乙型肝炎急性感染小鼠模型的建立

目的 通过尾静脉注射感染性小鼠血清的方法 建立一种简单复制乙型肝炎急性感染的小鼠模型.方法 收集通过水压法复制第3天的小鼠血清,使用不同剂量尾静脉注射感染同系小鼠.分别在不同的时间阶段检测血清中的HBsAg和HBeAg,肝组织中的HBcAg和血清中HBV的DNA.结果 注射0.1 ml血清的感染组的检测结果 均高于0.2 ml组.结论 通过注射感染血清可以成功地复制急性小鼠感染模型.该模型复制方法 中,感染的结果 与注射感染血清的剂量无关.     

小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达影响的实验研究

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,并在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达的影响。方法用水动力学方法,向小鼠尾静脉注射1.5倍的HBV真核表达质粒pHBV1.5建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型,明确感染后,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(psiHBV4)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg,HBeAg(MEIA),通过RT-PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组,空载体对照组和无关干扰对照组。结果注射后第6天血清中HBsAg,HBeAg在pHBV1.5感染组中高表达。psiHBV4干扰组中HBeAg的表达受到了明显的抑制,与感染组比较差异有显著性(P<0.01),RT-PCR显示肝内HBVCmRNA水平亦明显降低。而无关干扰对照组则无相应的干扰作用。结论RNAi能特异,高效的抑制小鼠体内HBV的复制和表达,同时通过水动力学方法,成功建立了小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,为进一步研究乙型肝炎病毒奠定了基础。     

Stealth siRNA对HBV复制和表达的抑制

目的设计siRNA并检测其对HBV的抑制作用。方法针对HBV基因组设计siRNA基因序列，化学修饰合成3种Stealth siRNA，转染带有HBV的2．2．15细胞，ELISA法检测其对HBV复制和表达的影响。结果3种Stealth siRNA对HBV的复制和表达在不同时间有不同程度的抑制作用。72h后就可检测出抑制，其中siRNA508效果最显著。结论合成的Stealth siRNA可以抑制HBV的复制和表达，有望成为控制HBV感染的一种手段。     

应用RNA干扰治疗小鼠急性乙型肝炎病毒感染

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对HBV复制和表达的影响。方法通过尾静脉注射1.3倍的HBV真核表达质粒pHBV1.3建立小鼠急性乙型肝炎感染模型,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(pSI C)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg(ELISA),做肝组织HBcAg免疫组化,通过RT PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组、无关干扰组与突变干扰组。结果转染后第6天血清HBSAg在pHBV1.3感染组中高表达(A值为4.08～9.04,平均值为5.07±1.07,A值≥2.1为阳性),肝内HBcAg阳性率为5%～10%;pSI C干扰组HBSAg,HBcAg的表达均受到抑制,血清HBsAg阴性,A值为0.04～1.5,平均值为0.62±0.59,与感染组相比有显著性差异(P<0.01),肝内HBcAg几乎无表达,RT PCR示肝内HBVCmRNA水平明显降低。而无关干扰pGFP及突变的干扰序列pSI Cmut则无此作用。结论RNAi技术能特异,高效地抑制小鼠体内HBV的复制和表达,提示siRNA作为一种新型抗病毒药物的巨大潜能,而通过水动力法建立的小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,一定程度上解决了长期以来缺乏合适的HBV感染动物模型的问题,为今后进行药物筛选及抗病毒治疗的研究拓展了新的思路。     

S区和C区小干扰RNA在小鼠体内抗乙型肝炎病毒的作用

目的:以乙型肝炎病毒(HBV)S区和C区为靶位,观察小干扰RNA(siRNA)在小鼠体内抗HBV的作用.方法:以流体动力学法建立HBV感染的动物模型,将pcDNA3.1-HBV和细胞体外实验证明有效的S区和C区siRNA尾静脉注射BALB/c小鼠,用时间分辨免疫荧光分析法(IFMA)检测小鼠血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg),用定量PCR法(FQ-PCR)检测血清HBV DNA,用RT-PCR法检测HBV S-mRNA和C-mRNA. 结果:在小鼠体内,和无关siRNA相比,S区和C区siRNA均能有效抑制血清中HBsAg的分泌(第1天的抑制率分别为96%和90%),降低HBV DNA的滴度(第1天分别减少47%和71%),HBV S-mRNA和C-mRNA的条带灰度明显减少,干扰效果至少持续3 d. 结论:在小鼠体内靶向HBV S区和C区的siRNA均能有效特异抑制HBV.     

肝细胞核因子3β调控小鼠体内HBV转录和复制的实验研究

目的 应用复制型HBV小鼠模型观察肝细胞核因子3β(HNF3β)对小鼠体内HBV转录和复制的调控作用.方法 通过尾静脉高压注射法将复制型HBV重组质粒pHBV4.1和大鼠HNF3β表达质粒pCMVHNF3β导入小鼠体内,用Northern吸印杂交检测小鼠肝组织中HBV 3.5kb、2.4/2.1kb、0.7kb mRNA的转录情况,Southern吸印杂交检测HBV DNA复制中间体水平.结果 经小鼠尾静脉高压注射法体内转染质粒pHBV4.1后,小鼠肝组织中检测到HBV 3.5kb、2.4/2.1kbmRNA转录信号和HBV DNA复制中间体信号;与共转染pHBV4.1和空载质粒pCMVpA对照组相比,共转染pHBV4.1和pCMVHNF3β使HNF3β过量表达,明显降低了小鼠体内HBV RNA转录和DNA复制水平.结论 肝富集转录因子HNF3β对小鼠体内HBV转录和复制具有抑制作用,有可能成为今后抗HBV生物治疗新的靶点.     

乙肝病毒X蛋白增强小鼠体内HBV的转录及复制

目的 观察小鼠体内乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)对HBV基因转录和复制水平的影响.方法 应用高压射体内转染法将野生型HBV重组质粒、HBx表达缺失的HBV重组质粒及HBx表达质粒DNA通过尾静脉快速注射入小鼠体内,应用Southern和Northem印迹分别检测小鼠肝组织中HBV DNA复制中间体及HBV mRNA水平.结果 野生型HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组小鼠肝组织中均检测到HBV的复制与转录;HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组HBV基因转录和复制水平较野生型HBV重组质粒注射组、HBx表达缺失HBV重组质粒与HBx表达质粒共注注射组弱,生理盐水注射组未检测到HBV的转录与复制.结论 HBx的表达缺失可导致体内HBV基因转录和复制水平的下降,而外源HBx的表达可逆转这种因HBx表达缺失引起的HBV复制及转录的减弱,提示HBx增强小鼠体内HBV基因转录和复制.     

反义X区RNA和反义P区RNA小鼠体内抗HBV的比较

目的:探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)X区反义RNA和P区反义RNA对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法:构建表达HBV X区反义RNA和P区反义RNA的重组载体质粒,与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用荧光聚合酶链反应定量法检测血清HBV DNA含量,用Nested-PCR法检测血清HBV DNA转阴率.结果:PLXSN-asX小鼠血清HBV DNA的复制于给药后2 d被抑制,至给药后8周抑制依然存在;PLXSN-asP小鼠血清HBV DNA的复制于给药后4 wk被抑制,至给药后8周抑制处于上升趋势. 与给药前相比,小鼠血清HBV DNA的复制,在PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别于2和8 wk达到抑制高峰,抑制率均为58%; 8周后小鼠血清HBV DNA转阴率PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别为25.0%(2/8), 12.5%(1/8).结论:HBV X区反义RNA与HBV P区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠抗HBV作用效率无显著差异,但X区反义RNA的起效时间明显早于P区反义RNA.     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

慢病毒载体携带siRNAs对乙型肝炎病毒抑制作用的体内研究

目的:建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染动物模型,在此基础上观察慢病毒载体携带小干扰RNA (small interferingRNAs,siRNAs)对乙型肝炎病毒(HBV)复制和表达的影响.方法:36只Balb/c小鼠随机等分为3组(n=12):①空白对照组(NC组):通过尾静脉注射pTHBV2(包含HBV全基因组真核表达质粒).建立小鼠急性HBV感染模型;②干扰组(E组):将pTHBV2与pWPT-HBV-siRNA1(携带靶向HBV S区的siRNA1的慢病毒)通过尾静脉共注射小鼠;③无关干扰组(I组):pTHBV2和pWPT-HBV-siRNA2(携带非靶向HBV的无关siRNA2的慢病毒)通过尾静脉共注射小鼠.于注射后第4大和第7天取小鼠血清和肝脏组织.采用ELISA法检测血清中HBsAg(HBV表面抗原);选择逆转录聚合酶链反应方法(RT-PCR)检测肝组织HBVS-mRNA水平;用免疫组织化学法检测肝组织HBcAg(HBV核心抗原)和HBsAg.结果:与NC组比较,E组小鼠血清中HBsAg水平在第4和第7天分别下降89.76%和94.81%(P<0.01);RT-PCR结果提示E组肝组织HBV S-mRNA水平明显降低(P<0.05);免疫组织化学法检测结果显示示E组肝组织HBcAg、HBsAg阳性细胞数明显减少(P<0.05).I组与NC组比较,上述检测指标无统计学差异(P>0.05).结论:慢病毒载体携带siRNAs能够显著抑制小鼠体内HBV的复制和表达,并儿抑制作用在第7天较第4天更强.没有减弱的趋势.     

PCR-微流芯片法检测HBV感染者外周血HBV cccDNA和HBV DNA

目的：探讨HBV感染的肝病患者血中HBV cccDNA、HBV DNA的临床意义。方法：采用PCR-微流芯片法检测105例HBV感染者血清HBV DNA、HBVccc DNA、白细胞中HBV cccDNA（3例进行肝组织HBV cc-cDNA检测）,以6例非乙型肝炎患者作为对照。结果：6例非乙型肝炎患者HBVM、HBV DNA、HBV cccDNA均阴性;HBV感染者中41.9%（44/105）白细胞HBVccc DNA阳性,其中2例阳性PCR产物经基因测序得到验证;HBVDNA≥105copy/ml中HBV cccDNA阳性率57.4%（35/61）显著高于HBV DNA〈105copy/ml者20.5%（9/44,P〈0.01）;18.9%HB VDNA〈103copy/mlHBV感染者HBV cccDNA阳性;抗病毒治疗的慢性肝病患者HBV cccDNA阳性率显著低于未抗病毒治疗者（5/25 VS 34/65,P〈0.01）。结论：HBV感染的患者外周血中存在HBV cccDNA;HBV DNA高浓度者HBV cccDNA检出率高;外周血白细胞HBV cccDNA、血清HBVDNA联合检测更能准确判断抗病毒治疗效果及提高HBV复制检出率。     

实时荧光定量PCR检测HBV DNA与ELISA检测HBV M结果的关系

目的:探讨实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测HBV DNA与ELISA检测HBV M结果的关系.方法:采用实时FQ-PCR和ELISA方法分别对240例乙肝患者进行HBV DNA定量测定和HBV M检测.结果:240例HBsAg阳性血清中HBV DNA阳性率为74.58%.HbsAg、HbeAg、HBcAb和HbsAg、HbeAg阳性组的HBVDNA含量及HBV DNA阳性率均明显高于HbsAg、HbeAb、HBcAb和HbsAg、HBcAb组(P＜0.05,P＜0.01).122例HBeAg阳性的血清中97.54%的HBV DNA阳性;118例HBBeAg阴性的血清中有50.85%HBV DNA阳性.结论:实时FQ-PCR检测HBV DNA准确灵敏,是HBV感染及复制的直接证据.HBV M和HBV DNA的检测各有其独特的临床检测意义,在乙型肝炎的诊断治疗中均具有重要的临床价值.     

慢性乙型肝炎肝组织中HBVcccDNA、HBVDNA和血清中HBVDNA的关系

目的 探讨慢性乙型肝炎肝组织中HBV cccDNA、HBV DNA和血清中HBV DNA的关系。方法 采用实时定量PCR技术检测慢性乙型肝炎肝组织中HBV cccDNA、HBV DNA和血清中HBV DNA含量,同时采用MEIA法检测HBVM指标。结果 60例慢性乙肝患者肝组织中53%检测到HBVcccDNA,平均值为5.98×103拷贝/mg,肝组织HBV-DNA定量平均值为3.66×104拷贝/mg;血清HBV-DNA定量为7.12×104拷贝/mL。肝组织HBVcccDNA定量与肝组织HBV-DNA定量呈高度相关性（P<0.01）;肝组织HBVcccDNA定量与血清HBV-DNA定量也正相关（P<0.05）。结论 由于肝组织HBVcccDNA定量与肝组织HBV-DNA定量呈高度相关性,因此可以在一定程度上可代替检测肝组织中HBVcccDNA来判断病毒复制情况。     

乙型肝炎病毒DNA定量分析的临床意义

目的:探讨乙型肝炎病毒HBV DNA含量与血清标记物的相关性及其对乙型肝炎诊断、预后的意义。方法:采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测1652例乙肝患者血清学标记物(HBV—M),其血清学模型包括以下9种组合;并选取160例HBV M全阴性正常人作为对照。实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测血清中HBV DNA含量。结果:1、2组HBV DNA阳性率为98.4%和96.67%,明显高于其它组。结论:HBV DNA含量与乙肝病毒e抗原具有显著相关性,HBV M和HBV DNA定量检测对于临床乙肝病毒感染、复制及临床治疗有重要意义。     

乙肝DNA聚合酶在187例乙型肝炎病毒感染的各类肝病中的检测

采用免疫沉淀法对187例乙肝病毒感染患者作了DNA聚合酶(DNA--P)的测定。在各类肝炎中DNA—P的阳性检出率以慢活肝最高为66.6％,依次为急性肝炎45％,携带者33.5％,慢迁肝31.5％。本文分析了乙肝的抗原抗体系统与DNA—P检出率的关系。经统计学处理,DNA—P检出率与HBsAg滴度增高呈正相关γs=0.99,P<0.01。HBeAg阳性组DNA—P检出率为62.4％,抗—HBe阳性组DNA—P检出率为29.5％,抗—HBs阳性8例、DNA—P均为阴性。抗—HBc—IgM强阳性组DNA—P检出率为86.4％。作者认为1/3无症状携带者DNA—P活力增高表明病毒在复制,因此携带者在流行病学上的意义不可忽视。又鉴于18例抗—HBe阳性血清DNA—P活力增高,因此在判断HBeAg~-/抗—HBe~+患者病毒复制情况时,应予慎重。     

利用纳米和RNA干扰技术抑制HBV-DNA 在HepG2 2.2.15细胞中的复制和表达

目的：通过RNA干扰和纳米技术抑制HBV-DNA在体外的复制和HBV核心抗原的表达。方法：制备靶向HBV核心抗原（HBcAg）的纳米小干扰RNA（siRNA）,利用U6启动子质粒转染入HepG2 2.2.15细胞;RT-PCR和Western印迹检测转染细胞HBV核心抗原在mRNA和蛋白水平的表达情况;real-time PCR 检测上清液HBV-DNA,放射免疫法检测细胞HBV表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）、核心抗原（HBcAg）。结果：成功构建了含磁性纳米的siRNA质粒;多种方法检测均显示转染后的细胞HBV核心抗原表达明显下降;其表面抗原、e抗原和HBV-DNA值均较对照组降低。结论：RNA干扰联合纳米技术可明显下调HBV核心抗原的表达,抑制HBV-DNA复制。     

HBV亚基因型B和C体外重组中间体的检测

目的:检测HBV亚基因型B和C的体外重组中间体.方法:将基因型B和C序列插入载体Plenti6/V5-D-topo-X后,共转染HepG2细胞,克隆,测定转染后HBV的核酸序列,而后用软件包RDP3Beta40进行序列比对.结果:发现存在3种重组中间体,重组中间体的重组位置为1740-1838至2443-2485.R1...     

乙型肝炎病毒X基因研究现状

乙肝病毒（HBV）X基因编码的X蛋白（HBX）在HBV的致病性中,起着重要的作用。HBX激活信号通路,直接与转录因子作用或促进转录因子与转录元件的特异结合,调控HBV的转录。HBX作为一种反式激活因子,通过反式激活作用影响信号转导,抑制细胞DNA修复,影响细胞凋亡等导致肝细胞癌（HCC）发生。     

78例HBV患者血清标志物不常见模式与HBV DNA的对比分析

目的 探讨乙型肝炎病毒感染的不常见模式与HBV DNA拷贝数之间的关系.方法 日常ELISA法检测获得HBV标志物特殊结果的样本,经发光免疫确认结果完全一致的78例样本,以荧光定量检测(FQ-PCR)技术测定其HBV DNA,并对结果进行统计学分析.结果 在78例不常见模式里,20例13阳性的HBV DNA检出率为100%,平均载量为7.546×107;7例123阳性HBV DNA的检出率为100%,平均载量为6.322×105;15例1235阳性HBV DNA的检出率为86.7%,平均载量为6.905×105;13例1245阳性标本中HBV DNA检出率为69.2%,平均载量为1.299×104;14例125阳性的HBV DNA的检出率为57.1%,平均载量为2.292×104在少见乙肝阳性模式中,以HBeAg阳性的HBV DNA载量最高,而即使是有抗体产生的标本,仍然有复制水平中等的HBV DNA阳性标本,所以建议临床医生应根据HBV DNA结果作出客观的临床解释.     

HBsAg阳性与阴性活产儿产妇分娩方式的比较性研究

目的 探讨HBsAg阳性与阴性活产儿产妇分娩方式的差异.方法 随机抽取活产儿产妇病例2419份,按HBsAg阳性与阴性及分娩方式等进行分析.结果 HBsAg阳性活产儿产妇剖宫产率为40.97%(118/288),HBsAg阴性活产儿产妇剖宫产率为40.64%(866/2131),差异无显著性.HBsAg阳性经阴道分娩的活产儿产妇不用人工助产的自产率为98.24%(167/170),HbsAg阴性经阴道分娩的活产儿产妇不用人工助产的自产率为98.57%(1247/1265),差异无显著性.结论 HBsAg阳性与阴性活产儿产妇的剖宫产率、不用人工助产的自产率差异尤统计学意义,说明医生与产妇未把剖宫产作为阻断HBV母婴传播的方法.