Detection of HBV and HCV Coinfection by TEM with Au Nanoparticle Gene Probes

Gold(Au) nanoparticle HBV DNA or HCV cDNA gene probes were prepared and were used to detect HBV DNA and HCV RNA extracted from positive serum of patients with HBV and HCV coinfection directly by transmission electron microscopy(TEM).PCR identifying HBV and HCV in serum of patients with HBV and HCV coinfection was established.Alkanethiol-modified oligonucleotide was bound with self-made Au nanoparticles to form nanoparticle HBV DNA or HCV cDNA gene probes through covalent binding of Au-S.HBV DNA and HCV RNA extracted from positive serum of patients with HBV and HCV coinfection was added to the detection system composed of nanoparticle HBV DNA and(or) HCV cDNA gene probes.The results showed that HBV DNA and HCV RNA could be specifically amplified by PCR.The zones of DNA amplification appeared in 431 bp and 323 bp respectively.When HBV DNA and HCV RNA extracted from positive serum of patients with HBV and HCV coinfection were added to the detection system,TEM displayed the nanoparticles self-assembled into large network aggregates.It was concluded that the detection of HBV and HCV coinfection by TEM was convenient and efficient with high specificity and sensitivity.     

高通量测序分析miRNAs在胃癌新鲜组织与石蜡包埋组织中的表达

目的 利用二代测序技术对FFPE标本进行高通量测序及相关的生物信息学分析,探讨miRNAs在来源于石蜡包埋胃癌组织(FFPE)中的标本检测的可靠性,探讨其临床意义.方法 选取2015年和2016年2例胃癌患者手术切除同一组织的FFPE和新鲜冰冻标本,从标本中提取RNA并分离构建small RNA文库,采用Illumina测序平台测序的方法对其进行高通量测序,统计各已知miRNAs家族序列的表达量,构建已知miRNAs表达谱,对标本miRNAs进行Spearman相关性分析,评估miR-NAs表达量的差异变化情况.结果 新鲜冰冻标本中提取的总RNA质量较高,RNA保存度完整,显示28S是18S的1.3～1.4倍,从石蜡组中提取的RNA,结果显示有不同程度的降解,28S和18S的波峰不明显,miRNAs表达谱在冰冻和FFPE标本中,Spearman相关系数分别为0.90争0.86,两者miRNAs表达量较一致,具有相关性.结论 FFPE中的miRNAs仍然保持一定的完整性,且可通过二代测序进行肿瘤标本检测.     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

外周血细胞DNA、RNA及血红蛋白同时提取法

采用淋巴细胞分离液分离外周血中的有核细胞。经细胞裂解液处理，上清提取RNA，沉淀提取DNA，用分离液分离所得红细胞沉淀制备血红蛋白溶液，经对抽提物质量进行评价，发现3种提取物质量均高，本法能从少量外周血中同时分离DNA、RNA及血红蛋白，高效易操作，值得推广。     

同一细胞DNA和RNA同时分别提取的简便方法

本文探讨并建立了从同一细胞中同时提取细胞核DNA和细胞浆RNA的方法。经紫外分光光度仪扫描,生化测定以及电泳等方法的鉴定表明:提取的核酸无论从量还是从质上均可满足对DNA和RNA的各种实验研究。此法简便稳定,是从同一细胞中分别提取DNA和RNA的理想方法。     

RNA斑点印迹法检测人食管癌DNA聚合酶β的基因表达

目的 :探讨人食管癌组织DNA聚合酶 β(polβ)RNA水平的表达。 方法 :提取 5 1例食管癌患者的手术标本组织 ,包括 :17例癌灶组织 ,17例癌旁组织 ,17例“正常”组织细胞总RNA ,以生物素标记的polβcDNA探针进行RNA斑点印迹。结果 :DNApolβRNA水平的表达癌组织高于癌旁组织 (P <0 .0 5 ) ,癌旁组织高于“正常”组织 (P <0 .0 5 ) ,癌组织高于“正常”组织 (P <0 .0 1)。结论 :人食管癌组织及癌旁组织的DNApolβ基因RNA水平表达显著高于“正常”组织 ,提示DNApolβ的过表达可能在食管癌的发生、发展中起 作用。     

四种腺病毒核酸提取方法的比较

目的通过蛋白酶K法、苯酚法、病毒DNA/RNA提取试剂盒、腺病毒荧光PCR检测试剂盒等四种腺病毒核酸提取方法的比较,为进一步研究腺病毒的分子生物学特性选择合适的方法提供参考。方法以腺病毒感染的A549细胞为样品,分别以蛋白酶K法、苯酚法、病毒DNA/RNA提取试剂盒、腺病毒荧光PCR检测试剂盒等四种方法提取核酸,核酸经紫外分光光度计检测A260/A280的比值后,用荧光定量PCR方法检测核酸中腺病毒拷贝数浓度,并记录四种腺病毒核酸提取方法所需的操作时间。结果蛋白酶K法、苯酚法、病毒DNA/RNA提取试剂盒、腺病毒荧光PCR检测试剂盒等四种方法提取核酸的A260/A280的比值依次为1.85532、1.7377、1.81474和1.43934,核酸中腺病毒拷贝数浓度依次为4.9×105copies/mL、3.94×103copies/mL、2.66×106copies/mL和6.15×106copies/mL,提取核酸所需的时间分别为1.5、15、0.5和0.5h。结论四种腺病毒核酸提取方法中,蛋白酶K法简单快捷、成本低廉,适合一般实验室使用;苯酚法适合用于提取细胞培养上清中病毒的核酸;病毒DNA/RNA试剂盒...     

改良CTAB法提取连钱草基因组DNA

目的:建立高质量的连钱草基因组DNA的提取方法.方法:在传统十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法的基础上加以改良,比较不同浓度CTAB对提取的连钱草基因组DNA质量的影响,并对所得的DNA采用紫外分光光度计、电泳和PCR扩增等方法进行检测.结果:用2%浓度的CTAB处理所获得的基因组DNA质量较好,蛋白质残留少,RNA消...     

广西、云南、河南三省旋毛虫系统发生关系研究

目的分析广西、云南和河南三地旋毛虫核糖体大亚基（mt—lsr RNA）基因差异,确定三个分离株的系统发生关系。方法分别提取三地旋毛虫分离株基因组,特异性扩增mt—lsr RNA基因。对三地旋毛虫及Genbank已知的旋毛虫相应基因序列进行对比研究。构建系统发生树,分析4株旋毛虫系统发生树的拓扑结构,同时收集三地的地理气候等信息,分析三地旋毛虫系统发生关系。结果广西旋毛虫分离株和云南旋毛虫分离株、河南分离株的mt—lsrRNA基因高度相似,在407个碱基对中,三地旋毛虫分离株与Genbank中T．spiralis序列相比,基因序列相似度很高,三个分离株在同一个位点发生T—C变异,此外,河南旋毛虫分离株在376位发生1个T—A变异。构建的系统发生树显示,广西分离株与云南、河南分离株及Genbank中的T．spiralis在同一分枝,进化距离为0．0000,自引导值为100,高度同源。三地旋毛虫与其它种类旋毛虫分于不同分枝,相距较远。结论三地旋毛虫分离株均为同一虫种,即T．spirilas,虽然宿主、地理环境及气候等因素不同,但进化差异小,亲缘关系近。