Survivin反义寡核苷酸经线粒体途径诱导肺癌细胞凋亡研究

目的:探讨survivin反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASODN)诱导肺癌细胞凋亡的作用及survivin抗凋亡的分子机制.方法:脂质体介导下,分别以100 nmol/L、300 nmol/L、500 nmol/L survivin ASODN作用于肺癌细胞株NCI-H446后,在不同时间用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测凋亡;Rh123染色法检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial potential membrane,△Ψm)变化,ELISA法检测胞质细胞色素C (cytochrome C,Cyt C)浓度,比色法检测胞质内天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9(cystenyl aspartate specific proteinase-9,caspase-9)活性变化;加入caspase-9抑制剂Z-LEHD-FMK后FCM检测细胞凋亡.结果:Survivin ASODN 500 nmol/L作用72 h效果最佳,细胞凋亡指数(AI)达48.35%,增殖指数(PI)为24.38%; Survivin ASODN导致细胞△Ψm逐渐下降,并相继引起Cyt C的释放和caspase-9 的激活.三者变化具有时间依赖性和差异性;Z-LEHD-FMK显著抑制了survivin ASODN诱导的细胞凋亡.结论:Survivin主要通过调控线粒体凋亡途径发挥抗肺癌细胞凋亡作用; Survivin ASODN能够显著诱导肺癌细胞凋亡,抑制细胞增殖.     

小白菊内酯对人小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖及凋亡作用研究

目的：研究小白菊内酯（parthenolide,PTL）对人小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）细胞株NCI-H446增殖及凋亡作用的影响及其可能的分子机制。方法：NCI-H446细胞株由武汉大学细胞库提供,PTL购于Gene Operation公司,将NCI-H446细胞株分为对照组和实验组（1.5 μg/mL组、2.0 μg/mL组、2.5 μg/mL组和3.0 μg/mL组）,向实验组细胞培养基中加入对应浓度PTL处理细胞,对照组中加入等体积无血清培养基。MTT比色法观测不同浓度PTL对NCI-H446细胞增殖的影响;Hochest 33258染色后,荧光显微镜下观察细胞核形态学变化;流式细胞术（flow cytometry,FCM）分析细胞凋亡率;RT-PCR分别检测不同浓度组PTL处理48 h后细胞中NF-κB、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表达状态,Wsetern blot检测NF-κB、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的表达状态。结果：PTL抑制小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖并呈浓度依赖性;Hochest 33258染色结果显示,PTL作用NCI-H446细胞48 h后,细胞数量减少,细胞核固缩碎裂,形成凋亡小体,导致细胞凋亡;流式细胞术检测显示,PTL处理NCI-H446细胞后,细胞凋亡率与药物浓度梯度呈浓度依赖性,差异有统计学意义（P＜0.05）;RT-PCR及Wsetern blot结果显示,与对照组比较,经PTL处理的 NCI-H446细胞中NF-κB mRNA及蛋白表达下调,同时Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA及蛋白表达上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：PTL能抑制NCI-H446细胞的增殖并诱导其发生凋亡,PTL的作用机制可能与抑制NF-κB信号通路及活化Caspase系统有关。     

联合应用Survivin和VEGF反义寡核苷酸对肺癌A549细胞的抑制作用

目的研究非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)A549细胞经Survivin和VEGF反义寡核苷酸(ASODN)单独和联合转染后细胞生长、凋亡以及对基因表达的抑制作用。方法针对Survivin和VEGF mRNA序列设计反义寡核苷酸,以脂质体(Lip)为载体,介导Survivin和VEGF ASODN单独和联合转染A549细胞。MTT法检测细胞生长抑制率,RT-PCR检测细胞中Survivin和VEGF基因的mRNA含量,流式细胞术检测细胞凋亡以及细胞中Survivin基因的蛋白表达。结果经脂质体转染后200~600 nmol/L Survivin ASODN和5~20μmol/L VEGF ASODN均能抑制A549细胞增殖,诱导细胞凋亡;在48 h时,400 nmol/L Survivin ASODN和10μmol/L VEGF ASODN抑制率和凋亡率有统计学意义(P<0.05);两者联合转染A549细胞抑制率和凋亡率分别为(61.37±1.94)%和57.03%,显著高于两基因单独转染(P<0.05);联合组的Survivin mRNA的表达量为(15.26±1.31)%,蛋白表达率为(30.40±1.33)%,VEGF mRNA的表达量为(13.12±1.45)%,均显著低于单独转染组(P<0.05)。结论 Survivin和VEGF ASODN均能抑制A549细胞基因表达,诱导细胞凋亡,两基因反义寡核苷酸联合转染的效果优于单独转染。     

多西环素对体外人小细胞肺癌H446细胞增殖的影响及其机制

目的 探讨多西环素对体外人小细胞肺癌H446细胞增殖的影响及其可能的作用机制.方法 不同浓度的多西环素作用于体外培养的人小细胞肺癌H446细胞24、48、72或96 h,采用CCK-8法检测多西环素对H446细胞增殖的影响;采用Bliss法计算半数抑制浓度(IC50);采用TUNEL法检测多西环素对H446细胞凋亡的影响;采用Western印迹法检测多西环素对Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白表达的影响;采用实时定量-PCR法检测多西环素对Bcl-2、Bax等凋亡相关基因mRNA表达的影响.结果 多西环素可浓度-时间依赖性地抑制人小细胞肺癌H446细胞的体外增殖,作用24、48、72和96 h对应的IC50值分别为24.10、10.98、8.20和8.03 mg/L;多西环素作用后H446细胞的凋亡指数显著增加(P<0.05);Bax的蛋白及mRNA表达水平上调,Bcl-2的蛋白及mRNA表达水平下调,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 多西环素可通过上调促凋亡相关蛋白Bax的表达,下调抑凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,诱导人小细胞肺癌H446细胞凋亡,进而抑制人小细胞肺癌H446细胞的体外增殖,是一种有开发前景的小细胞肺癌治疗药物.     

鱼藤素对小细胞肺癌的体外抗肿瘤效果评价及相关机制分析

目的:研究鱼藤素对小细胞肺癌体外抗肿瘤效果?方法:0?5?10?20?50 μmol/L鱼藤素作用于NCI-H446细胞24 h,细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK8)分析鱼藤素对细胞活力的影响?据CCK8结果,以0?5?10?20 μmol/L鱼藤素作用于NCI-H446细胞,EdU掺入法检测细胞增殖,DAPI染色及流式细胞术测定细胞凋亡?据流式结果,20 μmol/L鱼藤素作用NCI-H446细胞0?0.5?2.0?4.0 h,蛋白质印迹法检测细胞内凋亡相关蛋白的表达?结果:鱼藤素呈剂量依赖性地抑制小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖?诱导其凋亡,作用不同时间后可上调促凋亡蛋白Bax?下调抗凋亡蛋白Bcl-2水平?结论:鱼藤素体外抗小细胞肺癌效应可能通过上调促凋亡蛋白Bax?下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达,诱导细胞凋亡实现?     

survivin、caspase-3在脑胶质瘤的表达及suvivin ASODN对U251细胞的影响

目的：观察脑胶质瘤患者脑组织survivin、caspase-3的表达情况及survivin ASODN对脑胶质瘤U251细胞survivin和caspase-3表达的影响,探讨两者与脑胶质瘤发病及预后的相关性。方法：免疫组化法检测脑胶质瘤患者survivin和caspase-3蛋白表达,RT-PCR检测脑胶质瘤组织survivin mRNA表达,以脑胶质瘤U251细胞为研究对象,转染不同剂量survivin ASODN（100nmol/L、300nmol/L、500nmol/L）,并于培养不同时间（24h、48h、72h）后,RT-PCR检测U251细胞survivin和caspase-3的表达。结果：脑胶质瘤患者脑组织survivin蛋白高表达（阳性率69.6%）,而caspase-3低表达（阳性率50.7%）,且两者表达的阳性率与肿瘤的恶性程度有关。U251细胞在不同浓度survivin ASODN转染不同时间后,以500nmol/L survivin ASODN转染72h对U251 survivin mRNA的抑制率达62.06%,与对照组及不同浓度组间比较差异均有统计学意义（P〈0.05-P〈0.01）。免疫组化结果显示转染后survivin表达下调,而caspase-3表达上调。结论：脑胶质瘤患者脑组织高表达survivin蛋白,而低表达caspase-3蛋白,survivin ASODN可诱导U251细胞株survivin mRNA及蛋白表达下调,而caspase-3蛋白表达水平上调。     

Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌SGC7901细胞株凋亡的实验研究

目的 观察Survivin反义寡核苷酸（ASODN）对胃癌细胞株（SGC7901）增殖、凋亡的作用。方法 人工合成Survivin硫代ASODN，通过脂质体转染胃癌细胞株（SGC7901）后，用MTT法检测细胞毒作用；用荧光染色、流式细胞术检测细胞凋亡；用RT-PCR、免疫组化技术检测SurvivinmRNA及蛋白的表达。结果 （1）Survivin ASODN抑制胃癌SGC7901细胞增殖呈时间和剂量依赖性；（2）Survivin ASODN处理组SGC7901细胞24h后凋亡率为33．6％，正义寡核苷酸（SODN）组为10．7％，2组相比，有显著性差异（P〈0．05）；（3）SurvivinASODN处理组SGC7901细胞Survivin蛋白及mRNA的表达水平显著下降。结论 Survivin ASODN能够抑制增殖、诱导凋亡，推测可能通过下调Survivin mRNA及蛋白表达而起作用。     

FGF-2对小细胞肺癌细胞株NCI-H446 survivin表达及Smac亚细胞定位的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,FGF-2)对小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)细胞株NCI-H446中survivin的表达及Smac亚细胞定位的影响.方法:Western 印迹分析FGF-2对NCI-H446中凋亡抑制蛋白survivin表达的影响.Western印迹和免疫荧光分析FGF-2对线粒体释放的促凋亡蛋白Smac的亚细胞定位的影响.流式细胞术检测NCI-H446的细胞凋亡百分率.Hoechst 33258染色观察FGF-2对NCI-H446细胞凋亡的影响.结果:FGF-2能明显诱导NCI-H446细胞中survivin蛋白的表达,survivin的表达水平与FGF-2作用的浓度和时间明显相关.血清饥饿诱导的Smac蛋白从线粒体的释放可被FGF-2所抑制.FGF-2能明显抑制血清饥饿诱导的凋亡.结论:FGF-2可显著提高SCLC细胞株NCI-H446中凋亡抑制蛋白survivin的表达水平,并显著抑制血清饥饿诱导的促凋亡蛋白Smac释放入胞浆.这可能与其抑制肿瘤细胞凋亡有关.     

DADS诱导小细胞肺癌细胞株NCI-H446凋亡及其分子机制

目的 探讨二烯丙基二硫(DADS)诱导人肺癌细胞株NCI-H446凋亡及其分子机制.方法 流式细胞仪检测DADS诱导NCI-H446细胞凋亡率;激光共聚焦显微镜检测NCI-H446细胞内Ca2+水平变化;利用免疫细胞化学法检测NCI-H446细胞内Bcl-2蛋白表达.结果 与对照组相比,DADS处理组细胞的凋亡率显著增加(P＜0.05);DADS处理组细胞内Ca2+水平升高(P＜0.05).DADS下调Bcl-2(P＜0.05).结论 DADS诱导小细胞肺癌细胞株NCI-H446凋亡,其具体机制可能与DADS下调Bcl-2蛋白表达和促进细胞内Ca2+水平升高有关.     

姜黄素对人肺癌细胞凋亡及相关信号的影响

目的研究姜黄素对人肺癌细胞内凋亡相关信号的影响。方法取对数生长期SPC-A1细胞,用20μmol/L姜黄素作用SPC-A1细胞0、1、2、3、4h,用荧光探测的办法测定细胞内Ca2 浓度。用原位杂交的方法检测人肺癌细胞caspase8mRNA表达。结果20μmol/L姜黄素处理SPC-A1细胞后,细胞内Ca2 浓度随作用时间增高而升高;20μmol/L姜黄素作用于癌细胞24h后,使人肺癌细胞caspase8mRNA表达明显增高。结论姜黄素诱导SPC-A1细胞的凋亡可能与细胞内Ca2 浓度升高以及caspase8mRNA表达增高有关。     

雷帕霉素抑制人肺腺癌细胞A549增殖的实验研究

目的初步探讨雷帕霉素抑制A549细胞增殖及其可能机制。方法将20 nmol/L雷帕霉素作用A549细胞24、48、72 h后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR法检测Survivin mRNA的表达,western blot检测Survivin蛋白的表达。结果对照组和雷帕霉素作用A549细胞24、48、72 h后,生长抑制率分别为(1.61±0.09)%、(12.13±0.68)%、(20.82±1.02)%、(51.68±2.96)%,细胞凋亡率分别为(1.17±0.07)%、(10.01±0.34)%、(16.68±0.52)%、(38.23±1.04)%,Survivin mRNA和蛋白相对表达水平分别为(0.77±0.09)、(0.54±0.13)、(0.33±0.08)、(0.19±0.12)和(0.62±0.06)、(0.46±0.08)、(0.29±0.08)、(0.15±0.11)。雷帕霉素能够呈时间依赖性的抑制A549细胞的增殖及诱导A549细胞的凋亡(P0.05),并能够下调Survivin的表达(P0.05)。结论雷帕霉素能够抑制A549细胞增殖,并诱导其凋亡,其效应与下调Survivin的表达有关。     

Survivin反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞株中survivin和SMAC/DIABLO基因表达的影响

目的 观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人卵巢癌细胞株SKOV3中survivin、Smac/DIABLO表达的影响,探讨survivin、Smac/DIABLO在ASODN诱导卵巢癌细胞凋亡和细胞周期改变中的作用和分子机制.方法 用脂质体(LipofectamineTM 2000)介导survivin ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,用MTT比色法检测细胞生长活性,流式细胞学技术检测细胞凋亡指数、细胞周期分布及survivin、Smac蛋白表达改变,逆转录酶链反应检测survivin、Smac/DIABLO基因表达改变.结果 同对照组比较,不同浓度ASODN作用后细胞生长明显减慢,转染后48 h IC50在600 nmol/1左右.用600 nmol/LASODN转染48h后,细胞凋亡指数(AI)明显增加,(t=6.3671,P＜0.05);更多的细胞停留在G0/G1期(t=10.3832,P＜0.01).Survivin mRNA和蛋白表达明显下调(t=3.5031,P＜0.05,t=7.8146,P＜0.01),SmacmRNA和蛋白表达上调(t=2.8011,P＜0.05,t=11.3917,P＜0.01).结论 ASODN诱导细胞凋亡,使更多的细胞停留在G0/G1期,减少进入有丝分裂细胞数的作用,是通过下调survivin基因,上调Smac基因表达来共同完成的,survivin、Smac/DIABLO基因在调节SKOV3细胞周期、凋亡的功能上密切相关,二者的相互作用是卵巢癌发生、发展的重要分子机制之一.     

Bcl-2反义寡核苷酸联合照射对肺癌细胞的抑制作用

[目的]研究Bcl-2反义寡核苷酸联合照射对肺癌细胞的抑制作用。[方法]NCI-H446肺癌细胞株分5组:空白对照、单纯照射组、反义寡核苷酸加照射组、无义序列加照射组、脂质体加照射组。相应组照射10GY后24、48、72小时,MTT法检测各组的细胞增殖抑制率和联合相互作用。[结果]照射组、反义寡核苷酸加照射组、无义序列加照射组、脂质体加照射组均有细胞抑制,并呈时间依赖关系。其中Bcl-2反义寡核苷酸联合照射组抑制率明显高于其它三组(P<0.01),联合作用指数(CDI)=0.86。[结论]Bcl-2反义寡核苷酸促进了照射对NCI-H446肺癌细胞的增殖抑制作用,两者有协同作用。     

反义硫代寡核苷酸对786-O细胞survivin基因的表达及生长抑制作用

目的研究survivin反义寡核苷酸对肾透明细胞癌786O细胞表达survivin蛋白、细胞凋亡、增殖的影响。方法设计并合成特异性靶向survivin的反义寡核苷酸(ASODN)。肾透明细胞癌细胞株786O分为6组:空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组、200、400和600nmol/LASODN转染组。作用24h后收获各组细胞。倒置显微镜及透射电子显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测各组细胞survivin表达情况和流式细胞术检测各组细胞周期变化和凋亡指数,MTT法检测survivin反义寡核苷酸对各组细胞的生长抑制率。结果电镜下可以见到典型凋亡样改变,而各对照组细胞生长良好;各ASODN转染组细胞survivin表达有不同程度减弱;各ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P<0.05),以600nmol/LASODN转染组最为明显(P<0.05),而各对照组间差异无显著性(P>0.05)。结论不同浓度survivinASODN转染后能下调survivin蛋白表达,诱导肾透明细胞癌786O细胞凋亡,抑制786O细胞增殖。     

Survivin反义寡核苷酸对肝癌细胞株SMMC-7721增殖的影响 

目的：应用反义寡核苷酸技术研究凋亡抑制蛋白Survivin反义寡核苷酸对肿瘤细胞增殖的影响。方法：根据Survivin序列合成其反义寡核苷酸序列（Survivin-ASODN）。培养肝癌细胞株SMMC-7721,用荧光素标记的Survivin-ASODN转染,并设立空白对照、空脂质体对照及正义寡核苷酸(SODN)对照组;用PCR方法检测Survivin基因表达水平;通过MTT方法分析Survivin-ASODN转染对肝癌细胞增殖的影响。结果：荧光素标记的Survivin-ASODN在SMMC-7721细胞中的转染率达到60%以上。SMMC-7721细胞分别用100、200、300、400和600 nmol/LASODN转染后,Survivin基因表达水平下降,细胞增殖抑制率24 h时分别为(3.87±1.67)%、(9.21±2.21)%、(15.21±3.18)%、(21.32±3.43)%和(32.62±3.74)%,而300 nmol/L-1 ASODN组48 h时细胞生长抑制率为(29.21±4.12)%,72 h时抑制率为(44.21±3.32)%;ASODN转染组细胞增殖抑制率与空白对照组、空脂质体组及SODN组比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：Survivin-ASODN对细胞增殖有抑制作用,且呈现剂量依赖性;并且随着作用时间的延长,其抑制效果增强。     

Survivin反义寡核苷酸对K562细胞耐药性的影响

目的 探讨Survivin反义寡核苷酸(antisense oligodeoxg nucleotide,ASODN)与传统化疗药物对白血病K562细胞耐药性的影响.方法 实验分为反义核苷酸组(ASODN)、无义核苷酸组(SODN)、脂质体组(Lip)、空白对照组,以脂质体转染Survivin ASODN,用RT-PCR检验SurvivinmRNA表达;用MTT法检测K562细胞对阿霉素(driacin,ADM)、柔红霉索(daunorubicin.DAM)及联合用ASODN耐药性;用流式细胞仪检测单独用ADM、DAM和联合用ASODN时K562细胞内ADM和DAM的浓度.结果 ASODN组Survivin mRNA表达较对照组降低(P<0.05);ADM和ASODN ADM对K562细胞的半数抑制细胞(IC50)分别为0.5457 mg/L和0.1933 mg/L,DAM和ASODN DAM对K562细胞的IC5.分别为0.5408 mg/L和0.2027 mg/L,联合用药组ICso低于单用药组(P<0.05);用ADM和ASODN ADM时K562细胞内药物的荧光强度分别为51.64、89.92,DAM和ASODN DAM时K562细胞内药物的荧光强度分别为63.71、88.47,联合用药组细胞内药物浓度高于单用药组(P<0.05).结论 Survivin反义寡核苷酸可下调K562细胞Survivin mRNA的表达;Survivin反义寡核苷酸与阿霉素和柔红霉索联合作用可提高K562细胞内药物浓度,降低细胞生存率,降低细胞耐药性.     

靶向抑制survivin对胰腺癌细胞增殖和凋亡效应的影响

目的 探讨反义survivin—脂质体复合物对胰腺癌细胞增殖和凋亡效应的影响及机制,为胰腺癌及survivin阳性肿瘤的治疗提供理论依据。方法 用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染胰腺癌细胞系PANC—1细胞;通过RT—PCR、Western印迹试验检测survivin表达水平;MTY法测量细胞生长情况;流式细胞术测定caspase—3活性及凋亡率;电镜观察细胞形态学变化;应用激光共聚焦显微镜免疫荧光分析法评价脂质体反义复合物在亚细胞水平对survivin蛋白分子的影响。结果 反义survivin脂质体复合物有效下调survivin表达水平,并呈剂量依赖关系,IC50值为300nmoL／L,最大效应浓度为500nmoL／L,此时表达水平下调了80％。类似细胞生长抑制结果为MTY实验所证实。与此同时,caspase—3活性和凋亡率随转染时间延长而逐渐递增,并出现凋亡形态学变化,如胞浆空泡变性、核浓缩和核碎裂。免疫荧光分析,标记有FITC—绿荧光染色的survivin蛋白分子在未转染的细胞浆中清晰可见,并呈“斑点”状分布;而在转染细胞中几乎没有发现,但是符合细胞凋亡的形态学特征。结论 靶向抑制联系细胞增殖和凋亡的关键分子—survivin在胰腺癌治疗中有良好的应用前景。     

注射用多西他赛磺丁基-β-环糊精包合物的体外抗肿瘤作用

为了评价注射用多西他赛磺丁基-β-环糊精包合物(ML061)对各种体外培养肿瘤细胞的细胞毒性作用,本研究选取MDA-MB-435、MDA-MB-435s、NCI-H446、HO-8910、Bcap-37、KB、SMMC-7721、HT-29、SW480、LS-174t、SGC-7901、MCF-7、A549、NCI-H460等14个肿瘤细胞株,分别用不同质量浓度(200,20,2,0.2,0.02,0.002,0.000 2,0.000 02μg/mL)ML061处理肿瘤细胞72 h,用MTT法测定细胞活力,并计算药物对各肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50。结果发现,ML061可抑制多种体外培养的肿瘤细胞株的活力,且这种抑制作用呈剂量依赖性。与阳性对照药市售多西他赛注射液奥名润相比,在选取的14个肿瘤细胞株中,ML061对Bcap-37、MDA-MB-435、MDA-MB-435s、NCI-H446和SW480的IC50小于0.1μg/mL。ML061对人卵巢癌Bcap-37、人结肠癌SW480、人小细胞肺癌NCI-H446、人乳腺癌MDA-MB-435及MDA-MB-435s等肿瘤细胞株的体外抑制作用较强。总之,ML061抑制多种体外培养的肿瘤细胞增殖,与阳性对照药奥名润相同,以Bcap-37、SW480、NCI-H446和MDA-MB-435s这4个细胞株较为敏感,而MDA-MB-435对ML061的敏感性高于奥名润。