重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN对胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响

目的 构建人细胞外金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）重组质粒,观察其在胃癌SGC-7901细胞中的表达及对细胞侵袭和迁移的影响。方法 从结肠癌细胞株SW-480中提取总RNA,通过RT-PCR获得EMMPRIN基因,连接至载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN,通过脂质体Lipofectamine 2000转染胃癌SGC-7901细胞;RT-PCR和Western blotting分别检测EMMPRIN mRNA和蛋白在SGC-7901细胞中的表达,Transwell实验检测EMMPRIN对SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响。结果 重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN构建成功,并在SGC-7901细胞中表达,RT-PCR和Western blotting检测示转染后SGC-7901细胞中EMMPRIN mRNA和蛋白表达均增加,Transwell实验检测示转染后SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力均显著增强。结论 EMMPRIN可显著增强肿瘤细胞的侵袭与迁移能力。     

RNAi技术沉默Bmi-1基因对人胃癌AGS细胞株的作用

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Bmi-1基因表达对人胃癌细胞株AGS增殖和侵袭能力的影响。方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL-GFP,构建针对Bmi-1基因shRNA序列的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1,转染AGS细胞,采用Western blot检测重组质粒对Bmi-1蛋白表达的影响,MTT法检测重组质粒对AGS细胞体外生长的抑制作用,PI单染法流式细胞术检测转染重组质粒后细胞凋亡与细胞周期的变化,小室侵袭实验检测AGS细胞侵袭能力变化。结果:成功构建了vshRNA-Bmi-1重组质粒,并成功转染AGS细胞抑制Bmi-1蛋白的表达。转染重组质粒后,AGS细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡增加,S期比例上升,细胞侵袭能力弱于非特异性转染组。结论:vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1蛋白在AGS胃癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭,促进其凋亡。     

真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1的构建及其在Siha细胞中的表达

目的：构建真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1并稳定转染人宫颈癌细胞系Siha细胞,检测MKRN1表达情况及对细胞增殖和凋亡的影响.方法：用RT-PCR技术从人胚肾细胞株HEK293细胞中获得MKRN1的cDNA并将其插入表达载体pEGFP-N1中;构建的重组质粒经脂质体介导转染Siha细胞;Western Blot鉴定MKRN1在Siha细胞中的稳定表达.结果：RT-PCR成功地扩增出一条约1477 bp的片段,经限制性内切酶酶切分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,荧光显微镜下观察到稳定转染的细胞发出较强绿色荧光,Western Blot证明人MKRN1能以融合蛋白的形式在Si-ha细胞中稳定表达.结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1,获得了稳定表达人MKRN1基因的Siha细胞克隆,为进一步研究人MKRN1的功能及其与细胞增殖及凋亡的关系提供了实验基础和重要的细胞模型.     

pEGFP-N1-Mxi1-0重组质粒的构建与表达

目的:构建Max作用蛋白1-0(Max interacting protein1-0,Mxi1-0) 的真核表达载体,在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)中表达,以期为深入研究Mxi1-0的作用及机制奠定基础。方法:通过RT-PCR方法从人肿瘤细胞HepG2中获得Mxi1-0基因的编码片段,连接至增强绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-N1)构建成pEGFP-N1-Mxi1-0。经酶切和测序鉴定重组质粒的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光显微镜观察和Western blot方法检测Mxi1-0表达,免疫荧光法检测Mxi1-0在NIH/3T3细胞内的定位情况。结果:经双酶切和核酸序列测序鉴定证实含Mxi1-0的重组真核表达载体pEGFP-Mxi1-0构建成功。重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞后,检测到Mxi1-0的成功表达,并证实Mxi1-0主要定位于NIH/3T3细胞质中。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Mxi1-0,并检测到Mxi1-0的表达,实验证明Mxi1-0定位于NIH/3T3细胞质中。     

人IL-37b基因真核表达载体的构建与表达

目的：构建pEGFP-N1/IL-37b真核表达载体,并检测其在THP-1细胞中的表达情况。方法：从人PBMCs中提取总RNA,利用RT-qPCR技术扩增出IL-37b基因编码区序列,克隆至pEGFP-N1真核表达载体,将构建的重组质粒pEGFP-N1/IL-37b转染到THP-1细胞中,通过RT-qPCR和Western blot检测IL-37的表达。结果：双酶切及基因测序结果显示 IL-37b基因正确插入真核表达载体pEGFP-N1中;RT-qPCR和Western blot结果显示转染THP-1细胞后,IL-37表达水平明显升高（P＜0.01）。结论：成功构建了新型抗炎因子IL-37真核表达载体pEGFP-N1/IL-37b,为进一步研究IL-37功能及与相关疾病的关系奠定基础。     

高表达Kiss-1对结肠癌SW480细胞增殖和迁移的影响

目的 探讨高表达Kiss-1基因对结肠癌SW480细胞增殖及迁移的影响.方法 将pEGFP-N1-Kiss-1重组质粒转染至SW480细胞设为实验组,将pEGFP-N1质粒转染至SW480细胞设为阴性对照组,将SW480细胞设为空白对照组,采用Western blot法检测各组细胞中Kiss-1表达量;采用CCK-8法分析Kiss-1对SW480细胞增殖的影响;并用划痕实验评估Kiss-1对SW480细胞迁移能力的影响.结果 将pEGFP-N1和pEGFP-N1-Kiss-1重组质粒转染至SW480结肠癌细胞,检测实验组Kiss-1表达量增加,实验组细胞增殖率明显低于对照组(P＜0.05),且实验组细胞划痕损伤愈合的速度明显下降.结论 高表达Kiss-1可抑制结肠癌SW480细胞的增殖,降低细胞迁移速度.     

过表达Mxi1对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建含有Max结合蛋白1（Mxi1）基因的重组慢病毒载体,并探讨过表达Mxi1基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。方法：利用DNA重组技术将Mxi1基因克隆至慢病毒载体,经酶切和测序鉴定后,将重组质粒与慢病毒辅助包装元件质粒共转染293T 细胞,获得含 Mxi1基因的重组慢病毒。重组慢病毒感染人胃癌SGC-7901细胞,荧光显微镜下观察感染效率,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Mxi1、cyclinB1和caspase-8的基因表达,免疫印迹法（Western blot）检测Mxi1蛋白的表达。CCK-8比色法和流式细胞术分别检测Mxi1 基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。结果：成功构建含 Mxi1基因的慢病毒表达载体,RT-PCR和Western blot检测到Mxi1 基因和蛋白的表达。RT-PCR结果显示,过表达Mxi1 的SGC-7901细胞与空白对照细胞及过表达空病毒对照细胞相比,细胞内cyclinB1的mRNA表达水平明显降低,而caspase-8的 mRNA表达水平显著升高。CCK-8实验和流式细胞术检测结果显示,过表达Mxi1的SGC-7901细胞与空白对照细胞及过表达空病毒对照细胞相比,细胞增殖活性明显降低,细胞凋亡率显著升高。结论：成功构建Mxi1慢病毒载体且有效转染SGC-7901细胞,过表达Mxi1 可以抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡。     

pEGFP-N1-亚麻苦甙水解酶重组真核表达载体的构建及亚麻苦甙水解酶在SGC-7901细胞中的表达

目的:构建携带亚麻苦甙水解酶(lis)基因的重组真核表达载体,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,导入SGC-7901细胞中表达。方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该基因全长定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。用电穿孔法转染体外培养的SGC-7901细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达。用PCR检测lis转录水平的表达,用Western blot法验证lis蛋白水平的表达。结果:酶切和测序证实pEGFP-N1-lis重组质粒构建正确,重组质粒载体在SGC-7901细胞中获得了表达,表达的融合蛋白具有lis和EGFP的双重活性。结论:通过基因克隆方法成功地构建了pEGFP-N1-lis重组质粒载体,并且在SGC-790细胞中稳定表达。     

pEGFP-N1-PP1α真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

目的 构建人PP1α基因真核表达载体, 并观察其在人骨肉瘤细胞株(U-2OS)中的表达,为进一步研究PP1对骨肉瘤细胞凋亡影响提供基础.方法 提取U-2OS细胞中总RNA,RT-PCR扩增PP1α并克隆至pEGFP-N1载体,鉴定出阳性克隆送测序, 以重组质粒转染U-2OS细胞,通过Western blot检测转染细胞中PP1α的表达.结果 成功扩增PP1α基因大小片段,重组质粒pEGFP-N1-PP1α的酶切鉴定及测序结果均证明PP1α基因成功克隆到真核表达载体中,Western blot结果证实转染重组质粒后的U-2OS细胞PP1α蛋白表达水平增强.结论 实验将pEGFP-N1-PP1α质粒转染到U-2OS细胞,可以在U-2OS细胞中获得PP1α蛋白增强表达.     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

pEGFP-N1/Arf6-T27N重组真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞株中的表达

目的:构建含有Arf6-T27N基因的重组真核表达载体,并检测Arf6-T27N蛋白在MDA-MB-231人乳腺癌细胞中的表达情况,以期为深入研究Arf6在乳腺癌细胞迁移中的作用机制奠定基础?方法:从含Arf6-T27N基因的真核表达质粒pXS-Arf6-T27N中扩增出Arf6-T27N基因,插入pEGFP-N1载体中构建成pEGFP-N1/Arf6-T27N,利用脂质体将其转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞?用新霉素筛选稳定表达的细胞系,Western blot确定重组蛋白表达,并用Boyden chamber小室实验检测转染Arf6-T27N的MDA-MB-231人乳腺癌细胞迁移能力的改变?结果:限制性内切酶鉴定和核酸定列测定证实成功构建了含Arf6-T27N的重组真核表达载体pEGFP-N1/Arf6-T27N?以重组质粒稳定转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞,能检测到Arf6-T27N蛋白的表达,且Arf6-T27N蛋白能明显抑制MDA-MB-231人乳腺癌细胞的迁移?结论:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/Arf6-T27N,稳定转染Arf6-T27N的MDA-MB-231人乳腺癌细胞可检测到其蛋白水平的稳定表达,重组质粒介导的Arf6-T27N蛋白能明显抑制MDA-MB-231细胞的迁移?     

小鼠HuR真核表达载体构建及对Lewis肺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 构建小鼠同源的人抗原R (HuR)基因真核表达载体,观察HuR过表达对Lewis肺癌(LLC)细胞增殖和侵袭的影响.方法 从LLC细胞中抽提总RNA,RT-PCR扩增HuR cDNA,基因工程方法将PCR片断克隆至真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点.重组质粒经EcoRI和SmaI双酶切鉴定和测序后,使用LipofectamineTM2000转染LLC细胞.Western blotting检测HuR在细胞中的表达.MTT和Transwell系统分别检测细胞增殖和侵袭能力.结果 经酶切、测序鉴定,小鼠HuR基因正确插入到pEGFP-N1的多克隆位点,获得pEGFP-HuR;Western blotting显示转染组与未转染组比较,HuR蛋白表达、LLC细胞增殖能力和侵袭能力均显著增强.结论 HuR过表达可提高肿瘤细胞的增殖和侵袭能力.     

先天性长QT综合征KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆先天性长QT综合征KCNE1基因，并构建真核表达载体。方法：从人胎盘组织中提取总RNA，经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增出KCNE1基因；采用T-A克隆法，将KCNE1基因克隆入pCR2．1 TOPO载体中，经限制性酶切基因重组后，构建真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1，经DNA测序鉴定，用Effectene转染试剂介导转染HEK293细胞。结果：采用基因克隆和重组法，得到了KCNE1真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1，并在HEK293细胞中得到了表达。结论：KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建和表达为进一步的功能研究奠定了基础。     

大鼠GAP-43基因的克隆及其在COS-7细胞的表达

目的: 克隆大鼠GAP-43基因,构建其真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达。方法: 采用RT-PCR方法,以大鼠少突胶质前体细胞RNA为模板,扩增GAP-43基因,定向克隆到pEGFP-N3载体中。以LipofectamineTM 2000试剂转染pEGFP-N3-GAP-43表达载体至COS-7细胞中进行瞬时真核表达。以免疫荧光方法鉴定GAP-43的表达。结果: 从大鼠少突胶质前体细胞中克隆到序列正确的GAP-43全长编码序列。所构建的GAP-43质粒在COS-7细胞中获得高效表达。结论: 大鼠GAP-43基因的克隆、真核表达载体的构建及在COS-7中的表达获得成功,为进一步研究其功能,尤其是探讨其在少突胶质细胞发育中的作用奠定了基础。     

DEC1基因真核表达质粒的构建及对胃癌细胞增殖的影响

目的构建人分化型胚胎软骨发育基因DEC1真核表达载体,探讨DEC1基因对胃癌细胞增殖的影响。方法提取人胃癌细胞MGC-803总RNA,RT-PCR扩增获得DEC1基因,将DEC1基因插入pGEM-T载体,再插入真核表达质粒pcDNA3,将成功构建的pcDNA3-DEC1载体介导转染MGC-803细胞。通过RT-PCR和Westernblot分别检测转染后细胞DEC1在mRNA和蛋白水平的表达;MTT法、免疫细胞化学法检测过表达DEC1基因后MGC-803细胞增殖的变化。结果转染pcDNA3-DEC1质粒的MGC-803细胞DEC1 mRNA和蛋白水平明显升高(P<0.05);MTT试验、ki-67免疫细胞化学染色显示转染后细胞增殖能力明显升高(P<0.05)。结论 DEC1的过表达能明显增强胃癌细胞MGC-803的增殖能力。     

Dnmt1基因对胃癌细胞株AGS细胞增殖凋亡的影响

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以Dnmt1(DNA methyltransferase 1)为靶基因,设计构建重组体pshRNA-Dnmt1,研究其对胃癌AGS细胞增殖凋亡的影响.方法:设计shRNA的寡核苷酸片断,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体pshRNA-Dnmt1,转染胃癌细胞株AGS,用Western Blot检测DNMT1蛋白水平变化,用RT-PCR法评估mRNA水平,MTT法动态监测活细胞数,AO/EB法、电镜和TUNEL观察其促凋亡作用.结果:成功构建重组质粒pshRNA-Dnmt1 后,进行序列分析得到确证. RT-PCR检测结果证实: 重组质粒pshRNA-Dnmt1 对胃癌AGS细胞中Dnmt1基因的转录有着明显抑制作用,转染后24 h抑制率在21.63%左右;48 h为52.97%;72 h为72.06%. Western Blot检测结果表明:pshRNA-Dnmt1 转染AGS细胞后24 h出现DNMT1蛋白表达量减少,抑制率为28.24%;48 h为68.54%;72 h为81.47%. MTT结果提示: 转染后24, 48和72 h细胞数存活率为对照组的79.49%, 51.63%和39.16%. AO/EB法、电镜和TUNEL都看见大量典型的凋亡和坏死细胞,转染后48 h的细胞凋亡率由对照组的5%上升为35%左右.结论:重组质粒pshRNA-Dnmt1 能特异有效地抑制胃癌细胞株AGS内Dnmt1基因的表达,能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,从而为肿瘤的基因治疗开辟了新途径.