靶向EGFR基因RNA干扰对人卵巢癌SKOV_3细胞增殖的抑制作用

目的 利用RNA干扰技术下调表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因的表达,观察其对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响.方法 构建针对EGFR基因的siRNA真核表达载体,转染入卵巢癌SKOV_3细胞中,并筛选稳定表达siRNA的转化克隆,RT-PCR及Western blot分别检测EGFR mRNA和蛋白表达,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,克隆形成实验及MTY法检测细胞克隆形成率及细胞体外的增殖情况.结果 成功构建表达质粒pGenSil-HK、pGcnSil-EGFRI和pGenSil-EGFR2,并转染SKOV,细胞,通过G418筛选后获得稳定转染克隆,RT-PCR及Western blot分析表明转染pGenSil-EGFRI、pGenSil-EGFR2后的细胞EGFR mRNA和蛋白表达均受到了明显抑制,FGFR mRNA抑制率分别为41.87%和68.07%,蛋白表达抑制率分别为45.21%和70.25%.与未转染组和pGenSil-HK组相比,pGenSil-EGFR2组细胞凋亡比例显著增加,G_1期细胞增多,而S期细胞减少(P<0.05);转染pGenSil-HK组克隆形成率为(0.82±0.03),转染pGenSil-EGFR2组克隆形成率为(0.61±0.04),二者比较差异显著(P<0.05),MTT显示细胞培养36 h后,pGenSil.EGFR2组的细胞生长均显著低于未转染组和转染pGenSil-HK组(P<0.05).结论 靶向EGFR基因RNA干扰能够阻抑卵巢癌SKOV_3细胞中的EGFR表达,诱导细胞凋亡、调控细胞周期再分布、抑制细胞增殖.     

LncRNA MEG3对人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭及凋亡的影响

目的 应用靶向长链非编码RNA母系表达基因3(LncRNA MEG3)的过表达重组质粒来转染体外培养的人脑胶质瘤细胞,从而观察其对人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.方法 应用qRT-PCR法检测正常脑组织细胞(N)和胶质瘤细胞系U251中LncRNA MEG3 mRNA的表达情况.构建pCI-MEG3真核过表达载体,转染体外培养的人脑胶质瘤细胞系U251,作为pCI-MEG3过表达质粒组(pCI-MEG3组);空pCI质粒转染体外培养的人脑胶质瘤细胞系U251,作为空载体pCI组(pCI组);无质粒转染的人脑胶质瘤细胞系U251,作为空白对照组(Control组).采用qRT-PCR 分析LncRNA MEG3基因表达变化,Western blot法分析LncRNA MEG3相关蛋白MDM2和p53表达变化,MTT法和细胞克隆技术分析胶质瘤细胞增殖能力,Transwell技术分析胶质瘤细胞侵袭能力,流式细胞技术分析胶质瘤细胞凋亡率.结果 与正常脑组织细胞比较,胶质瘤细胞中LncRNA MEG3 mRNA表达水平降低.体外实验显示,与Control组和pCI 组比较,pCI-MEG3组 LncRNA MEG3 mRNA 及 p53蛋白表达水平均有上调(P＜0.05),MDM2蛋白表达下调(P＜0.05),细胞增殖能力受到抑制(P＜0.01),细胞侵袭能力也受到抑制(P＜0.01),细胞凋亡率升高(P＜0.01).结论 人脑胶质瘤细胞中LncRNA MEG3的表达水平低于正常人脑组织细胞,靶向LncRNA MEG3基因的过表达重组质粒能够增加人脑胶质瘤细胞内LncRNA MEG3的表达,从而抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力,同时增加其凋亡率.     

IL-12siRNA对脑胶质瘤细胞增殖与分化的影响

目的 观察IL-12 siRNA对脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响.方法将含有IL-12 siRNA的表达质粒稳定转染人脑胶质瘤细胞,应用MTT法及AO/EB染色观察脑胶质瘤细胞的增殖与凋亡情况.结果转染后,MTT法显示IL-12 siRNA组中的细胞生长受抑明显,AO/EB染色显示IL-12siRNA组的凋亡率较阴性对照组及空载体组高.结论 IL-12siRNA靶向干扰了IL-12蛋白的表达,并对脑胶质瘤细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用.     

干扰RNA抑制EGFR对乳腺癌细胞放射敏感性的影响

目的采用干扰RNA技术(small interfering RNA,siRNA)抑制SKBR-3,即HER-2(+++),EGFR(+++)乳腺癌细胞EGFR的表达,研究EGFR受抑制后HER-2过表达细胞对X线敏感性的变化.方法质粒转染及鉴定:将细胞随机分为实验组、阴性对照组和空白组,重组质粒EGFR-siRNA和Neg-siRNA分别被转染入实验组及阴性对照组;Western blot检测各组细胞EGFR的表达水平;6MV射线照射4 Gy后0,24 h,48 h收集细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率;克隆形成实验检测细胞D0,SF2和α等值.结果质粒转染SKBR-3细胞,Western分析表明转染EGFR-siRNA的阳性细胞株在蛋白质水平受到明显抑制;X线照射24 h及48 h后,EGFR表达受抑制细胞凋亡率均高于转染阴性质粒组和空白对照组(P分别为0.045及0.039);EGFR受抑制的细胞D0值和SF2值分别为1.218和0.376,α值为0.335.结论运用RNAi技术可以有效抑制EGFR的表达从而提高SKBR-3细胞对X线的放射敏感性,EGFR是一个较理想的肿瘤分子治疗靶点.     

RNAi抑制MCF7细胞Lon基因后的生物学效应

目的 通过构建Lon基因表达下调的哺乳动物细胞模型,观察Lon基因对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计针对Lon蛋白酶基因的小干扰RNA(siRNA),构建pSilencer U6 2.1-Lon真核表达载体,并用脂质体法转染人乳腺癌细胞MCF7.RT-PCR法检测Lon基因下调的水平,通过采用高温、紫外线照射、顺铂处理,观察Lon基因下调后细胞敏感性的变化(MTT法);流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡的作用.结果 RT-PCR显示重组质粒pSilencer U62.1-Lon转染MCF7细胞后,Lon基因明显下调,RT-PCR未见扩增目的条带,细胞培养结果显示细胞增殖能力明显减弱.MTT结果显示,pSilencer U6 2.1-Lon转染的MCF7细胞经紫外线照射和顺铂处理后,增殖能力明显下降,与空载体转染组和未转染组相比有显著差异(P＜0.05).加热应激实验显示,41℃处理后,RNA干扰转染组(pSilencer U6 2.1-Lon)与空载体转染组(pSilencer U6 2.1)、未转染组相比有显著性差异(P＜0.05).而在43℃和45℃时,3组之间均无显著性差异(P＞0.05).流式细胞术检测pSilencer U6 2.1-Lon质粒组细胞凋亡率为(22.47±3.15)%,相对于空载体转染组的(2.3±0.9)%和无质粒转染组的(1.14±0.79)%有明显提高,而空载体转染组和无质粒转染组相比无明显差异.结论 RNAi能有效下调Lon蛋白的表达.Lon基因的下调可抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖,诱导细胞凋亡,并可增加MCF7细胞对紫外线和顺铂的敏感性.     

siRNA介导表皮生长因子受体基因沉默导致HepG2凋亡

目的：研究含有与EGFR基因序列相同的19nt序列RNAi质粒针对HepG2细胞表皮生长因子受体的RNA干扰效果。方法：用pSIREN-hE转染细胞，其质粒骨架为RNAi-Ready pSIREN-Shuttle Vector，含有可以被U6启动子转录成shRNA的寡核苷酸链，大小为69nt，含有2段19nt的寡核苷酸，用于编码EGFR基因的RNA干扰的siRNA的正义链及反义链，评价该RNAi质粒对人肝细胞癌细胞株（HepG2）EGFR基因的mRNA表达抑制效果及对细胞凋亡的作用。结果：HepG2细胞EGFR基因的mRNA被明显抑制并伴有凋亡增加。结论：含有与EGFR基因序列相同序列RNA质粒对EGFR基因的RNA干扰可能是治疗肝细胞癌的一种有效手段。     

MTA1靶向RNA干扰对人肝癌HepG2细胞生物学行为影响的研究

目的 观察转移相关基因1(MTA1)特异性siRNA对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响.方法 体外构建2个MTA1特异性siRNA表达载体(pRNAi-1、pRNAi-2),实验分为脂质体对照、空质粒转染对照及MTA1 siRNA重组质粒转染组,转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量RT-PCR检测MTA1 mRNA表达情况,检验其对细胞的RNA干扰效果;采用MTT法分析其对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测其对细胞周期的影响.结果 测序表明MTA1干扰序列完全正确;pRNAi-1与pRNAi-2表达质粒有效抑制肝癌细胞株HepG2细胞中MTA1的表达,MTT 法检测结果显示转染重组质粒组细胞体外生长的抑制率高于脂质体对照组和空质粒对照组(P<0.01);流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组(P<0.01).结论 成功构建了MTA1干扰真核表达载体,重组MTA1特异性siRNA质粒可抑制肝癌细胞中MTA1的表达,并抑制肝癌细胞生长,促进其凋亡.     

血管内皮生长因子_(165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的　探讨应用血管内皮生长因子165(VEGF165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的可行性。方法　构建和鉴定反义VEGF165真核表达载体 ;将其转染入人脑胶质瘤细胞SHG44 ,检测其转染前、后的生物学性状 ;比较转染前、后SHG44细胞的裸鼠皮下致瘤性 ;分别应用免疫印迹、免疫组织化学、微血管计数、电镜和流式细胞仪检测上述改变。结果　成功构建反义VEGF165真核表达载体并在SHG44细胞获得表达 ,该细胞生物学性状不受外源基因表达影响 ,其在裸鼠皮下致瘤性和血管生成能力明显下降。肿瘤终体积 :实验组 2 12mm3,对照组 7897mm3(P <0 .0 1) ;血管计数 :实验组 5 .5 0 ,对照组11 2 2 (P <0 .0 1)。结论　VEGF165反义RNA能有效抑制人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长 ,为基因治疗实体瘤奠定了基础     

靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的 构建具有特异性瘦素（leptin）基因小于扰RNA（small interfering RNA，siRNA）功能的表达质粒，研究靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）中leptin表达及HSC生物学特性的影响。方法 以leptin为目的基因，以产生siRNA质粒载体psiRNA-hHlneo为表达模板，细胞内转录合成4对特异的siRNA和1对对照siRNA。构建能在真核细胞中表达的重组质粒leptinsi RNA，用酶切方法和测序法对重组体进行鉴定。应用脂质体介导重组质粒转染HSC。RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测HSC的leptin表达情况，用MTT法检测细胞增殖，用流式细胞仪分析细胞凋亡。结果 酶切和序列测定表明，成功构建了leptinsiRNA表达质粒；外源重组质粒siRNA3和siRNA4能够抑制leptinm RNA和蛋白表达（均P〈0．01）；HSC增殖活性显著降低（P〈0．05），凋亡增加（P〈0．01）。与未转染组相比，consiRNA、siRNA1和siRNA2转染组没有显著改变（均P〉0．05）。结论 构建的leptinsi RNA表达载体可减少leptin的表达，抑制HSC增殖并诱导其凋亡。为肝纤维化基因治疗提供了新的靶点。     

PLCε siRNA转染对膀胱癌细胞株T24侵袭能力的影响

目的:研究磷脂酶C-ε(Phospholipase C epsilon,PLCε)siRNA表达质粒的转染对人膀胱癌细胞系T24侵袭转移能力的影响.方法:分别将携有PLCε siRNA基因的真核表达质粒两对p11-PLCε和p12-PLCε载体体外转染T24细胞,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测PLCε mRNA的表达情况,应用Transwell小室侵袭试验、明胶酶谱分析分别研究转染前、后膀胱癌细胞侵袭转移能力的变化,并以空载质粒HK-A转染和未转染细胞为对照.结果:RT-PCR检测显示p11-PLCε,p12-PLCε转染成功后T24细胞PLCεmRNA表达明显比空质粒HK-A转染和未转染细胞减弱;p12-PLCε siRNA转染细胞穿透侵袭小室滤膜的数目(26.8±5.8)和p11-PLCεsiRNA转染细胞穿透侵袭小室滤膜的数目(25.8±6.2)明显少于未转染细胞(34.8±6.9)和HK-A转染细胞(33.8±5.7)(P＜0.01);明胶酶谱分析显示转染P11-PLCε、p12-PLCε均使细胞分泌MMP-2、MMP-9明显低于未转染细胞和HK-A转染细胞.结论:推测转染外源性PLCεsiRNA基因能下调PLCε基因的表达并能抑制膀胱癌细胞侵袭转移.     

表皮生长因子受体反义基因转染对人恶性胶质瘤细胞体外生长的影响

目的探讨表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）反义基因转染对人恶性胶质瘤细胞Ｕ８７ＭＧ体外生长的影响。方法构建ＥＧＦＲ反义基因表达载体，应用脂质体转染法将其导入Ｕ８７ＭＧ细胞；ＰＣＲ方法鉴定转染克隆；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交检测ＥＧＦＲ蛋白表达水平；通过绘制生长曲线和软琼脂集落形成实验测定反义ＥＧＦＲ基因对恶性胶质瘤细胞体外生长的抑制作用。结果转染反义ＥＧＦＲ基因的细胞克隆株ＡＳ１ＡＳ６的ＥＧＦＲ蛋白表达水平均有不同程度的降低；ＡＳ１ＡＳ６细胞体外生长明显减慢，ＡＳ１ＡＳ６细胞克隆形成率明显降低。表明Ｕ８７ＭＧ细胞体外生长速度和恶性转化能力均与ＥＧＦＲ表达呈正相关。结论反义ＥＧＦＲ基因转染可以明显抑制Ｕ８７ＭＧ细胞生长，ＥＧＦＲ对Ｕ８７ＭＧ细胞生长具有重要的调控作用     

表皮生长因子受体反义基因转染对人恶性胶质细胞体外生长的影响

目的 探讨表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）反义基因转染对人恶性胶质瘤细胞Ｕ８７ＭＧ体外生长的影响,方法 构建ＥＧＦＲ反义基因表达载体,应用脂质体转染法将其导入Ｕ８７ＭＧ细胞,ＰＣＲ方法鉴定转染单克隆,Ｗｅｓｔｅｍ印迹杂交检测ＥＧＦＲ蛋白表达水平。通过绘制生长曲线和软琼脂集落形成实验测定反义ＥＧＦＲ基因对恶性胶质瘤细胞体外生长的抑制作用,结果 转染反义ＥＧＦＲ基因的细胞克隆株ＡＳ１－ＡＳ６的ＥＧＦＲ蛋白     

RNAi技术抑制乳腺癌细胞表皮生长因子受体表达的在体实验研究

目的 探讨采用体外化学合成的小干扰RNA(siRNA)结合阳离子脂质体是否能有效在体转染乳腺癌细胞,以期为RNAi的在体实验研究提供实验数据和理论依据.方法 (1)建立裸鼠肿瘤动物模型,计算成瘤率.(2)体外转染乳腺癌细胞,常规动物接种,测量肿瘤体积和动物重量,计算肿瘤抑制率.(3)采用免疫组化和Western blotting技术测定肿瘤组织的表皮生长因子受体蛋白水平,采用Real-time PCR检测表皮生长因子受体基因水平,采用ELISA检测动物血清及肿瘤抽提蛋白中EGF含量.结果 MDA-MB-231、ZR-75细胞成瘤率依次为30.00%、88.89%,MDA-MB-231细胞的成瘤能力明显弱于ZR-75细胞.ELISA检测结果证实dsRNA-表皮生长因子受体可将血清及肿瘤组织抽提蛋白中的EGF含量分别降低16.77%、12.59%.Real-time PCR结果表明dsRNA-表皮生长因子受体可将表皮生长因子受体基因表达下调21.05%.结论 (1)采用体外化学合成的siRNA结合阳离子脂质体可有效在体转染乳腺癌细胞.(2)在体实验中RNAi效应持续的时间明显长于体外实验.(3)针对表皮生长因子受体基因序列设计的siRNA可作为极具开发前途的抗肿瘤新药,其在体实验中触发RNAi可能的作用机制尚需进一步深入探讨.     

Targeted silencing of heparanase gene by small interfering RNA inhibits invasiveness and metastasis of osteosarcoma cells

The effects of targeted silencing of heparanase gene by small interfering RNA(siRNA) on invasiveness and metastasis of osteosarcoma cells(MG63 cells) were investigated in the present study.Two complementary oligonucleotide strands were synthesized and inserted into pGenesil-1 vector based on the mRNA sequence of heparanase gene.The expression vector containing short hairpin RNA(pGenesil-shRNA) was constructed successfully.MG63 cells were randomly allocated into 3 groups:blank group,empty vector(pGenesil) transfected group and expression vector(pGenesil-shRNA) transfected group.Under the induction of Lipofectamine 2000,the recombinants were transfected into MG63 cells.Heparanase gene expression level was detected by RT-PCR and Western blotting.Cell prolifera-tion was measured by MTT assay.Cell invasiveness and metastasis were examined by cell adhesion and Transwell-ECM assays.HUVECs migration assay was applied for the detection of angiogenesis.As compared with negative controls,the mRNA and protein expression levels of heparanase were down-regulated by 76.1%(P<0.01) and 75.3%(P<0.01) respectively in the pGenesil-shRNA transfected group.Meanwhile,the proliferation,adhesiveness,invasiveness and angiogenesis properties of MG63 cells were all significantly inhibited.It was suggested that targeted silencing of heparanase gene by siRNA could dramatically inhibit the invasiveness and metastasis of osteosarcoma cells.     

EGFR反义RNA的转染对人类鼻咽癌CNE-2细胞EGFR的表达下调及恶性表型的抑制

目的利用反义RNA 抑制靶基因表达的策略,下调EGFR的表达而探讨对人类低分化鼻咽癌CNE-2细胞的恶性表型的抑制性效应。方法将人EGFR的N-端1.35kb片段反向构建入逆转录病毒表达载体pLXSN中,并用脂质体介导转染人鼻咽癌CNE-2细胞,G418筛选并分离阳性克隆,将两个EGFR 反义cDNA转染的克隆细胞命名为CNE-2/AS4 和CNE-2/AS8,而空载体转染的细胞命名为CNE-2/pLXSN。125I-EGF配体结合分析细胞膜上EGFR的表达,台盼蓝染色法测定细胞生长的改变,并用软琼脂集落形成实验检测细胞转化,最后,将筛选的各组阳性克隆细胞分别注射入裸鼠皮下,不同时间观察肿瘤生长的抑制改变及肿瘤的转移状况。结果配体结合实验结果显示,两个选择的克隆CNE-2/AS4 和CNE-2/AS8细胞表面EGFR的数量分别较未转染细胞CNE-2下降18%、45%,表明EGFR反义RNA的表达下调了细胞膜上EGFR的表达;同时,EGFR反义RNA表达的CNE-2细胞生长速率和软琼脂生长能力也较对照组细胞明显降低。注射入裸鼠皮下后,EGFR反义RNA表达的阳性克隆细胞表现出肿瘤生长减慢,淋巴结和肺转移能力也明显降低。结论这些实验结果提示EGFR 反义cDNA转染的CNE-2细胞能下调EGFR的过量表达并部分抑制鼻咽癌的恶性表型,这为进一步阐明EGFR在鼻咽癌的发生、演化中的功能作用提供了有用的工具     

解整合素金属蛋白酶10基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒载体,为进一步体内外实验研究提供基础。方法:筛选确定ADAM10基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与LentiLox3.7载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用重组慢病毒转导传代心肌细胞(H9C2),通过Western blotting检测心肌细胞ADAM10的蛋白表达。结果:获得的载体插入ADAM10的shRNA核苷酸链序列正确,包装的慢病毒颗粒转导心肌细胞,与对照组比较ADAM10 shRNA转染成功抑制ADAM10蛋白表达。结论:成功构建AD-AM10 shRNA慢病毒载体,为其在扩张型心肌病(DCM)中的生物学功能研究奠定基础。     

应用载体介导的RNAi技术抑制Bcl-2的表达

目的　应用载体介导的RNAi技术特异地干扰抗凋亡基因bcl 2在HeLa细胞中的表达。方法　构建利用H1启动子转录功能性siRNA的载体 ;在H1启动子下游分别插入含不同bcl 2基因特异性序列的 64nt寡核苷酸片段 ;将构建的质粒转染HeLa细胞 ,以间接免疫荧光和免疫印迹检测转染后细胞中Bcl 2的表达水平。结果　 3种含不同bcl 2特异性序列的质粒转染后均能干扰该基因在细胞中的表达 ,但干扰的效果存在差异 ,从 45 %～ 83 5 %。结论　本研究建立的载体介导的RNAi技术可成功地用于干扰Bcl 2在HeLa细胞中的表达     

EGFR反义RNA的转染对人类鼻咽癌CNE－2细胞EGFR的表达下调及恶性表型的抑制

目的 利用反义RNA抑制靶基因表达的策略，下调EGFR的表达而探讨对人类低分化鼻咽癌CNE-2细胞的恶性表型的抑制性效应。方法 将人EGFR的N-端1．35kb片段反向构建人逆转录病毒表达载体pLXSN中，并用脂质体介导转染人鼻咽癌CNE-2细胞，G418筛选并分离阳性克隆，将两个EGFR反义cDNA转染的克隆细胞命名为CNE-2／AS4和CNE-2／AS8，而空载体转染的细胞命名为CNE-2／pLXSN。125I-EGF配体结合分析细胞膜上EGFR的表达，台盼蓝染色法测定细胞生长的改变，并用软琼脂集落形成实验检测细胞转化，最后，将筛选的各组阳性克隆细胞分别注射人裸鼠皮下，不同时间观察肿瘤生长的抑制改变及肿瘤的转移状况。结果配体结合实验结果显示。两个选择的克隆CNE-2／AS4和CNE-2／AS8细胞表面EGFR的数量分别较未转染细胞CNE-2下降18％、45％，表明EGFR反义RNA的表达下词了细胞膜上EGFR的表达；同时，EGFR反义RNA表达的CNE-2细胞生长速率和软琼脂生长能力也较对照组细胞明显降低。注射入裸鼠皮下后，EGFR反义RNA表达的阳性克隆细胞表现出肿瘤生长减慢。淋巴结和肺转移能力也明显降低。结论这些实验结果提示EGFR反义cDNA转染的CNE-2细胞能下调：EGFR的过量表达并部分抑制鼻咽癌的恶性表型，这为进一步阐明：EGFR在鼻咽癌的发生、演化中的功能作用提供了有用的工具。     

RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉默对肺癌细胞定植和转移的影响

目的构建针对人MAGE3基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,观察RNA干扰介导的MAGE3基因表达默寂对肺癌细胞定植和转移的影响.方法设计MAGE3靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneoGFP载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人肺癌细胞NCI-H446,采用RT-PCR和Western印迹检测MAGE3基因mRNA和蛋白表达水平的变化.用软琼脂克隆形成实验和细胞体外侵袭实验,观察对肿瘤形成能力和侵袭力的影响.结果把针对MAGE3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSUPERneoGFP载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western印迹检测显示, MAGE3基因的表达水平明显降低;转染siRNA表达载体组的肺癌细胞在软琼脂中形成克隆数和穿透Matrigel的细胞数都显著下降,与未转染和转染空载体组比较差异有显著性（P﹤0.05）.结论成功构建了针对MAGE3基因的siRNA载体, RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉寂可有效降低肺癌细胞定植和转移.     

靶向ST6GalⅠ的siRNA与反义寡核苷酸联合应用对结肠癌细胞转移能力的影响

目的 探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal Ⅰ)小分子干扰RNA(siRNA)及其与相同或不同靶点的反义寡核苷酸(ASO)联合应用,对ST6GalⅠ高表达的结肠癌SW480细胞的粘附和侵袭力的影响.方法 设计并合成靶向ST6GalⅠ的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染SW480细胞.实验分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组、ASO1组(与siRNA不同靶点)、ASO2组(与siRNA相同靶点)、siRNA ASO1组及siRNA ASO2组,应用RT-PCR测定细胞中ST6GalⅠ Mrna水平,流式细胞术检测细胞表面α2,6-唾液酸含量,分别用CytoMatrixTM细胞粘附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质的粘附与侵袭力.结果 siRNA组、ASO1组、ASO2组、siRNA ASO1组、siRNA ASO2组中,SW480细胞的ST6GalⅠ Mrna表达水平、细胞表面α2,6-唾液酸含量及细胞对ECM的粘附与侵袭力均明显低于空白对照组、脂质体对照组(P＜0.05),以siRNA ASO1组最明显,且siRNA ASO1组与siRNA组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),而siRNA ASO2组与siRNA组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 化学合成的靶向ST6GalⅠ的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalⅠ基因的表达,继而降低细胞对ECM的粘附和侵袭力,并且与不同靶点的ASO联合应用具有相加和协同效应.