Intracellular retention of human melanocortin-4 receptor: a molecular mechanism underlying early-onset obesity in F261S pedigree of Chinese

Objective To investigate how F261S mutation identified from Chinese obese patients affects the function of melanocorfin 4 receptor （MC4R） and to analyze the obesity-related phenotypes in subjects carrying the F261S mutation. Methods F261S mutant of MC4R was generated by site-directed mutagenesis. Plasmids encoding wild-type or F261S mutant of MC4R were transfected into HEK293 and COS-7 cells to examine their functional characteristics. Signaling properties of F261S MC4R were assessed by measuring intracellular cAMP levels in response to α-MSH stimulation. Cell surface expression of F261S MC4R was compared with that of wild-type MC4R. Clinical examinations were performed in subjects carrying F261S mutation and in non-mutated controls. Results The a-MSH-stimulated reporter gene activity was significantly reduced in cells expressing F261S MC4R, with a maximal response equal to 57% of wild-type MC4R. The F261S mutation also led to a significant change in the EC50 value compared with the wild-type receptor （P〈0.01）. Immunofluorescent assay revealed a marked reduction in plasma membrane localization of the MC4R in cells expressing the F261S mutant receptor. The resting metabolic rate and fat composition of the mutant carriers were not significantly different from those of the non-mutated obese controls. Conclusions The decreased response to α-MSH due to the intracellular retention of MC4R may cause early-onset obesity in the F261S pedigree of Chinese.     

应用放射性免疫方法建立抗早老性痴呆药的M1受体筛选模型

目的 :建立M1受体筛选模型 ,用于抗早老性痴呆药物的筛选。方法 :在人胚肾细胞上表达人源M1受体 ,通过检测胞内cAMP来监测受体的激动情况。使用外源性的3H cAMP竞争胞内的cAMP结合位点。使用氯化乙酰胆碱作为阳性药来确证模型的可靠性。结果 :初步建立了M1受体人胚肾细胞表达体系。使用不同浓度的氯化乙酰胆碱 (10 -9～ 10 -4mol/L) ,胞内的cAMP浓度有相关性变化 (10 3 43× 10 -4 ～ 3 3 75 4× 10 -4 pmol/ μl)。 结论 :本筛选模型对M1受体激动剂有阳性反应 ,可用于抗早老性痴呆药物的筛选     

云南省中华按蚊电压门控钠离子通道kdr突变频率调查

目的 掌握云南省中华按蚊电压门控钠离子通道击倒抗性（knockdown resistance, kdr）基因突变情况。 方法 2018—2019年,在云南省罗平县、绥江县、腾冲市、盈江县、元江县和勐腊县采集蚊虫。采集的蚊虫经形态学鉴定为中华按蚊,用试剂盒提取成蚊基因组DNA。DNA模板经PCR扩增后测序,测序结果经NCBI同源性比对确定为中华按蚊。扩增中华按蚊钠离子通道ⅡS5、ⅡS6片段后测序,测序结果用DNAMAN软件进行多序列比对,用BioEdit软件对测序峰图逐条分析突变情况,确定kdr等位基因类型和基因型并计算频率。结果 本次调查扩增得到287条序列,测序峰图显示1014位点共有3种等位基因,包括野生型TTG/L（89.20%）和突变型TTT/F（9.76%）、TCG/S（1.04%）;5种基因型：野生型纯合子L/L（85.02%）,突变型纯合子F/F（6.27%）、S/S（0.35%）,突变型杂合子L/F（6.97%）和L/S（1.39%）。在6个采集点中除绥江县外,均以野生型等位基因TTG/L为主。腾冲市野生型等位基因频率最高（100.00%）,即未检测到突变,而其余各县1014位点均出现不同程度突变。绥江县突变型等位基因频率最高,达到55.68%。5种基因型中,罗平县、勐腊县和绥江县各有2种突变型,盈江县和元江县有1种突变型杂合子L/F。结论 云南省大部分地区中华按蚊kdr基因仍以野生型L1014（TTG/L）为主,kdr突变类型主要为L1014F,其次是L1014S,且突变频率低于中国中部省份。     

人血清蛋白与两种天然抗癌有效成分的相互作用

本文应用平衡透析法在pH7.4,振动频率为140～160次/min,25℃恒温条件下,研究了喜树碱和秋水仙碱两种天然抗癌有效成分与人血清蛋白的相互作用.实验结果表明,喜树碱和秋水仙碱均能透过Viskisg纤维素膜.秋水仙碱与人血清蛋白二者的浓度均为1×10~(-5)～5×10~(-5)mol/L时,其结合率几乎为零,而喜树碱与人血清蛋白则有较强的结合力;当喜树碱的浓度为1×10~(-5)～2×10~(-5)mol/L,人血清蛋白浓度条5×10~(-6)～1×10~(-4)mol/L时,结合常数为9.58×10~4mol~(-1),并且喜树碱在人血清蛋白分子上有唯一的结合部位,经荧光光法测知,该结合部位在人血清蛋白分子的U部位.     

福建省福州市和莆田市2020年白纹伊蚊击倒抗性基因突变分析

目的 了解福州市和莆田市登革热伊蚊监测点白纹伊蚊击倒抗性基因的突变情况。方法 2020年5—6月在福州市（晋安区、永泰县）和莆田市（涵江区、仙游县）采集白纹伊蚊幼虫,饲养繁殖,使用成蚊接触筒法实验结束的F₁代单只雌蚊样本,提取DNA,PCR扩增电压门控钠离子通道（VGSC）基因部分片段,测序分析击倒抗性（knockdown resistance, kdr）基因突变情况。结果 福州市和莆田市共检测491只白纹伊蚊,其中VGSC基因第Ⅱ结构域及第Ⅲ结构域的I1532位点未发现突变位点,第Ⅲ结构域的F1534位点存在突变。F1534位点有4种等位基因,即野生型TTC/F（252,25.66%）、突变型TCC/S（722,73.52%）、TGC/C（3,0.31%）和CTC/L（5,0.51%）;7种基因型,分别为野生型纯合子F/F（39,7.94%）,野生/突变型杂合子F/C（1,0.20%）、F/S（172,35.03%）和F/L（1,0.20%）,突变型杂合子S/C（2,0.41%）和S/L（4,0.81%）,突变型纯合子S/S（272,55.40%）。F1534位点突变等位基因TCC/S在4个种群中均有发现,且莆田市涵江区和仙游县的频率高于福州市晋安区和永泰县的频率。晋安区和永泰县F1534位点存在5种基因型,涵江区和仙游县则只有3种。野生/突变型杂合子F/S和突变型纯合子S/S在4个种群中均存在,野生型纯合子F/F只在涵江区中没有发现。晋安区和永泰县基因型以F/S为主,涵江区和仙游县以S/S为主。结论 福州市和莆田市kdr基因突变频率高,以F1534S突变类型为主。提示应密切关注当地蚊虫抗性水平,减少拟除虫菊酯类杀虫剂的使用,科学合理地使用杀虫剂。     

正常人外周血单个核细胞白细胞介素-2受体荧光定量方法研究(简报)

本文探索了应用荧光分光光度计定量测定正常人外周血单个核细胞白细胞介素-2受体(IL_2R)的方法及其条件。以PHA与ConA诱导单个核细胞IL_2R表达的最适细胞浓度为3×10~6/ml。PHA和ConA最适浓度分别为100μg/ml和10μg/ml,PHA诱导较ConA为优。PHA诱导细胞IL_2R表达24小时达到高峰,尔后逐渐下降。第一抗体(抗—Tac)与第二抗体(荧光抗体)的最适浓度分别为1:50和1:32,两种抗体与单个核细胞孵育时间分别以20和10分钟为好。检测了同一标本不同复管的细胞(1×10~6)IL_2R结合荧光抗体M为(5.22±0.45)×10~(-10),变异     

气隙式气敏电极的制备及性能

一种基于酸碱平衡的气隙式气敏电极,用标准玻璃磨口件及平头pH电极改制,性能优良,制作简便。用作氨电极时(以0.02mol/L NH_4Cl为中介液),测得NH_4Cl浓度在1×10~(-4)～1×10~(-1)mol/L,电极线性良好,30℃时斜率为56mV/PX;当用作二氧化碳电极时(以0.02mol/L NaHCO_3为中介液),测得NaHCO_3浓度在5×10~(-3)～5×10~(-2)mol/L,电极线性良好,级差为1.04pH。     

人外周血单个核细胞白细胞介素-2受体的荧光定量法研究

本文探索了应用荧光分光光度计定量测定正常人外周血单个核细胞介素-2受体(IL_2R)的方法及其条件.以PHA与ConA诱导单个核细胞IL_2R表达的最适细胞浓度为3×10~6/ml:PHA和ConA最适浓度分别为100μm/ml和10μg/ml,PHA诱导较ConA为优.PHA诱导细胞IL_2R的表达24h达到高峰,尔后逐渐下降.第一抗体(抗—Tao)和第二抗体(荧光抗体)与单个核细胞孵育时间分别以20min和10min为好.检测同一标本不同复管的细胞(1×10~6)IL_2R结合荧光抗体mol(简称M)为5.22±0.45×10~(10),变异系数(CV)为8.6％,表明该法稳定性较好.测定5例正常人细胞(1×10~6)IL_2R结合荧光抗体M为4.8±0.97×10~(10).CV为20.2％,结果表明该法能较客观检测出不同个体IL_2R表达.     

山莨菪碱对乙酰胆碱和去甲肾上腺素引起的兔虹膜释放前列腺素的影响

本文报告了654-2对Ach及NE引起的兔虹膜释放PGE_2及6-Keto-PGF_1α作用的影响。Ach及NE使虹膜释放PG_s增加,654-2对Ach释放PG_s的作用呈剂量依赖性抑制,当654-2浓度为3×10~(-5)mcl/L时,Ach(5×10~(-5)mol/L)引起的PGE_2及6-Keto-PGF_1α的释放量分别降低31％和30％。654-2浓度高于6×10~(-5)mol/L时显著抑制NE(5×10~(-5)mol/L)释放虹膜PG_5的作用,当654-2浓度为3×10~(-4)mol/L时,使NE增     

连续顶空气相色谱法测定微生物活性研究

以大肠杆菌(E.coli)为实验菌种,CO_2为测定指标.10~(?)个/ml菌液浓度的萄葡糖肉汤培养液。在顶空分析瓶中38℃培养。每隔1h顶空气相色谱法(HS-GC)测定CO_2,CO_2随时间变化相关曲线:Y=a+bx+cx~2;(r>0.98)。对4次测定曲线方程作统计分析,差异无显著性(P>0.05).CO_2检出限为2mmol/L。重金属对E.coli生长有抑制作用,其影响顺序为As_2O_3>CdCh_2>Fb(Ac))_2,阈浓度分别为3.10×10~(-5)mol/L、1.6×10~(-4)mol/L、1.33×10~(-3)mol/L。     

HEK293细胞上表达的人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2和亚型4的电生理

目的将人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2（hHCN2）和亚型4（hHCN4）的基因表达于HEK293细胞系上,观察其表达的通道的电生理特点。方法包含目的基因hHCN2或hHCN4的cNDA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,穿梭载体和病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌重组,病毒经过包装和扩增后分别转染HEK293细胞。利用全细胞膜片钳技术,记录分别转染了hHCN2和hHCN4的HEK293细胞上的超极化激活钾电流（If）。结果转染hHCN2和hHCN4的HEK293细胞上产生超极化激活的内向电流。两种通道的半数最大激活电压分别为-114．8mV±3．3mV和-125．9mV±2．9mV,反向曲线斜率分别为11．1mV±1．2mV和13．7mV±1．3mV。两者的激活动力学明显不同,刺激电压为一110mV时,通道的激活时间常数分别为0．99s±0．21s和8．47s±2．85s。两种通道对钠离子和钾离子的相对通透性分别为0．40和0．34。两种电流均可被2mmol／L的氯化铯（CsCI）阻断。结论目的基因hHCN2和hHCN4在HEK293细胞上成功表达,形成的两种通道具有明显不同的激活动力学。     

14-3-3/HIP-55复合体增强HIP-55蛋白稳定性

目的:用双分子荧光互补及免疫共沉淀技术验证HIP-55与14-3-3在HEK293细胞中存在相互作用,并进一步研究其生物学意义. 方法:利用GATEWAY系统构建PDEST-N-Venus-HIP-55WT(野生型),PDEST-N-Venus-HIP-55AA(突变体S269A/T291A),PDEST-GST-HIP-55WT及PDEST-C-Venus-14-3-3τ重组质粒,利用双分子荧光互补及免疫共沉淀技术检测两者的相互作用,同时应用14-3-3蛋白相互作用抑制肽R18和HIP-55蛋白突变体( HIP-55AA突变体S269A/T291A不能与14-3-3相互作用)作为工具研究两者结合后对嘌呤霉素诱导的HIP-55蛋白表达的影响. 结果:外源转入的Venus-HIP-55WT、Venus-HIP-55AA及Venus-14-3-3蛋白能够在HEK293细胞中表达;双分子荧光互补实验结果表明HIP-55与14-3-3存在相互作用,HIP-55蛋白的S269/T291位点介导HIP-55与14-3-3的相互作用;免疫共沉淀技术表明内源性HIP-55与14-3-3存在相互作用;进一步研究发现HIP-55与14-3-3复合体增强HIP-55蛋白的稳定性,保护HIP-55不被降解. 结论:14-3-3与HIP-55存在相互作用,14-3-3/HIP-55复合体可以促进HIP-55蛋白的稳定性.     

地塞米松通过PKA信号通路调控水通道蛋白2的分子机制

目的：研究地塞米松（Dex）对水通道蛋白2（AQP2）的体外直接调控效应,明确该作用是否依赖于PKA信号通路。方法：制备AQP2 野生型及突变型质粒,突变型质粒通过突变AQP2 C末端4 个PKA磷酸化位点（S256、S261、S264 S269）阻断PKA信号通路。AQP2 野生型及突变型质粒分别转染HEK293 细胞和显微注射爪蟾卵母细胞,再予共转染PKA质粒或Dex 0.1 μmol/L干预,采用蛋白质印迹（Western blot）法检测AQP2 总蛋白表达,通过细胞表面生物素化评估AQP2 膜蛋白表达,比较各组爪蟾卵母细胞的水渗透性差别。结果：Dex及PKA均显著上调HEK293 细胞的AQP2 膜蛋白及总蛋白表达（均P ＜0.01）;与野生型相 比,PKA磷酸化位点的突变显著抑制了体外PKA直接诱导的AQP2 磷酸化;突变后AQP2 的膜蛋白及总蛋白表达均显著下调（均P ＜0.01）;PKA磷酸化位点突变后,Dex及PKA对AQP2 膜蛋白及总蛋白表达的上调效应均被显著抑制（均P ＜0.01）;Dex及PKA均显著增加爪蟾卵母细胞水通透活性,PKA磷酸化位点突变后,该效应被显著抑制（均P ＜0.01）。结论：Dex对AQP2 的总蛋白及膜蛋白表达具有显著的上调效应,该作用依赖于PKA信号通路实现。     

UGT1 A10基因SNP rs10187694对吗替麦考酚酯代谢的影响

体外研究尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT1A10 ）基因SNP rs10187694 多态位点G/A变异对吗替麦考酚酯（MMF）代谢的影响,明确该位点变异是否与MMF个体代谢差异有关。方法采用基因重组、定点突变技术,构建UGT1A10基因SNP rs10187694位点含有不同等位基因的重组过表达载体,POLO 3000 转染法将重组过表达载体转染入HEK293细胞,采用液相色谱- 质谱联用仪（LC/MS/MS）系统,检测霉酚酸（MPA）代谢产物7-O- 葡醛酸苷（MPAG）的生成量,以评估转染不同等位基因HEK293 细胞中酶的活性。结果成功 构建pIRES2-EGFP-prom（G）和pIRES2-EGFP-prom（A）重组过表达载体,并转染HEK293 细胞。LC/MS/MS系统检测结果显示,携带A 等位基因的突变型1 10代谢MMF 产生MPAG 的能力降低,其24 h MPAG的生成量为（226.00±14.57）nmol/L,而野生型的生成量为（269.00±14.07）nmol/L, UGT1A10突变型MPAG 的生成量是野生型的84.00%,两者比较,差异有统计学意义（ p<0.05）。结论1 10基因SNP rs10187694位点G/A突变可影响MMF代谢产物MPAG的生成,可能是造成不同个体MMF代谢差异的重要原因之一。     

二型谷氨酸羧肽酶口服基因疫苗的制备及其降低大鼠麻醉药用量的初步研究

目的　研制携带二型谷氨酸羧肽酶 (GCPⅡ )的口服疫苗 ,探讨该疫苗对大鼠麻醉药用量的影响。方法　采用聚合酶链反应、酶切连接和蓝白筛选的方法 ,构建GCPⅡ的表达载体 ;用磷酸钙共沉淀的方法转染HEK2 93细胞 ,G4 18筛选阳性细胞克隆 ;逆转录聚合酶链反应和免疫荧光细胞染色的方法鉴定阳性细胞株 ;氯化钙法制备携带GCPⅡ表达载体的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗(SL GCPⅡ ) ;采用原代培养的巨噬细胞吞噬SL GCPⅡ的方法 ,观察疫苗的体外表达情况 ;将 5 0只雄性SD大鼠随机分为A、B 2组 ,每组 2 5只 ,2组鼠的体重分别为 ( 174 g±13g)和 ( 172 g± 11g) ,差异无显著意义 (P =0 0 72 )。A组胃内灌注 6 0 0 μL、OD2 60 0 6SL GCPⅡ ,两周内 4次给药 ;B组为对照组 ,给予SL32 6 1,剂量和方法与A组相同。采用免疫荧光的方法检测大鼠循环中GCPⅡ抗体滴度 ,观察麻醉药戊巴比妥钠的用量。结果　扩增GCPⅡ基因并构建了含有GCPⅡ基因的表达载体———pCDNA3 1 GCPⅡ ;建立了细胞株HEK 2 93 GCPⅡ ;体外实验证明培养的巨噬细胞吞噬SL GCPⅡ后 ,能够有效表达GCPⅡ基因。体内实验发现口服疫苗能够激活 2 2 / 2 5只SD大鼠产生GCPⅡ抗体 ,实验组麻醉药戊巴比妥钠的用量 ( 36 9mg/kg± 1 6mg/kg)显著低于对照组 ( 4 0 8m     

SCN3A 基因突变型表达载体的构建及在 HEK 293 细胞中的表达

目的 体外构建含有SCN3A基因mRNA片段的质粒pCMV₆-XL₄-SCN3A的突变体N302S(c.905A>G),为进一步的功能研究奠定实验基础。方法设计带突变位点的引物,以野生型质粒为模板进行定点诱变,构建突变质粒。质粒经扩增纯化后瞬时转染到HEK293细胞中,24 h后用RT-PCR方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定及测序证实突变成功。突变质粒转入HEK293细胞系24 h后,RT-PCR可以检测到目的基因的表达。结论本实验成功地构建了SCN3A 基因突变型真核表达载体pCMV₆-XL₄-SCN3A-N302S,并在基因水平上验证了能在HEK293 细胞中表达。     

活化型及失活型n-Src真核表达载体的构建及活性鉴定

目的 构建神经型酪氨酸蛋白激酶n-Src的活化型（aSrc,SrcY535F）及失活型（iSrc,SrcK303R）真核表达载体并鉴定其在HEK293T细胞中的表达及活性.方法 以野生型pRc/CMV-n-Src真核表达载体为模板,采用PCR定点突变技术分别扩增活化型及失活型pRc/CMV-n-Src全长序列,并转染入HEK293T细胞,通过免疫印迹检测n-Src的蛋白表达及其自身磷酸化水平.结果 aSrc及iSrc目的 基因成功扩增,且测序结果与预期结果一致.免疫印迹分析显示,aSrc及iSrc均能在HEK293T细胞中表达,aSrc自身磷酸化水平显著升高.结论 成功构建活化型及失活型n-Src真核表达载体,并能于HEK293T细胞中高效表达.     

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达

目的构建含人Ⅰ型1-磷酸鞘氨醇受体(SIPI)-全长cDNA序列及HA和/或EGFP标签的真核表达载体,并观察其在HEK293细胞上的表达。方法合成2条HA寡核苷酸,克隆入S1P1-Myc-EGFP-N1载体。以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,用PCR的方法扩增HA-S1P1并克隆入pcDNA3.1(+)载体。限制性酶切消化、PCR、测序的方法鉴定,载体经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测S1P1在HEK293细胞上的表达。结果限制性酶切消化、PCR、测序结果证实载体构建成功。S1P1表达在HEK293稳定细胞株的表面。结论成功构建带有HA和/或EGFP标签的S1P1真核表达载体,表面表达S1P1的HEK293稳定细胞株可作为我们进一步研究的细胞模型。     

Construction of a HERG mutant L539fs/47-*558W pEGFP vector and the expression of the fusion protein in HEK293 cells

Objective： To construct a human ether-a-go-go-related gene （HERG） nonsense mutant L539fs/47-558W into the autonomously fluorescent, eukaryotic expression vector pEGFP-C2, and to verify expression of the reconstruct in human embryonic kidney-293 （HEK293） cells. Methods： The mutational fragment was subcloned into pEGFP-C2-HERG by double digestion of Sbf I, Eco91 1 and rejoining of T4 ligase. After verification, the recombinant pEGFP-C2-L539fs/47-558W and pEGFP-C2-HERG were respectively transfected into HEK293 cells for 48 h by the Lipofect method to observe the expression location of the fusion protein by laser confocal imaging scanning in vivo. pcDNA3 -L539fs/47-＊558W and pcDNA3-HERG were transfected to observe the expression location of the HERG protein by immunofluoresceoce. The mutant protein size was determined by Western blotting. Results： The about 1 kb-sized mutation region cDNA fragment from pcDNA3-L539fs/47-＊558Wand the about 7.2 kb-sized target vector fragment from pcDNA3-HERG were ligated after purification and gel recovery pEGFP-C2-L539fs/47＊-558W, approximately 8.2 kb, was demonstrated successfully been constructed under agarose gel electrophoresis and further sequencing. Laser confocal imaging showed that pEGFP-C2-HERG was mainly expressed in the membrane, whereas truncated mutant-type HERG in the pEGFP-C2 vector was partially located in the cytoplasm, the others were transported to the cell membrane in living HEK293 cells. The same as the immunofluoresceoce results after transfection of pcDNA3-HERG and pcDNA3-L539fs/47-558W. Wild-type HERG-GFP fusion protein expressed 160 and 180 kDa bands. The mutant and mutant-GFP fusion proteins were 70 and 100 kDa, respectively. Conclusion： pEGFP-C2-L539fs/47-＊558W was successfully constructed by double digestion method GFP had no effect on its protein expression and trafficking in HEK293 cells, which laid a foundation for the further study on L539fs/47-＊558W