EBV—LMP1反义基因真核表达载体的构建及序列鉴定

目的：构建ＥＢ病毒ＬＰＭ１反义基因的真核表达载体。方法：通过ＰＣＲ方法,扩增ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因的第一外显子片段,使之反向克隆到质粒ｐｃＤＮＡ３．１的多克隆位点中。经限制性酶切、ＰＣＲ扩增和测序鉴定重组载体。结果：酶切产物和ＰＣＲ产物的凝胶电泳显示４００ｂｐ左右的目的基因片段,测序结果显示与已知ＬＭＰ１基因序列一致。结论成功构建了ＬＭＰ１反义基因的真核表达载体。     

EB病毒3种全基因的扩增,克隆及表达

目的：扩增克隆及表达ＥＢ病毒（ＥＢＶ）３种（ＤＮＡ酶、甙激酶及ＨＢＲＦ１）全基因片段。方法：以Ｂ９５－８细胞株ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增３种目的基因。酶切鉴定后分别与高效表达载体ＰＢＶ２２１连接，用大肠杆菌ＪＭ１０３或ＨＢ１０１作为围论的宿主菌。抗氨苄青霉素培养形成单菌落后放大培养，根据重组质粒的电泳 行为粗筛，再双酶切。结果：各种阳性菌经３０℃→４２℃变温诱导培养，超声破碎后其上清液经十二烷基磺酸     

人CD80基因的cDNA克隆及其在肿瘤细胞中的表达

采用巢式ＰＣＲ的方法从Ｒａｊｉ细胞中扩增出人ＣＤ８０ ｃＤＮＡ，并将这一ｃＤＮＡ克隆入载体ｐＵＣ１９中，经ＰＣＲ扩增和限制性酶切分析，进行初步鉴定后，再将入ＣＤ８０ｃＤＮＡ克隆到ｐｃＤＮＡ表达载体上，构建成ｐＣＤ－ＣＤ８０重组质粒。应用脂质本介导的基因转移技术将这一表达载体导入小鼠黑色素瘤Ｂ１６细胞后，用ＳＡＢＣ法进行瞬时表达的检测。结果表明，转染后４８ｈ就具有明显人ＣＤ８０基因的表达产物。     

PCR克隆EB病毒潜伏膜蛋白-1基因

目的：构建ＥＢ病毒潜伏膜蛋白－１重组表达质粒。方法：ＰＣＲ克隆技术,即用ＰＣＲ方法从Ｂ９５－８细胞中钓出ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因ＤＮＡ序列,然后定向克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１中,以此构建成ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＭＰ重组质粒。结果：经酶切鉴定,确定已获得重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＬＭＰ１。结论：在真核表达质粒中已成功地克隆了ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因。     

构建TA载体快速克隆PCR产物

目的　为了快速克隆ＰＣＲ产物,本实验构建了简单、方便的 ＴＡ载体。方法 ＰＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（－）经 ＥｃｏＲ Ｖ酶切形成平端切口,在ＴａｑＥ的催化下加一个ｄＴＭＰ形成３’端带有Ｔ的粘端载体,在Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用下,将ＰＣＲ产物互补连接于ＴＡ载体上,重组质粒转化细菌,碱裂解法提取重组质粒ＤＮＡ,酶切及电泳鉴定。结果ＴＡ载体成功地克隆了ＰＣＲ产物。结论构建的ＴＡ载体简单、方便,可以克隆任何ＰＣＲ产物。     

pcDNA3.1(+)GDNF真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

目的　构建ｐｃＤＮＡ3.1(+)胶质细胞源性神经营养因子 (ＧＤＮＦ)真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达。方法　将ＧＤＮＦ逆转录聚合酶链式反应 (ＲＴ ＰＣＲ)产物克隆至ｐｃＤＮＡ3.1(+)真核表达载体上 ,经酶切鉴定及测序分析并以ＦｕＧｅｎｅ 6介导法转染真核细胞 ,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性。结果　ＲＴ ＰＣＲ产物为 6 40ｂｐ特异片段 ,ｐｃＤＮＡ3.1(+)ＧＤ ＮＦ重组体经酶切后分别出现 6 40ｂｐ和 30 0ｂｐ片段 ,测序分析与文献报道结果完全一致 ,表明重组ｐｃＤＮＡ3 .1(+)ＧＤＮＦ表达质粒克隆成功。可见…     

免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库基因的亚克隆与鉴定

目的 亚克隆免疫筛选日本血吸虫ｃＤＮＡ文库得到的基因。方法 在体外将血吸虫ｃＤＮＡ文库基因的ＰＣＲ产物和ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转染大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,经抗生素及呈色底物Ｘ－ｇａｌ粗筛,再用限制性内切酶及ＰＣＲ方法进一步鉴定。结果 成功地将文库中４个大小不同的日本血吸虫基因片段连接到载体中,获得４个重组子。结论 为可能编码保护性抗原的血吸虫基因测序和将其亚克隆入真核表达质粒奠定基础。     

日本血吸虫26ku谷胱甘肽硫—转移酶基因的克隆及分析

目的 扩增日本血吸虫２６ｋｕ谷胱甘肽硫－转移酶（Ｓｊ２６ＧＳＴ）基因片段,构建其重组原核载体,以研制ＳｊＧＳＴ重组克隆。方法 根据已知基因序列设计一对引物,运用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增Ｓｊ２６ＧＳＴ目的基因ｃＤＮＡ片段,将其克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＫＳ）质粒中,并经酶切、ＰＣＲ和测序鉴定。结果 获得ＧＳＴ－ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＫＳ）重组克隆。结论 本实验获得Ｓｊ２６ＧＳＴ重组克隆,为进一步研     

带有蛋白标签的原核表达载体构建

目的：构建带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标签的ｐＴＣ０１Ｅ载体。方法：从噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中ＰＣＲ扩增出于Ｅ－ｔａｇ基因片段，经Ｋｌｅｎｏｗ片段补平和ＳａｃＩ消化后，将含有Ｅ－ｔａｇ序列的３８１ｂｐ片段克隆至分泌型原核表达载体ｐＴＣ０１的ＳａｃＩ－ＳａｍＩ位点中。结果：构建成带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标准签的ｐＴＣ０１Ｅ载体，限制性内切酶图谱和ＤＮＡ序列分析表明构建过程正确，结论：用ＰＣＲ－克隆策略获得了Ｄ     

人4-1BB-hIgG1Fc融合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体。方法：ＰＣＲ扩增人４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ基因片段，用ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔＩ酶切４１ＢＢ胞膜外区，ＰｓｔＩ　、ＥｃｏＲ　Ｉ　酶切ｈＩｇＧ１Ｆｃ　，ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ　酶切ｐＣＤＮＡ３，纯化后的酶切产物经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选阳性克隆，ＰＣＲ及测序鉴定。结果：连接反应产物转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选出多个阳性克隆；分别以针对４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ的引物进行ＰＣＲ扩增，电泳后观察到一５５８ｂｐ、７０８ｂｐ的特异性条带，与４１ＢＢ胞膜外区和ｈＩｇＧ１Ｆｃ相符，提示构建成功。进一步测序分析证明克隆在ｐＣＤＮＡ３　质粒中的４１ＢＢ和ｈＩｇＧ１Ｆｃ序列和读码框架正确，无基因突变。结论：成功构建人４１ＢＢ胞膜外区ｈＩｇＧ１Ｆｃ融合蛋白真核表达载体，为表达４１ＢＢ融合蛋白奠定基础。     

人重组骨形态发生蛋白Ⅲ在大肠杆菌中的表达及活性测定

本文报道了利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人重组骨形态发生蛋白Ⅲ。运用ＰＣＲ技术，从质粒ｐＳＰ６４／ｈＢＭＰ３中扩增出约０．３３ｋｂ的ｈＢＭＰ３ｃＤＮＡ片断，然后亚克隆到表达质粒ｐＭＳ３１ｂ申，在大肠杆菌一成功地高效表达出人ＢＭＰ３融合蛋白，表达产物具有体内诱导异位化骨的趋势。     

人骨形成蛋白-2基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的：克隆人骨形成蛋白-2（BMP-2）基因cDNA，构建含BMP-2基因的重组腺病毒载体。方法：采用RT-PCR方法克隆BMP-2基因cDNA，并插入克隆载体pGEM-T中进行全序列分析。将BMP-2基因cDNA克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中，构建pShuttle-BMP2重组质粒，再将其中的表达盒克隆入Adeno-X腺病毒DNA中，获得重组腺病毒DNA-pAd-BMP。 结果：成功地克隆长约1 200 bp的BMP-2 cDNA，并成功地构建其腺病毒载体，经线性化的pAd-BMP2 DNA转染HEK293细胞，包装、扩增后得到人骨形成蛋白-2重组腺病毒，其滴度约为1×10¹¹nfu•L^-1，该滴度可满足进一步的BMP-2成骨作用的研究。结论:成功地构建BMP-2腺病毒载体。     

hBMP-7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖和碱性磷酸酶合成的影响

目的探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)基因转染对兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcell,BMSc)增殖和向成骨细胞分化的影响。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染BMSc,免疫组织化学方法检测hBMP-7蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况。结果经BMP-7基因转染的兔BMSc有hBMP-7的阳性表达,增殖能力无明显改变(P>0.05),但其合成碱性磷酸酶的能力得到显著提高,与空载体病毒液转染、未经转染的BMSc相比差异有显著性(P<0.01)。结论经BMP-7基因转染的BMSc能够表达外源BMP-7,hBMP-7基因转染能够促进体外培养的BMSc向成骨细胞转化,可用于以BMSc为种子细胞的组织工程化骨组织的构建。     

人透明带蛋白3真核表达载体的构建

目的 构建人ZP3蛋白(从第23位到348位氨基酸)真核表达载体,用于在毕赤酵母中表达重组人ZP3蛋白.方法 通过PCR方法扩增编码人ZP3蛋白的基因,并将其克隆入毕赤酵母表达载体pPICZ构建真核表达质粒pPICZα-hZP3.结果 经PCR扩增获得的hZP3基因大小为978 bp,其DNA测序结果分析表明:pPIC...     

重组人骨形成蛋白2在皮肤成纤维细胞中的表达

目的 构建人骨形成蛋白2(BMP2)的真核表达载体以探讨成纤维细胞表达BMP2的情况。方法 构建携带人BMP2基因的真核表达载体pRK5-hBMP2，并将其转染CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后，采用RT-PCR方法检测人BMP2在mRNA水平上的表达。结果 RT-PCR显示转染后的CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞可以有效地转录BMP2 mRNA。结论 含有人BMP2 cDNA的重组质粒pRK5-hBMP2转染正常人皮肤成纤维细胞后可以有效地表达BMP2。     

人骨形态发生蛋白12前体蛋白cDNA的克隆及序列分析

目的克隆人骨形态发生蛋白12前体蛋白的基因。方法根据Genbank人骨形态发生蛋白12的基因序列合成两条引物,从人胎盘组织中提取总RNA,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出长920 bp编码人骨形态发生蛋白12(BMP12)前体蛋白的基因序列。将所得的基因片段插入载体pTARGETTM质粒中并转化大肠杆菌JM109,提取重组质粒进行鉴定并测序。结果RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示一长约920 bp的条带,阳性克隆质粒经PCR扩增出约920 bp的片段,全自动DNA测序结果表明和Genbank中的序列完全相符。结论通过RT-PCR可从人胎盘组织中成功地克隆出人BMP12前体蛋白基因,基因序列完全正确。     

人BPI活性片段基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

目的构建人杀菌/通透性增加蛋白(BPI)N端活性片段cDNA序列的真核表达载体并了解其在COS-7细胞中的表达. 方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总 RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPI N端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染 COS-7细胞,免疫荧光法鉴定BPI的表达. 结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,转染实验表明重组质粒能在COS-7中表达出具有活性的 BPI片段. 结论 BPI活性片段真核表达载体构建及表达成功,为下一步BPI功能的研究奠定了基础.     

CO-TRANSFECTION OF RAT BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS WITH HUMAN BMP2 AND VEGF165 GENES

Objective To explore the feasibility and efficacy of lentivirus-mediated co-transfection of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) with human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) gene and human bone morphogenetic protein 2 (hBMP2) gene. Methods The hVEGF165 and hBMP2 cDNAs were obtained from human osteosarcoma cell line MG63 and cloned into lentiviral expression vectors designed to co-express the copepod green fluorescent protein (copGFP). The expression lentivector and packaging Plasmid Mix were co-transferred to 293TN cells, which produced the lentivirus carrying hVEGF165 (Lv-VEGF) or hBMP2 (Lv-BMP), respectively. MSCs of Wistar rats were co-transfected with Lv-BMP and Lv-VEGF (BMP+VEGF group), or each alone (BMP group and VEGF group), or with no virus (Control group). The mRNA and protein expressions of hVEGF165 and hBMP2 genes in each group were detected by real-time PCR and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results Lentiviral expression vectors carrying hVEGF165 or hBMP2 were correctly constructed and confirmed by restriction endonucleses analysis and DNA sequencing analysis. A transfer efficiency up to 90% was archieved in all the transfected groups detected by the fraction of fluorescent cells using fluorescent microscopy. From the results generated by real-time PCR and ELISA, VEGF165 and BMP2 genes were co-expressed in BMP+VEGF group. No significant difference of BMP2 expression was detected between BMP+VEGF and BMP groups (P>0.05). Similarly, there was no significant difference of VEGF165 expression between BMP+VEGF and VEGF groups (P>0.05). Conclusion VEGF165 and BMP2 genes were successfully co-expressed in MSCs by lentivirus-mediated co-transfection, which provided a further foundation for the combined gene therapy of bone regeneration.     

人骨形态发生蛋白12前体蛋白cDNA的克隆及序列分析

目的 克隆人骨形态发生蛋白12前体蛋白的基因。方法 根据Genbank人骨形态发生蛋白12的基因序列合成两条引物，从人胎盘组织中提取总RNA，用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增出长920bp编码人骨形态发生蛋白12(BMP12)前体蛋白的基因序列。将所得的基因片段插人载体pTARCET^TM质粒中并转化大肠杆菌JM109，提取重组质粒进行鉴定并测序。结果 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示一长约920bp的条带．阳性克隆质粒经PCR扩增出约920bp的片段，全自动DNA测序结果表明和Genbank中的序列完全相符。结论 通过RT-PCR可从人胎盘组织中成功地克隆出人pMP12前体蛋白基因，基因序列完全正确。     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。