLa细胞,Western blot鉴定VASP-lC区在HeLa细胞中的稳定表达。结果:RT-PCR成功地扩增出一条约310bp的片段,经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,荧光显微镜下观察到稳定转染的细胞发出较强绿色荧光,Western blot证明人VASP-lC区能以融合蛋白的形式在HeLa细胞中稳定表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-VASP-lC,获得了稳定表达人VASP-lC区基因的HeLa细胞克隆,便于进一步探讨VASP-lC区介导的VASP的寡聚化在HeLa细胞迁移中的作用。