蛋白激酶C与培养神经元缺氧后caspase-3表达及细胞凋亡关系的研究

目的 探讨蛋白激酶C（PKC）对神经元缺氧调亡的影响及作用机制。方法 建立体外培养Wistar胎鼠皮层神经元模型及培养神经元缺氧模型,用3种不同浓度的PKC催化亚基特异性抑制剂Calphostin C预孵育培养神经元后进行缺血处理,观察神经元下述指标的改变;神经元存活率、caspase-3（CPP32）和细胞凋亡的规律。结果 随着缺氧时间的延长和Calphostin C浓度的增加,培养神经元的存活数量显著下降、caspase-3和TUNEL荧光染色阳性率及平均荧光强度均显著升高。结论 ①PKCt caspase-3均参与了缺氧神经元调亡;②PKC抑制剂Calphostin C可加重缺氧神经元凋亡;且该作用是通过caspase-3信号转导途径实现的。③PKC的激活在缺氧神经元凋亡中起保护作用。     

蛋白激酶A在培养胎鼠皮层神经元缺氧凋亡中的作用

目的：探讨培养神经元缺氧后蛋白激酶A（PKA）活性变化及其与神经元凋亡的关系。方法：建立体外培养大鼠皮层神经元及培养神经元缺氧模型，用3种不同浓度的PKA抑制剂（Rp-cAMP）在不同的缺氧时相点观察神经元下述指标的改变神经元细胞和细胞质中PKA的活性，caspase-3(CPP32)和TUNEL表达（细胞凋亡）的规律。结果：随着缺氧时间的延长，培养神经元细胞膜PKA的活性显著增加，同时caspase-3和TUNEL荧光染色阳性率及平均荧光强度均显著升高，而应用Rp-cAMP后细胞凋亡，且该作用是通过caspase-3信号转导途径实现的；（3）PKA的激活在缺氧诱导的神经元凋亡中起促发作用。     

培养神经元缺氧后PKC活性变化与细胞凋亡关系的研究

目的：探讨蛋白激酶C（PKC）对神经元缺氧凋亡的影响及作用机制。方法：建立体外培养大鼠皮层神经元模型及培养神经元缺氧模型，用三种不同浓度的PKC催化亚基特异性抑制剂Clphostin C预孵育培养神经元后进行缺血处理，观察神经元胞膜PKC（mPKC)活性，Bcl-2表达和TUNEL表达（细胞凋亡）的规律。结果：随着缺氧时间的延长mPKC活性显著增加，同时伴随缺氧时间的延长和ClphostinC 浓度的增加，培养神经元Bcl-2的表达显著下降，TUNEL荧光染色阳性率显著升高，结果：（1)mpKC的活化和Bcl-2表达均参与了缺氧神经元凋亡；（2）缺氧和PKC抑制剂Clphostin C可加重缺氧神经元凋亡，且该作用是通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达实验的；（3）PKC的激活在缺氧神经元凋亡中起保护作用。     

PKCδ抑制剂减轻6-OHDA诱导的多巴胺能神经细胞凋亡

目的 观察蛋白激酶Cδ抑制剂在6-OHDA诱导多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y细胞凋亡过程中所起的作用,探讨帕金森病可能的分子发病机制.方法 体外培养SH-SY5Y细胞,观察PKC抑制剂对6-OHDA毒性作用的影响,分别用台盼蓝染色、流式细胞仪和透射电镜法观察细胞凋亡.结果 PKCδ抑制剂Rottlerin可减轻6-OHDA引起的细胞凋亡.而总PKC抑制剂Bisindolylmaleimide Ⅰ(Bis)和钙依赖性PKC(α和β)抑制剂G(o)6976不能减轻6-OHDA引起的细胞凋亡.结论 PKCδ抑制剂对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞凋亡产生保护作用,PKCδ可能直接参与了帕金森病人的神经元凋亡过程.     

蛋白激酶C激活调控FOS表达参与缺血诱导神经元凋亡的研究

目的：探讨蛋白激酶C（PKC）与神经元凋亡的可能机制，方法：采用大鼠全脑缺血模型，观察脑缺血／再灌流后PKC活性，FOS表达及神经元凋亡的变化。结果：脑缺血／再灌流可以导致PKC的移位激活伴FOS表达及神经元凋亡的增加；用蛋白激酶C抑制剂灯盏花可以阻止上述变化。结论：蛋白激酶C的激活可能通过促进FOS表达参与了脑缺血／再灌流诱导的神经元凋亡。     

大鼠肝脏缺血预处理保护效应引起的PKC活性改变及其下游通路P44/42MAPKs活性改变

目的 研究在肝脏缺血预处理保护效应中蛋白激酶C（protain kinase C,PKC）活性改变及细胞内信号转导机制.方法 建立大鼠肝脏缺血预处理模型,应用PKC抑制剂、激动剂和丝裂原激活的蛋白激酶激酶（mitogen activated protein kinase kinase,MEK）抑制剂,通过检测PKC和P44/42MAPKs磷酸化水平、HSP70表达量等的变化,同时观察光镜下细胞形态学变化.对相关数据进行统计学处理.结果 与缺血再灌注组比较,预处理组和PKC激动剂组的PKC磷酸化水平显著增高（P＜0.01）,P44/42MAPKs磷酸化水平、HSP70表达量明显增加,肝细胞结构改变较小.与缺血预处理组相比,PKC抑制剂组相应的观察指标呈相反变化,PKC磷酸化水平显著降低（P＜0.01）;MEK抑制剂组的P44/42MAPKs磷酸化激活显著减少,HSP70表达量降低,肝组织细胞结构出现较明显的改变.结论 体内缺血预处理保护作用中,PKC激活对P44/42MAPKs通路激活起到至关重要的作用,PKC对P44/42MAPKs起正性调控作用,HSP70表达受P44/42MAPKs调控.     

丝裂原活化蛋白激酶在大黄素收缩大鼠胃平滑肌细胞中的作用

[目的]研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在大黄素对大鼠胃平滑肌细胞收缩信号转导途径中的作用机制。[方法]酶解法分离的大鼠胃平滑肌细胞经过培养后分为3个实验组:空白对照组、大黄素组、蛋白激酶C(PKC)抑制剂组(Calphostin C 大黄素)。通过Western blotring方法分析p44／42 MAPK在不同实验组中的表达量变化。[结果]磷酸化p44／42 MAPK的表达量在对照组最少,大黄素组最多,抑制剂组表达量较大黄素组少;三组表达量的差别具有显著性(P值均<0．01)。[结论]磷酸化p44／42 MAPK的表达量变化说明,在相同实验条件下,PKC受抑制后,磷酸化p44／42 MAPK的表达明显低于未受抑制的试验组。本实验结果提示, PKC到p44／42 MAPK信号转导通路参与了大黄素对大鼠胃平滑肌细胞收缩活动的调节。     

蛋白激酶C和丝裂原活化的蛋白酶家族对缺血预处理肝脏的保护作用及其机制

目的 研究在肝脏缺血预处理保护效应中蛋白激酶C（PKC）活性改变及细胞内信号转导机制。方法 建立大鼠肝脏缺血预处理模型，应用PKC抑制剂、激动剂和丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）抑制剂，通过检测PKC和P44／42MAPKs磷酸化水平、HSP70表达量等的变化，同时观察光镜下细胞形态学损害。对相关数据进行统计学处理。结果 与缺血再灌注组比较．预处理组和PKC激动剂组的PKC磷酸化水平显著增高（P〈0.01），P44／42MAPKs磷酸化水平、HSP70表达量明显增加．肝细胞结构改变较小。与缺血预处理组相比，PKC抑制剂组相应的观察指标呈相反变化，PKC磷酸化水平显著降低（P〈0.01）；MEK抑制剂组的P44／42MAPKs磷酸化激活显著减少，HSP70表达量降低，肝组织细胞结构出现较明显的改变。结论 体内缺血预处理保护作用中，PKC激活对P44／42MAPKs通路激活起到至关重要的作用，PKC对P44／42MAPKs起正性调控作用．HSP70表达受P44／42MAPKs调控。     

蛋白激酶A和蛋白激酶C对大鼠背根神经节神经元P2X3受体介导的内向电流的调节作用

目的 探讨蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)对分离培养的背根神经节(DRG)神经元ATP受体P2X3功能的调节作用.方法 分离培养大鼠DRG神经元,给予外源性ATP诱导出瞬时型内向电流,通过全细胞膜片钳记录的方法观察P2X3和P2X2/3受体特异性阻断剂TNP-ATP对这一电流的影响,在此基础上观察PKA和PKC激动剂对ATP诱导的瞬时型内向电流的调节作用.结果 在分离培养的DRG神经元上,ATP诱导的瞬时型电流可以被TNP-ATP抑制,其抑制效应呈剂量依赖性,半数有效剂量(IC50)为(21.7±7.6)nmol/L.PKA激动剂forskolin(1 μmol/L)和PKC激动剂PMA(1 μmol/L)均可以快速、可逆地抑制ATP诱导的瞬时型电流.结论 在大鼠分离培养的DRG神经元,PKA和PKC可能通过磷酸化调节抑制P2X3受体的功能,从而抑制ATP诱导的瞬时型内向电流,提示蛋白激酶对P2X3受体的调节作用可能参与痛觉的形成.     

肾上腺髓质素刺激成骨细胞增殖的机制

目的:探讨肾上腺髓质素 (adrenomedullin;ADM) 对培养成骨细胞增殖的影响及其细胞内信号转导机制. 方法:分离培养胎大鼠颅骨成骨细胞,经 ADM孵育,3H-胸腺嘧啶(3H-thymidine, 3 H-TdR)参入法测定DNA合成,放射免疫法测定细胞-环磷酸腺甙(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)含量,用底物蛋白磷酸法测定蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)活性.结果:随ADM浓度(10-12～10-8 mol*L-1)增加,成骨细胞3H-TdR参入呈线性增加(r=0.998,P<0.01).ADM使成骨细胞cAMP含量和PKA、PKC、MAPK活性增加(P<0.05或P<0.01).PKC和MAPK激酶抑制剂能阻断ADM刺激成骨细胞3H-TdR参入增加的作用,而PKA和P38MAPK抑制剂对此无影响.结论:ADM能够刺激成骨细胞增殖,激活PKC和MAPK/ERK(细胞外信号调节激酶extracellular signal-regulated kinase),是其主要的细胞内信号转导途径,PKA、P38MAPK途径可能与此无关.     

人体甲状腺癌组织中蛋白激酶C和蛋白激酶A活性水平的测定

目的研究蛋白激酶C(protein KinaseC,PKC)和蛋白激酶A(protein kinaseA,PKA)在甲状腺癌发生过程中的作用.方法利用酶的放射分析方法测定手术切除经病理证实的18例甲状腺癌患者和17例甲状腺癌患者手术切除的肿瘤组织中PKC和PKA活性水平.结果甲状腺癌组织中胞膜和胞浆PKC活性分别为7.280±2.380和7.397±4.065,PKA活性水平为1.716±0.923.甲状腺癌组织中胞膜和胞浆PKC活性分别为0.515±0.676和0.347±0.332,PKA活性水平为0.646±0.324.胞浆部分PKC与PKA活性比值甲状腺癌组织为4.3;甲状腺癌组织为0.53.结论PKC与PKA均参入甲状腺癌细胞的增殖过程.     

bFGF对NIH3T3细胞TPK,PKC,ERK活性的影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对NIH3T3细胞酪氨酸蛋白激酶(TPK)、蛋白激酶C(PKC)及胞外调节蛋白激酶(ERK)活性的影响,探讨其信号转导机制.方法:分别加入bFGF及PKC抑制剂H-7、MEK1抑制剂PD98059孵育细胞,利用[γ-32P]ATP掺入外源性底物的方法测定活性.结果:bFGF可使细胞膜TPK、细胞质PKC及ERK活性明显升高.H-7 bFGF、PD98059 bFGF组与只加bFGF组比较TPK活性保持不变,而PKC及ERK活性均下降.结论:TPK、PKC、ERK介导bFGF的信号转导.ERK与PKC是TPK受体下游的两个分支,PKC与ERK可以互相激活.     

蛋白激酶C在心肌细胞肥大中的作用

目的 :要探讨蛋白激酶 C(PKC)在心肌细胞肥大中的作用机制。方法 :在培养新生大鼠心肌细胞上 ,通过测量心肌细胞表面积和 [3 H] -Leu的掺入量来判断心肌细胞肥大。结果 :肾上腺素能明显增加心肌细胞表现积和 [3H] -L eu的掺入量 ,PKC抑制剂 (Calphostin C)可抑制肾上腺素诱导的心肌细胞表面积和 [3 H] -L eu掺入量增加。结论 :PKC在肾上腺素诱导的心肌细胞肥大反应中起重要作用     

Parathyroid hormone-mitogen-activated protein kinase axis exerts fibrogenic effect of connective tissue growth factor on human renal proximal tubular cells

Background Enhanced and prolonged expression of connective tissue growth factor （CTGF） is associated with kidney fibrosis. Parathyroid hormone （PTH） is involved in the genesis of disturbed calcium/phosphate metabolism and ostitis fibrosa in renal failure. PTH activated mitogen-activated protein kinase （MAPK） signaling pathway is present in renal tubular cells. The aim of this study was to identify the mechanism how the signal is transduced to result in extracellular signal-regulated protein kinase （ERK） activation, leading to upregulation of CTGF.Methods The levels of CTGF mRNA and protein in human kidney proximal tubular cells （HK-2） treated with PTH in the presence or absence of the MAPK inhibitor PD98059 were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunoblotting assay. The activation of the CTGF promoter in HK-2 cells was determined by the dual-luciferase assay. The effects of the protein kinase A （PKA） activator 8-Br-cAMP and protein kinase C （PKC） activator phorbol 12-myristate 13-acetate （PMA） on MAPK phosphorylation, and the effects of the PKA inhibitor H89 and PKC inhibitor calphostin C on MAPK phosphorylation and CTGF expression were detected by immunoblotting assay.Results PD98059 inhibited the PTH stimulated expression of CTGF, which strongly suggested that the MAPK signaling pathway plays an important role in the PTH-induced CTGF upregulation in renal tubular cells. A PKA activator as well as PKC activators induced MAPK phosphorylation, and both PKA and PKC inhibitors antagonized PTH-induced MAPK phosphorylation and CTGF expression.Conclusion CTGF expression is upregulated by PTH through a PKC/PKA-ERK-dependent pathway.     

PKC信号传导通路在缺氧心肌细胞表达VEGF中的作用

目的：明确缺氧对心肌细胞表达血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）的影响及蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）信号传导通路在其中的作用。方法：将原代培养大鼠心肌细胞模型分组：①正常缺氧４组：Ａ组正常对照;Ｒ组缺氧６ｈ;Ｃ组缺氧１２ｈ：Ｄ组缺氧２４ｈ。②ＰＫＣ激动剂４组;Ａ组缺氧２４ｂ对照;Ｂ组加入ＰＭＡ１０ｎｇ／ｍｌ缺氧２４ｈ;Ｃ组加入ＰＭＡ１００ｎｇ／ｍｌ缺氧２４ｈ;Ｄ组加入ＰＭＡ１０００ｍｇ／ｍｌ缺氧２４ｈ。③ＰＫＣ抑     

PKC信号传导通路对缺氧人视网膜色素上皮细胞表达VEGF的作用

目的 :探讨蛋白激酶C(PKC)信号传导通路对缺氧状态下培养的视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞表达VEGF的作用 .方法 :在缺氧状态下分别培养人RPE细胞 6 ,1 2和 2 4h ;将不同浓度的PKC激动剂佛波醇 1 2 豆蔻酰 1 3乙酸 (phorbol 1 2 myristate 1 3 acetate,PMA)及PKC抑制剂Chelerythrine分别加入人RPE细胞培养液 ,在缺氧状态下培养 2 4h .用免疫组化方法检测各组RPE细胞中VEGF的表达 ,经计算机图像处理 ,定量分析 .结果 :在缺氧状态下 ,RPE细胞对VEGF的表达较非缺氧组RPE细胞显著增加 (P <0 .0 1 ) ;较对照组 ,PMA可增强缺氧状态下RPE细胞VEGF的表达 (P <0 .0 1 ) ,Chelerythrine则减弱VEGF的表达 (P <0 .0 1 ) .结论 :缺氧诱导VEGF在RPE细胞中的表达 ,其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的     

The signal transduction pathway in the proliferation of airway smooth muscle cells induced by urotensin Ⅱ

Background Human urotensin Ⅱ (UⅡ) is the most potent mammalian vasoconstrictor identified so far. Our previous study showed that UⅡ is a potent mitogen of airway smooth muscle cells (ASMC) inducing ASMC proliferation in a dose-dependent manner. The signal transduction pathway of UⅡ mitogenic effect remains to be clarified. This study was conducted to investigate the signal transduction pathway in the proliferation of ASMC induced by UⅡ. Methods In primary cultures of rat ASMCs, activities of protein kinase C (PKC), mitogen-activated protein kinase (MAPK) and calcineurin (CaN) induced by UⅡ were measured. The effect of CaN on PKC and MAPK was studied by adding cyclosporin A (CsA), a specific inhibitor of CaN. Using H7 and PD98059, inhibitors of PKC and MAPK, respectively, to study the effect of PKC and MAPK on CaN. The cytosolic free calcium concentration induced by UⅡ was measured using Fura-2/AM. Results UⅡ 10-7 mol/L stimulated ASMC PKC and MAPK activities by 44% and 24% (P&lt;0.01), respectively, after incubating for 20 minutes. It increased CaN activity in a time-dependent manner, being 1.68 times as that of control for 24 hours (P&lt;0.01). It promoted the cytosolic free calcium concentration increase of 18% (P&lt;0.01). CsA 10-6 mol/L and H7 50 μmol/L inhibited UⅡ-stimulated CaN activity by 45% (P&lt;0.01) and 21% (P&lt;0.05), respectively, while PD98059 50 μmol/L had no effect on CaN activity (P&gt;0.05). CsA 10-6 mol/L inhibited UⅡ-stimulated PKC activity by 14% (P&lt;0.05), while having no effect on MAPK activity (P&gt;0.05). Conclusions UⅡ increases cytosolic free calcium concentration and activates PKC, MAPK and CaN. The signal transduction pathway between PKC and CaN has cross-talk.