应用基因芯片技术检测金雀异黄素对乳腺癌T47D细胞雌激素受体相关信号通路基因表达的影响

目的 采用乳腺癌和雌激素受体信号通路DNA oligo microarray功能基因芯片技术,观察金雀异黄素(genistein)对雌激素依赖性乳腺癌细胞T47D乳腺癌相关的基因表达及雌激素受体依赖性信号转导通路的影响.方法 0.001 μmol/L雌二醇、10 μmol/L金雀异黄素分别处理T47D细胞48 h,收集细胞并提取总mRNA,通过逆转录反应将mRNA标记,并与Oligo GEArray芯片杂交,芯片经计算机扫描图像采集得出差异表达基因.结果 细胞周期蛋白(cyclin)基因Cyclin E1,CyclinE2与Cyclin A2表达均显著上调;ERα基因,雌激素诱导的相关基因PGR,TFF1/pS2,BCL2,ERBB2,C3,CCND1,TEF3,IGFBP2,IGFBP5,GATA3等也分别不同程度的上调,并采用实时荧光定量RT-PCR检测金雀异黄素可诱导pS2 mRNA表达.结论 金雀异黄素激活人乳腺癌T47D细胞ERα受体表达,通过周期蛋白过表达而调节细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的活性,加速S期进程,促进细胞的增殖,并且雌激素诱导基因的上调显示了金雀异黄素的植物雌激素作用.     

选择性雌激素受体调节剂对MC3T3-E1细胞生长分化的调节

目的探讨选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator,SERM)———雷洛昔芬对小鼠颅顶成骨细胞MC3T3-E1分化的调节及其机制。方法体外培养MC3T3-E1细胞,10-7mol/L的雷洛昔芬和雌激素受体拮抗剂ICI-182780刺激细胞,另设空白对照组,24、48、72 h后检测各指标。MTT法检测细胞增殖;微量酶标法检测细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性;实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测细胞内β-catenin,雌激素受体α、β(estrogen receptorα、β,ERα、ERβ)mRNA的表达。结果 MC3T3-E1细胞分别加入10-7mol/L的雷洛昔芬和ICI-182780后,相对于对照组,雷洛昔芬处理组的促细胞增殖作用较强,在24 h增殖率最高,达(55.93±10.88)%;ALP活性增加,在48 h活性增加率最高,为(30.881±5.614)%;β-catenin、ERα和ERβmRNA的表达均增高,有统计学意义(P<0.05)。ICI-182780组的促细胞增殖率、ALP活性降低;β-catenin、ERα和ERβmRNA的表达均降低,有统计学意义(P<0.05)。结论雷洛昔芬可能通过上调β-catenin、ERα和ERβmRNA的表达促进MC3T3-E1细胞的增殖分化,而ICI-182780则下调β-catenin、ERα和ERβmRNA的表达抑制MC3T3-E1细胞的增殖和分化。     

淫羊藿苷和淫羊藿素对乳腺癌T47D细胞增殖的影响

目的 研究淫羊藿苷及淫羊藿素对乳腺癌T47D细胞增殖的影响,探讨雌激素受体（ER）与其作用机制的关系。方法 用不同浓度的淫羊藿苷和淫羊藿素处理雌激素受体呈阳性的乳腺癌T47D细胞系后,MTT法检测T47D细胞增殖,流式细胞术检测T47D细胞周期的变化,Western blotting法检测T47D细胞ERα和ERβ蛋白表达。结果 淫羊藿苷和淫羊藿素浓度为1×10^?9～1×10^?6 mol/L,能显著促进T47D细胞增殖,且该作用可被雌激素受体拮抗剂ICI 182.780（1×10^?6 mol/L）所拮抗。与对照组相比,淫羊藿苷和淫羊藿素1×10^?7 mol/L使S期T47D细胞比例明显增加,增殖指数显著升高,但该作用可被ICI 182.780抑制。淫羊藿苷和淫羊藿素1×10^?7 mol/L还可显著增加ERα、ERβ蛋白表达（P＜0.01）。结论 淫羊藿苷和淫羊藿素均可显著促进T47D细胞增殖,该作用可能是通过上调胞内ERα、ERβ蛋白表达介导的。     

雌激素对MCF-7细胞P2Y2 mRNA的抑制作用

目的探讨在MCF-7细胞株中雌激素是否影响P2Y2 mRNA的表达。方法取生长良好的MCF-7细胞,以不同浓度17β-雌二醇(17β-E2)、雌激素受体(ER)拮抗剂ICI182780、ERα拮抗剂MPP和ERβ拮抗剂PHTPP作用于细胞,应用实时定量RT-PCR方法测定细胞中P2Y2受体mRNA表达。结果在MCF-7细胞中,雌激素(1nmol/L～1μmol/L)下调P2Y2 mRNA的表达量从对照组的(73.79±8.91)%减少至对照组的(53.68±5.90)%,这种下调作用可以被ER拮抗剂ICI182780(1μmol/L)拮抗,ERα的拮抗剂MPP(50μmol/L)可以部分阻断雌激素(0.1μmol/L)的作用,而ERβ拮抗剂PHTPP(50μmol/L)对雌激素(0.1μmol/L)的作用无影响。结论雌激素通过ERα抑制P2Y2 mRNA的表达,这一途径可能参与了雌激素对MCF-7细胞的促增殖作用。     

大豆苷元对HEC-1B细胞增殖及雌激素受体报告基因表达的影响

目的探讨大豆苷元对子宫内膜癌细胞增殖的影响及其对雌激素受体报告基因表达的影响。方法体外培养子宫内膜癌细胞子宫内膜癌雌、孕激素受体阴性细胞系(HEC-1B),采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测不同浓度大豆苷元对子宫内膜癌细胞增殖的影响,同时检测大豆苷元对雌激素应答原件(ERE)调控的雌激素受体α(ERα)和雌激素受体β(ERβ)的荧光素酶报告基因表达的影响。结果大豆苷元对HEC-1B细胞体外增殖有明显抑制作用,差异有统计学意义(P<0.01),其抑制作用有明显量效和时效性特征。在浓度为20～80×10-6mol/L的大豆苷元作用下,报告基因luc的表达较正常对照组明显提高,差异有统计学意义(P<0.05),在80×10-6mol/L时到达最高值;大豆苷元通过ERβ介导的报告基因表达水平的升高程度强于ERα,差异有统计学意义(P<0.01)。结论大豆苷元可通过调节子宫内膜癌细胞ERα和ERβ介导的报告基因的表达,调整ERα/ERβ比例,从而抑制子宫内膜癌细胞的增殖。     

雌激素对C6神经胶质瘤细胞的作用

目的　从细胞与分子水平观察雌激素受体 (ER)α,β2种亚型在C6神经胶质瘤细胞的表达 ,初步研究雌激素对大鼠C6星形神经胶质瘤细胞的细胞活性、增殖活动和细胞[Ca2 + ]i 水平的影响 .方法　应用细胞培养、免疫细胞化学、RT PCR技术、MTT法、3 H TdR掺入法和激光扫描共聚焦技术 .结果　①C6细胞中检测到ERβ免疫反应阳性物质 ,未发现ERα免疫反应阳性物质 ;②ERβmRNA在C6细胞中有表达 ,未检测到ERαmRNA ;③ 17β estradiol (10 -7～ 10 -5mol·L-1)可显著提高C6细胞活力 ,但对细胞增殖程度无明显的影响 ;④ 17β estradiol (10 -6mol·L-1)作用后数 10s后C6细胞 [Ca2 + ]i荧光强度显著增强 .结论　C6细胞表达ERβ的mRNA与蛋白 ,在神经胶质瘤细胞中ERβ可能是介导雌激素信号传递的关键环节 ;雌激素可发挥细胞保护作用 ;雌激素使细胞 [Ca2 + ]i增加 .     

雌激素受体α36介导雌激素促进甲状腺乳头状癌细胞增殖的分子机制

目的 研究雌激素受体α36(estrogen receptor alpha-36,ERα36)介导雌激素促进甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)细胞增殖的分子机制及相关信号通路.方法 采用免疫组化(S-P)检测ERα36在34例人PTC组织标本及其21例配对癌旁组织标本中的表达;梯度浓度E2(0、10-7、10-8、10-9 mol/L)处理PTC细胞株K-1和BCPAP后,Western blot检测两种细胞株中ERα36的表达;10-8 mol/L E2处理后,Western blot检测两种细胞株ERK1/2和AKT磷酸化水平的变化,以及ERα36-siRNA对其的抑制作用;梯度浓度的E2处理BCPAP细胞后,MTT法检测细胞增殖和ERα36-siRNA对增殖的抑制作用.结果 在人PTC组织中ERα36的阳性表达率为82.4％,明显高于癌旁组织(P＜0.05).PTC细胞株K-1和BCPAP均表达ERα36;10-8 mol/L E2处理细胞后,ERα36的表达增高,且呈时间依赖性.E2能促进BCPAP和K-1细胞ERK1/2和AKT蛋白磷酸化水平增高,且处理15 ain时BCPAP细胞最明显,10 min时K-1细胞最明显,而ERα36-siRNA能抑制E2的诱导效果;E2促进BAPAP细胞增殖,ERα36-siRNA则抑制E2的诱导效果.结论 ERα36通过ERK/AKT途径介导雌激素促进PTC细胞增殖.     

蛇床子素对小鼠胚胎长骨雌激素受体α、β蛋白表达的影响

【目的】研究蛇床子素对小鼠胚胎长骨雌激素受体α（estrogen receptorα,ERα）和骨雌激素受体β（estrogen receptorβ,ERβ）蛋白表达的影响,探讨其作用于骨组织的调控机制。【方法】取16 d胎龄雌性小鼠前肢尺骨,置BGJb培养基中孵育,经不同浓度蛇床子素（1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7mol/L）和雌酚酮（1×10^-6mol/L）作用48 h后,采用免疫组织化学染色方法观察ERα、ERβ在小鼠尺骨骺板静止区、增殖区和肥大区中的定位和表达情况,并通过图像分析系统测定骺板各区免疫反应阳性细胞数和阳性细胞面积。【结果】与对照组相比较,各浓度蛇床子素和雌酚酮组均能显著上调软骨骺板静止区、增殖区和肥大区ERα、ERβ蛋白的表达水平（P〈0.01）。在1×10^-7-1×10^-5mol/L区间内,随着蛇床子素浓度的升高,各区ERα、ERβ蛋白的表达水平显著升高（P〈0.01）。除1×10^-5mol/L组外,其它各浓度蛇床子素对ERα、ERβ蛋白的调控作用明显弱于雌酚酮组（P〈0.05）,1×10^-5mol/L蛇床子素组作用与雌酚酮组无统计学差异。【结论】蛇床子素对骨组织的作用可能与其上调长骨骺板中ERα及ERβ表达有关。     

流体剪切应力和雷洛昔芬对成骨细胞增殖的影响及作用机制研究

目的 研究流体剪切应力与选择性雌激素受体调节剂--雷洛昔芬单独作用及联合作用对体外培养的小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖的影响及其作用机制。方法 选择12 dyn/cm2（1 dyn=10^-5N)流体剪切应力与10^-7 mol/L雷洛昔芬单独作用和联合作用于体外培养的MC3T3-E1细胞,同时设置阴性对照组（雌激素拮抗剂）和空白对照组,倒置显微镜下观察细胞的外形、大小、细胞核的形态等,并进行活细胞计数,分别采用RT-PCR和Western bolt方法检测细胞中β-catenin、 雌激素受体α（ERα）的mRNA和蛋白的表达。结果 相对于空白对照和阴性对照组,流体剪切应力组、雷洛昔芬组与雷洛昔芬+流体剪切应力组的细胞数量均增加,ERα mRNA和蛋白表达增加（P<0.05）,而β-catenin mRNA和蛋白表达,除雷洛昔芬组的β-catenin mRNA表达差异无统计学意义 (P>0.05)外,其余表达均增加（P<0.05）。雷洛昔芬组与流体剪切应力单独作用组的细胞数、β-catenin 蛋白、ERα mRNA及蛋白表达水平之间差异无统计学意义（P>0.05),但雷洛昔芬+流体剪切应力联合作用组所有检测参数均高于前述两组（P<0.05）。结论 流体剪切应力和雷洛昔芬均有促MC3T3-E1细胞增殖的作用,能上调β-catenin、ERα的表达,且两者联合作用后有协同效应。流体剪切应力和雷洛昔芬可能通过调节Wnt/β-catenin和ER信号通路来影响成骨细胞的增殖。     

乳腺癌雌激素受体阳性细胞对雌激素受体阴性细胞增殖的影响

目的探讨雌激素受体(ER)表达不同的乳腺癌细胞间相互作用。方法 PCR法检测MDA-MB-231及MCF-7细胞中ER的基因表达。CCK-8法检测17β-雌二醇对MCF-7和MDA-MB-231细胞生长增殖的影响。将MDA-MB-231(雌激素受体阴性细胞)用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)法标记荧光信号,将其分别与MCF-7细胞(雌激素受体阳性细胞)和未标记荧光的MDA-MB-231细胞(雌激素受体阴性细胞)用Transwell侵袭小室分层共培养,加入或不加入雌二醇,检测MDA-MB-231细胞的增殖差异。结果 MCF-7细胞表达雌激素受体α(ESR1,ERα)和雌激素受体β(ESR2,ERβ),而MDA-MB-231细胞均不表达。17β-雌二醇浓度为10-11 mol/L时促MCF-7增殖作用最大,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),对MDA-MB-231细胞则无明显作用(P>0.05)。在加入雌二醇培养的MCF-7细胞与MDA-MB-231细胞小室分层共培养组,经流式细胞仪检测发现MDA-MB-231平均荧光强度较对照组显著降低。结论雌激素受体阳性细胞在雌激素作用下,可促进雌激素受体阴性细胞的增殖。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

人子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离纯化和体外培养

目的：建立人子宫正常内膜、内膜异位症在位及异位子宫内膜的基质及腺上皮细胞分离、培养的方法，为进一步研究子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：15例正常子宫内膜、15例在位子宫内膜及10例异位内膜经胶原酶消化、筛网过滤、差时贴壁等技术进行分离、纯化和体外培养，光镜观察，应用鼠抗人波形蛋白抗体、鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜标本分离、培养均成功；5例异位内膜标本获得成功．基质细胞和腺上皮细胞纯度均可达95％以上，并均可传代。结论：采用酶解、筛网分离及贴壁能获得纯度较高的基质与腺上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于研究子宫内膜异位症的发病机制．为临床实验提供重要的理论依据．     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

结核菌素对肝癌和肺癌肿瘤细胞生长和凋亡的调控作用

目的探讨结核菌素对肝癌和肺癌肿瘤细胞生长和凋亡的调控作用。方法制备不同浓度的结核菌上清液(TB-SN),分别与肿瘤细胞株HePG2(肝癌)和A549(肺癌)进行反应。应用特异性荧光探针LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity试剂盒检测肿瘤细胞的生长情况,应用Vybrant凋亡试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果与5%TB-SN反应5 d后,HePG2和A549细胞凋亡显著增加;与TB-SN反应后,HePG2和A549细胞生长受到抑制。结论结核菌素可以介导肝癌和肺癌肿瘤细胞的凋亡,并抑制肿瘤细胞的生长。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

小鼠DC、NK细胞体外诱导、增殖及示踪方法

目的研究小鼠自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)体外诱导增殖及其过继免疫后示踪的方法.方法建立C57BL/6小鼠皮下黑素瘤模型,体外诱导、增殖小鼠脾源性NK细胞及骨髓源性DC,进行电镜观察,并在体外以Brdu、DAPI标记,混合两种细胞回输荷瘤小鼠体内,观察肿瘤组织中两种细胞的示踪情况.结果DC、NK细胞在细胞因子诱导下体外成倍扩增,电镜下可见典型的DC、NK细胞.Brdu对细胞的标记率约65%,DAPI对细胞的标记率可达100%.在荧光显微镜下可见肿瘤组织切片中外源性DC、NK细胞的分布.结论Brdu、DAPI均可作为外源性细胞体内示踪的标记方法.     

猪血浆FN的分离及其性质鉴定

本文用明胶和肝素亲和层析柱等方法,从猪血浆中分离得到大量(0.5mg/ml)的纤维粘连蛋白(FN)。此FN在琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一条带,分子量约450000;巯基乙醇还原后呈现分子量约230000的两条带;可以与抗人和抗牛血浆FN抗体发生免疫沉淀反应;并具有强烈促CHO细胞贴壁活性。提示猪血浆是一种分离提取FN的良好资源。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。