H7N9禽流感病毒在小鼠体内的适应性

目的进一步探讨H7N9禽流感病毒对哺乳动物的感染与致病能力,并对其分子机制进行研究。方法以病毒滴鼻感染小鼠,在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,通过病毒全基因组测序及比对探寻适应的分子机制。结果禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒,经过在小鼠体内进行9次传代后,对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因,NA基因以及PA亚基共发生了4个有义突变。结论禽流感H7N9 A/Anhui/1/2013病毒经连续传代后基因发生突变,但对病毒的毒力以及致病力影响仍需后续实验验证。     

应用季节性流感病毒H3N2鼠适应株建立小鼠模型

目的应用季节性流感病毒H3N2鼠适应株建立小鼠模型,并阐述适应株致病力变化的分子机制。方法 A/Aichi/2/68(H3N2)(WT)在小鼠体内多次适应获得鼠适应株(MA-7),MA-7经鼻感染BALB/c小鼠,根据临床症状、体重下降率、病毒复制和组织病理等关键指标判断小鼠模型构建成立,分析适应株致病力变化的分子机制。结果小鼠感染WT后无明显症状且未检测到病毒复制。MA-7感染后小鼠9 d内全部死亡,体重下降率超过30%,多组织内均能检测到病毒复制,肺组织中滴度高达105. 5TCID50并出现间质性肺炎。基因比对发现MA-7在HA、NA、PA和NP基因上有5个位点发生突变。结论成功建立了H3N2适应株小鼠模型,可用于研究H3N2流感病毒发病机制及其药物、疫苗、抗体评价等,其适应株致病力增强可能与5个突变位点有关。     

季节性流感病毒H1N1 BALB/c鼠肺适应株的建立及其分子机制

目的 建立季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株，并对适应的分子机理进行研究。方法 以病毒滴鼻感染小鼠，通过在BALB/c小鼠肺组织中连续传代，观察小鼠存活情况及肺病理改变，来获得季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株。结果 季节性流感H1N1 A/Brisbane/59/2007病毒野生型毒株，经过在小鼠体内进行8次传代后，毒力逐渐增强，从无致病力到致死率达到100%，对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对，发现适应株HA基因发生了3个有义突变。结论 野生季节性低致病力H1N1流感病毒可经在小鼠中经过多次传代而获得高致病力H1N1鼠肺适应株，HA蛋白89位Thr至Ile的突变对毒力的增强起决定性作用。     

H7N9禽流感病毒对人类致病的分子基础分析

【目的】 了解H7N9禽流感病毒对人类致病的分子特征,为更好地预防与治疗H7N9人禽流感提供科学依据。【方法】 从GISAID数据库中下载中国2013年分离的所有H7N9禽流感病毒株的基因及蛋白序列,并从NCBI数据库中下载其他相关的流感病毒序列,运用生物信息学软件分析H7N9禽流感病毒基因的系统进化特征?受体结合位点?宿主特异位点?飞沫传播关键氨基酸位点?致病及毒力相关位点?耐药性位点及潜在糖基化位点等的变异情况。【结果】 2013年中国流行的H7N9禽流感病毒为四源重组病毒, 所有基因片段均来源于禽类,不含任何人流感病毒基因;病毒HA的受体结合位点发生了2个关键氨基酸的变异(G186V和Q226L);在与飞沫传播有关的关键氨基酸位点中,个别氨基酸已发生了变异(T160A? Q226L);该病毒具有8个毒力增强位点;所有分离株的M2均发生了 S31N变异;分离株A/Shanghai/1/2013的NA的耐药位点发生了R294K变异;所有毒株的潜在糖基化位点均相对保守。【结论】 H7N9禽流感病毒为四源重组的新型禽流感病毒。该病毒具有与人呼吸道上皮细胞SAa-2,6 Gal受体结合的分子基础,但目前尚未获得经飞沫传播的充分条件,人传人的可能性不大。该病毒具有低致病性禽流感病毒的分子特征,表明对禽类致病性不强,但其对人类呈高致病性,这可能与其毒力位点的特征有关。所有分离毒株均发生了对离子通道抑制剂金刚烷胺类药物的耐药性突变,个别毒株已发生了对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦(达菲)的耐药性突变。     

PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性的影响分析

目的 本研究利用A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,评估PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性,探究A/H6N1流感病毒的致病性分子基础。方法 通过A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/SanJiang/275/2007株反向遗传操作系统和点突变技术拯救病毒rA/H6N1和PB2 E627K位点发生突变的 rA/H6N1-627,两株拯救病毒分别以101EID50~106EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、死亡率、病毒滴定等方面进行致病性分析。结果 成功构建A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,rA/H6N1的8个基因片段完全源于A/H6N1的基因组,核苷酸序列及生物学特性与A/H6N1完全一致。rA/H6N1能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性(MLD50>106.5EID50),病毒在小鼠体内的分布情况及各个脏器中的病毒滴度与A/H6N1保持一致; rA/H6N1-627能感染小鼠,引起小鼠体重下降,但不能引起所有106EID50组小鼠死亡,病毒能在小鼠的肺脏和脑部进行增殖。结论 实验结果表明,在H5N1禽流感中发挥重要作用的PB2-E627K位点并非A/H6N1流感病毒的毒力决定因子。A/H6N1流感病毒致病性的分子基础还有待继续研究,该反向遗传操作系统和点突变技术的建立为研究该亚型流感病毒致病机制、传播机制及病毒基因功能奠定了基础,同时也为A/H6N1亚型禽流感病毒新型疫苗的研制开辟了新途径。     

雪貂感染H7N9禽流感病毒动物模型的建立

目的建立雪貂感染H7N9禽流感病毒动物模型。方法A／Anhui／1／2013（H7N9）禽流感病毒经鼻吸入感染雪貂,观察动物临床症状和体征,上呼吸道排毒情况及组织病理学变化。结果雪貂感染后出现体重下降、活动减少以及打喷嚏的临床表现,上呼吸道、心脏、肝脏及嗅球可检测到活病毒,上呼吸道排毒的峰值出现在感染后的第3—5天。血清抗体滴度最高达到1280,外周血淋巴细胞数量减少、粒细胞数量增加。组织病理学显示动物肺脏呈局灶性间质性肺炎及肺泡炎改变,CT显示肺内片状阴影。结论成功建立雪貂感染H7N9禽流感病毒的动物模型,模型的建立为H7N9禽流感发病机制研究、药物及疫苗的评价奠定了实验基础。     

两株人H7N9禽流感病毒的全基因组测序及分子特征分析

【目的】对两株从轻症病例和重症死亡病例中分离的人H7N9禽流感病毒进行全基因组测序,研究其来源、基因组特征以及相互间的分子差异,旨在了解毒株的遗传进化特征与其致病性及其所致疾病临床类型的关系,为进一步阐明H7N9禽流感病毒的致病机制提供科学依据。【方法】选取两株从轻症病例和重症死亡病例中分离的H7N9禽流感病毒进行全基因组序列测定;运用生物信息学软件比较分析两株病毒的遗传进化关系、基因组特征、受体结合位点、宿主特异性位点及致病相关位点等重要分子特征;从禽流感共享数据(GISAID)下载2013年至2014年10月轻症和重症病例的病毒分离株序列,分析致病相关关键位点差异,并分析这些变异与其致病性及所致疾病临床类型的关系。【结果】这两株H7N9禽流感病毒的HA、NA和M基因来源于2013年华东地区流行的H7N9禽流感病毒,NP、NS、PA、PB1和PB2基因来源于2013年在广东地区禽类中流行的H9N2禽流感病毒;H7N9禽流感病毒PA蛋白L336M和PB1蛋白I368V的突变率随流行时间的延长而逐渐上升,并存在地区差异;两株病毒各基因核苷酸同源性达到99.2%以上,氨基酸同源性在99.5%以上,但各基因节段存在个别氨基酸的差异,其中HA受体结合位点存在一个关键氨基酸的差异(226L和226 Q),宿主特异性位点存在两个关键氨基酸的差异(PB2-591L和PB2-591Q,PB2-627E和PB2-627K),毒力位点存在两个关键氨基酸差异(PA-353R和PA-353K,PB2-627E和PB2-627K);M2均发生了S31N突变;潜在糖基化位点均相对保守;2013年至2014年10月报道的重症病例病毒分离株PB2蛋白E627K突变率高于轻症病例分离株。【结论】两株来自不同临床类型的H7N9禽流感病毒是一种新的重组病毒,是由华东地区流行的人H7N9禽流感病毒和在广东地区禽类中流行的H9N2禽流感病毒基因重组而来;H7N9禽流感病毒的某些致病相关的关键氨基酸位点在流行的过程中不断发生变异,必须密切监测毒株的变异动向;两株致病力不同的病毒各基因节段虽然同源性较高,但存在关键氨基酸位点的差异,其中PB2蛋白627位氨基酸位点的差异可能对病毒的致病性起重要作用,与所致疾病临床类型相关。     

H7N9禽流感病毒小鼠感染动物模型的建立

目的 建立H7N9小鼠感染动物模型。方法 1?08,1?07或1?06 TCID50H7N9禽流感病毒原液（A/Anhui/1/2013）滴鼻感染BALB/c小鼠。主要观测指标：临床症状、死亡率、病理变化、病毒载量和血清抗体检测。结果 被感染的小鼠表现为竖毛、弓背、体重下降;病理表现为间质性肺炎,感染后第2天开始在呼吸道脱落细胞中检测到病毒;免疫组化或病毒分离方法在肺、肾、脑、肠、脾等组织检测到病毒;感染后14d在小鼠血清中血凝抑制试验特异性抗体效价达到160;淋巴细胞减少,单核细胞增多。结论 H7N9感染BALB/c小鼠模型与人类禽流感感染疾病的基本特征相似,为研究该病的发病机制及药物疫苗的研发提供了工作基础。     

雪貂感染H7N9禽流感病毒动物模型的建立

目的建立雪貂感染H7N9禽流感病毒动物模型。方法 A/Anhui/1/2013(H7N9)禽流感病毒经鼻吸入感染雪貂,观察动物临床症状和体征,上呼吸道排毒情况及组织病理学变化。结果雪貂感染后出现体重下降、活动减少以及打喷嚏的临床表现,上呼吸道、心脏、肝脏及嗅球可检测到活病毒,上呼吸道排毒的峰值出现在感染后的第3~5天。血清抗体滴度最高达到1280,外周血淋巴细胞数量减少、粒细胞数量增加。组织病理学显示动物肺脏呈局灶性间质性肺炎及肺泡炎改变,CT显示肺内片状阴影。结论成功建立雪貂感染H7N9禽流感病毒的动物模型,模型的建立为H7N9禽流感发病机制研究、药物及疫苗的评价奠定了实验基础。     

H7N9禽流感病毒研究现状

2013年3月在中国华东地区爆发了一场严重的人类感染禽流感疫情,导致此次疫情的病原体为一种全新的H7N9 禽流感病毒,该病毒以其对人类的高致病性及远高于H5N1禽流感病毒的传播速度而引起全球广泛关注。本文就H7N9禽流感病毒的病原学?致病的分子基础?流行病学?临床特征及防治措施等方面的研究现状进行综述,旨在了解人感染H7N9禽流感的研究进展,为人感染H7N9禽流感的有效防控提供科学依据。     

人H7N9禽流感病毒、高致病H5N1禽流感病毒及H1N1流感病毒感染小鼠特征分析

目的 对比分析人高致病H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒及H1N1流感病毒分别感染BALB/c小鼠后的机体反应特征。方法 分别以H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒滴鼻感染BALB/c小鼠,观察小鼠存活率、体征变化及感染后肺组织病理损伤差异,检测小鼠感染流感病毒后肺组织增殖细胞核抗原（PCNA）表达并观察小鼠感染后修复状况。结果 H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒均感染BALB/c小鼠,小鼠存活率依次为H7N9>H1N1>H5N1,肺组织病理损伤严重程度依次为H5N1 >H1N1 >H7N9,PCNA表达水平依次为H7N9 >H1N1 >H5N1。结论 H7N9病毒感染后宿主炎症反应较小,感染后小鼠肺组织自我修复能力较强;H5N1病毒感染BALB/c小鼠后的机体反应最为强烈,感染后恢复能力差,致死率高。     

不同品系小鼠感染甲型流感病毒肺小血管内血栓形成

目的本实验旨在观察不同品系小鼠感染甲型流感病毒后肺组织内血栓形成的情况。方法使用H1N1病毒A/California/7/2009(CA7)株和H3N2病毒A/Brisbane/10/07株,对BALB/C小鼠、Scid小鼠、NOD/LTJ小鼠、BALB/C-nu小鼠、NOD-Scid小鼠和icosl-KO小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒。检测小鼠感染后肺组织病毒拷贝数并观察肺组织病理学改变。结果 H1N1和H3N2滴鼻攻毒的各组小鼠均染毒,病理表现为程度略有差异的间质性肺炎。13只H1N1病毒感染小鼠和6只H3N2感染小鼠在肺组织中观察到多个小血管内有血栓形成,血栓成分主要为纤维素和血小板。结论各品系小鼠感染H1N1和H3N2流感病毒后均可能出现肺组织内血栓形成。     

人H7N9禽流感病毒与H1N1流感病毒感染小鼠病理学损伤的比较

目的 比较分析H7N9病毒与H1N1病毒感染小鼠病理学损伤特点,初步探讨两种病毒感染致小鼠急性肺损伤的致病机制. 方法 H7N9病毒与H1N1病毒分别感染小鼠,观察不同病毒感染后小鼠生存率,并于不同时间点取心、肝、脾、肺、肾、脑、肠等组织,伊红-苏木素染色并进行组织病理学分析,免疫组化检测病毒抗原分布及中性粒细胞浸润.综合分析肺组织病理损伤与病毒复制、宿主免疫反应之间的关系. 结果 H7N9病毒感染小鼠肺及脾脏损伤较轻,存活率较高.H1N1 病毒感染的小鼠肺及脾脏损伤较重,感染后9 d全部死亡;两种病毒抗原主要分布于支气管上皮细胞、少量间质细胞和肺泡上皮细胞,病毒复制水平无明显差异.但H1N1病毒感染后肺及脾脏中均有大量中性粒细胞浸润,小鼠机体炎症反应明显强于H7N9病毒感染后小鼠炎症反应. 结论 H7N9病毒与H1N1病毒感染后小鼠病理学损伤特点及程度均不同,病毒复制是小鼠肺损伤的诱发因素但并非决定因素,宿主针对病毒感染产生的免疫反应程度与急性肺损伤密切相关.     

人季节性H1N1流感病毒小鼠感染模型的建立

目的制备人季节性H1N1流感病毒的小鼠感染模型,为研究流感病毒致病性、研发抗病毒药物提供模型动物。方法将人季节性H1N1流感病毒在鸡胚尿囊腔扩增后,滴鼻接种小鼠,4 d后将小鼠处死,挑选感染体征严重者进行实时荧光PCR(FQ-PCR)检测肺中的流感病毒,将检测阳性的肺上清在鸡胚尿囊腔扩增,接种于下一代小鼠。比较各代小鼠对流感病毒的适应情况,直至小鼠出现明显的感染体征,取肺研磨制成匀浆,获得流感病毒鼠肺适应株并检测其半数致死量(LD50)。将10 LD50的病毒液接种于小鼠,建立人季节性H1N1流感病毒的小鼠感染模型,观察模型小鼠的一般活动状态、体质量变化、肺部病变,HE染色观察肺部病理切片,计算肺指数,FQ-PCR检测病毒RNA。结果人季节性流感病毒在小鼠体内传代4次后,鼠肺适应株制备完成,其经鼻的LD50为10-2.41/0.05 mL。人季节性流感病毒的小鼠感染模型,一般状态差,体质量明显减轻,肺指数增大,70%出现死亡。病理切片观察病变明显,FQ-PCR显示流感病毒阳性。结论成功建立了人季节性H1N1流感病毒的小鼠感染模型。     

H1N1流感与H7N9禽流感感染BALB/c小鼠发病特点初步研究

目的本实验旨在初步探讨A／shanghai／4664T（H7N9）和A／PuertoRico／8／34（H1N1）病毒感染BALB／c小鼠的发病特点,为H7N9致病机制与防治的研究提供数据支持。方法将同等剂量（5×10^3TCID50）流感病毒滴鼻感染BALB／c小鼠,分析其在感染后体重、肺指数、病毒载量和肺组织病理的变化情况。结果H1N1PR8感染组和H7N9感染组小鼠在7d内体重均持续减低,H1N1PR8组较H7N9组降低更为明显;在感染后3dH7N9组与PBS组肺指数无显著差异（P〉0．05）,但感染后7dH7N9组与PBS组相比显著增高（P〈0．05）;H1NlPR8组比H7N9组感染后3d肺指数显著增高（P〈0．05）,但感染后第7天无显著差异（P〉0．05）。H1N1PR8组和H7N9组病毒载量在感染后第3天均显著升高,但两组无显著差异;第7天两组病毒载量均有所降低,但H7N9组病毒载量显著高于H1N1PR8组（P〈0．05）。H1N1PR8在感染后3d主要病理变化为炎症细胞浸润和水肿,而H7N9组主要轻度炎症细胞浸润;在感染后7dH1N1PR8组可见大量炎症细胞浸润,出现大面积肺水肿;H7N9组表现为大量炎症细胞浸润。结论H7N9和H1N1PR8感染BALB／c小鼠均可发病,但发病特点有所差异,H7N9病毒对鼠的适应性比H1N1PR8差。     

季节性流感疫苗对小鼠感染H7N9禽流感病毒的保护效力

目的 评价季节性流感裂解疫苗对流感病毒H7N9的免疫保护效力。方法 用我国2012～2013年度季节性流感裂解疫苗,以腹腔注射方式免疫BALB/c小鼠,并设PBS免疫模型组,末次免疫14 d后以5 LD₅₀ A/Anhui/1（H7N9）进行攻试验。感染后观察记录小鼠临床表现,体重变化,并分别于第2天和第4天每组处死3只小鼠,取肺组织和鼻甲骨测病毒滴度和载量。结果 感染后疫苗与模型组小鼠体重下降明显,疫苗组存活率为10%,模型组全部死亡。感染后第4天疫苗组鼻甲骨滴度显著低于模型组。血凝抑制试验及中和实验表明免疫小鼠血清无中和H7N9病毒抗体。结论 季节性流感疫苗在小鼠中对于H7N9流感病毒感染无明显保护作用。     

三个品系小鼠流感病毒气溶胶感染模型的比较

[摘要] 目的 通过气雾攻击产生气溶胶的感染方式对三个品系的小鼠分别进行感染,比较三个品系小鼠在感染过程中的感染差异,从而对三个品系小鼠流感模型的特点进行分析,为流感发病机制的研究及疫苗和药物的开发选择合适的感染模型提供参考。方法 选用A/Puerto Rico/8/34（H1N1）病毒株,采用气雾攻击的方法感染近交系C57BL/6、BALB/c和远交群 ICR三个品系的小鼠,每日称小鼠体重,肉眼观察小鼠状态,分别于感染后3d,7d,14d处死小鼠,取肺脏称其湿重,进行肺脏的病毒测定及病理观察。结果 三个品系小鼠均可感染,其中C57BL/6小鼠的存活率低于其他两个品系,3d 的肺指数和病毒载量均明显高于ICR小鼠（P<0.05),镜下病理结果显示较其他两个品系也更明显。BALB/c小鼠与其他两个品系小鼠相比,体重在后期的恢复最慢,存活率比 C57BL/6高但比ICR低;肺指数和病毒载量与其他两个品系相比没有显著差异;镜下病理改变相似,但弱于C57BL/6强于ICR。ICR小鼠的发病进程与其他两个品系小鼠基本相似,但体重、存活率、肺指数、病毒载量及镜下病理改变等指标均弱于其他两个品系。结论 三个品系小鼠均可建立流感气溶胶模型,但感染后的三个模型各有特点,在实验中可以根据不同的研究目的来选用合适的小鼠品系建立模型。     

A(H1N1)甲型流感病毒基因多态性对病毒复制及毒力的影响研究

目的研究A(H1N1)甲型流感病毒基因多态性对病毒复制及毒力的影响。方法选择A/Californ ia/04/2009,A/S ichuan/1/2009和A/Be ijing/3/2009 3株病毒,分别感染MDCK细胞,测定病毒RNA载量和病毒效价;同时滴鼻接种BALB/c小鼠,检测小鼠感染后的多项指标,观察期为14天。另一方面,对3株病毒的全基因组进行测序及序列比对,对其基因突变情况及多态性进行分析。结果 A/S ichuan/1/2009株相较而言具有较高的复制能力及毒力,序列分析结果显示全基因中有5个氨基酸发生了突变,其中PA蛋白中343位点的A突变为T,PB1蛋白中353位点的K突变为R,566位点的T突变为A,PB2蛋白中471位点的T突变为M,对病毒毒力的增强起重要作用。结论 A(H1N1)甲型流感病毒基因组多态性与其复制及毒力密切相关。