探讨不同浓度 SPIO 对人成纤维细胞标记率和细胞活力影响及其MRI的实验研究

目的:探讨不同浓度超顺磁性氧化铁纳米粒子( Super-paramagnetic iron oxide,SPIO)体外标记人成纤维细胞 (Human fibroblast cells,Hfbs) 的磁性标记率、对细胞生长活力的影响,以及体外磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI) 成像的特征.方法:将单纯 SPIO(铁浓度为 200 μg/ml )、不同浓度的SPIO-多聚赖氨酸复合物分别与培养基混合( 铁的终浓度分别为 150、100、50、25 μg/ml,PLL 终浓度为 7.5 μg/ml ),加入 Hfbs 共同培养 12、24、48、72 h 后收集细胞.采用台盼蓝排除试验检测细胞活性和普鲁士蓝染色法检测细胞铁分布.运用光学显微镜、透射电镜观察铁颗粒在细胞内的位置、计算其标记率;MR 扫描观察细胞信号强度变化情况.结果:SPIO-多聚赖氨酸复合物组细胞标记率显著高于单纯 SPIO 标记组 (P<0.05 ), 台盼蓝排除试验显示,100 μg Fe/ml 及其以下浓度组细胞活力与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05 ).普鲁士蓝染色显示每个标记细胞胞质内可见多少不等的蓝染铁颗粒,电镜显示铁颗粒集中于内涵体和溶酶体中;含量在 25～50 μg Fe/ml 的培养液是 SPIO 标记干细胞的安全浓度,在此浓度阈值标记后孵育 18～24 h 即可有效标记细胞 95%～100% ;MR扫描显示标记细胞信号强度明显降低.结论:自制合成的 SPIO-多聚赖氨酸复合物可以简便、安全的标记人成纤维细胞.并且在适当浓度 25 μg Fe/ml 标记细胞不仅标记效率高,而且对细胞活力无明显影响,SPIO 标记细胞明显降低MR扫描下的细胞信号强度.     

Ferumoxides标记神经干细胞及其对增殖分化的影响

目的:研究超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxides.SPIOs)标记神经干细胞及其生物学特性.方法:神经干细胞培养、传代和诱导分化;菲立磁(Ferumoxides,一种SPIOs)标记神经干细胞,制备磁标记神经干细胞;利用免疫细胞化学、透射电镜和Prussian blue染色等方法对磁标记神经干细胞的生长、分化等生物学特性进行研究.结果:在原代及传代细胞中有Nestin阳性细胞即神经干细胞.血清诱导下,神经干细胞可分化为GFAP、MAP-2、NSE、Tau蛋白及NF200阳性细胞.Ferumoxides与神经干细胞共同孵育后,透射电镜及Prussian blue染色显示胞浆中含有铁颗粒,SPIOs也可以随细胞的分裂增殖而传到子代细胞中.随Ferumoxides浓度的增高(2.8μg/ml～16.8μg/ml),Ferumoxides对神经干细胞存活、分化能力的影响无显著性差异(P＞0.05).当Ferumoxides的浓度大于22.4μg/ml时,SPIOs影响其存活和分化(P＜0.05).结论:本实验在国内首次利用Ferumoxides作为磁标记探针,对神经干细胞进行成功磁标记.为进一步利用核磁共振(MRI)对神经干细胞活体追踪奠定实验基础.     

大鼠骨髓源神经干细胞的Sinerem体外标记及磁共振成像研究

目的 应用超小超顺磁性氧化铁(USPIO)Sinerem和转染试剂多聚赖氨酸(PLL)复合物标记大鼠骨髓源神经干细胞,初步评价磁共振成像活体示踪Sinerem标记干细胞的可行性.方法 分离SD大鼠骨髓基质干细胞,体外培养诱导成骨髓源神经干细胞.将制备的Sinerem-PLL复合物以浓度Sinerem 200μg/ml和干细胞共孵育培养过夜.采用普鲁士蓝染色和透射电镜确定细胞内铁的摄取、定位情况;并对细胞增殖、凋亡检测评价.体内外以SE序列T2WI与T2*WI行4.7T磁共振干细胞成像.结果 该方法标记干细胞效率为95%以上,普鲁士蓝染色显示铁颗粒存在胞质中,电镜显示铁颗粒集中于内涵体和溶酶体中;该浓度时Sinerem对细胞的活性影响与未标记细胞相比差异无统计学意义(P＞0.05).标记后细胞体内外的T2WI与T2*WI信号强度明显降低.结论 利用Sinerem对比剂经PLL介导标记骨髓源神经干细胞高效易行,磁共振可用于活体示踪神经干细胞.     

超顺磁性氧化铁颗粒标记对大鼠骨髓间充质干细胞活力的影响

目的:探讨利用超顺磁性氧化铁颗粒(SHU555A)体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对细胞活力的影响.方法:分别使用不同铁浓度(35、70、140和210 mg/L)的SHU555A标记大鼠BMSCs,分别于标记后1 d及1、2、3周行普鲁士蓝染色观察铁纳米颗粒进入细胞情况,台盼蓝排除试验检测细胞活力.结果:普鲁士蓝染色显示标记的大鼠BMSCs胞质内存在细小蓝色铁颗粒,标记率100%;台盼蓝染色显示标记时间对BMSCs活力无影响.铁浓度为35 mg/L时对标记的细胞活力无影响,大于该浓度则细胞活力下降.结论:35 ms/L的铁纳米颗粒可用于大鼠BMSOs标记.     

绿色荧光蛋白转基因胎鼠神经干细胞的超顺磁性氧化铁标记

目的探讨超顺磁性氧化铁（SPIO）标记对绿色荧光蛋白（GFP）转基因胎鼠神经干细胞（NSCs）的标记效果及标记后对其生物学特性的影响.方法采用多聚赖氨酸（PLL）介导SPIO的方法标记NSCs,用普鲁士蓝染色观察标记后NSCs内铁,比较标记和未标记NSCs的GFP表达、活力、增殖、凋亡及多向分化能力.结果普鲁士蓝染色示标记NSCS胞质内见大量蓝色颗粒,细胞的活力、增殖、凋亡及多向分化能力检测均显示两组细胞间无明显差别.结论用PLL介导SPIO标记NSCs是一种可行、安全、有效的细胞内标记方法.     

SPIO标记兔BMSCs的生物学特性与体外MRI显像研究

目的采用超顺磁性氧化铁（SPIO）作为磁探针标记兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）,探讨不同浓度SPIO的磁标记效率及其对细胞活力的影响观察标记干细胞体外MR显像情况。方法采用含铁不同浓度（11.2μg/ml、22.4μg/ml、44.8μg/ml）的SPIO标记兔BMSCs,分别行普鲁士蓝染色和MTT比色法检测其标记效率和BMSCs增殖活性,同时观察不同浓度磁标记细胞组（1×106、1×105、1×104和1×103细胞数/ml）和对照组（1×106细胞数/ml）的T1WI、T2WI及T2·WI体外显像信号。结果 SPIO标记BMSCs中铁含量越高,其标记率越高,含铁浓度为22.4μg/ml时磁标记率达95%且对BMSCs生长活性无明显影响。三种MR序列信号变化随细胞浓度的增加,其信号变化越明显,但在相同细胞浓度下,T2·WI信号变化率最大（P〈0.05）。结论采用含铁浓度为22.4μg/ml的SPIO来标记BMSCs,其磁标记率和安全性均很高。T2·WI是体外示踪磁标记BMSCs最佳的MR成像序列。     

应用超顺磁性氧化铁纳米粒子标记神经干细胞及活体磁共振示踪的实验研究

目的 探索超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)标记神经干细胞体的方法及其检测手段,研究标记细胞移植后在活体上磁共振信号的改变。方法 分离培养新生鼠皮层神经干细胞,使用SPIO和多聚赖氨酸联合标记神经干细胞;将标记后的神经干细胞移植入Wistar大鼠脑内,应用不同的扫描序列对脑内移植的神经干细胞进行示踪。结果 体外标记的神经干细胞普鲁士蓝染色见细胞浆内有许多蓝染的铁颗粒,电镜检查表明SPIO颗粒存在于标记细胞的吞饮小泡及细胞基质内,标记后的细胞可正常分化。脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变,以GREE序列信号改变最为明显。结论 超顺磁性氧化铁粒子可以用来标记神经干细胞,且对细胞增殖、分化无影响,SPIO颗粒存在于标记细胞的吞饮小泡及细胞基质内。标记后体内移植的神经干细胞可以在MR上产生明显的低信号改变。     

超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的探讨应用超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxid,SPIO）标记间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）的有效性、安全性及可靠性。方法分离、培养SD大鼠MSCs,通过流式细胞仪分析鉴定表面抗原CD34、CD44。选取第4代MSCs,在铁（Fe）浓度为25、50、75μg.ml-1和多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine,PLL,0.75μg.ml-1）的DMEM/F12培养液中,孵育48h,作为3个实验组。通过普鲁士蓝染色、流式细胞仪检测、台盼蓝染色及MTT细胞增殖活性检测SPIO,探讨不同SPIO浓度对MSCs标记效率、免疫学表型、细胞活性及增殖的影响。结果经Fe浓度为25、50、75μg.ml-1SPIO标记后,普鲁士蓝染色标记效率均在99%以上;3个实验组细胞表面均表达CD44,阳性细胞率为超过98%。与对照组相比,Fe浓度为25、50μg.ml-1的SPIO标记的MSCs活细胞比率均在96%左右,细胞增殖活性差异无统计学意义,而Fe浓度为75μg.ml-1时,活细胞比率约为93%,对细胞的增殖有明显的抑制作用（P〈0.05）。培养4周,细胞内检测不到SPIO。结论全骨髓直接贴壁法可以成功分离、培养MSCs。超顺磁性氧化铁在PLL介导下,能高效地标记MSC,且在合适的浓度范围不会影响MSCs的免疫学表型、细胞活性及增殖能力等生物学特性。细胞内的SPIO,大约在4周左右,即可被完全降解。     

乳腺癌特异性磁共振分子探针的制备及体外实验

目的:制备针对乳腺癌细胞表面生长激素抑制素受体(somatostatin receptor,SSTR)的特异性磁共振分子探针,探讨其理化性质及体外成像特征.方法:采用化学偶联法,将超顺磁性氧化铁颗粒(superparamagnetic iron oxide,SPIO)与生长激素抑制素类似物奥曲肽(octreotide,OCT)偶联,制备特异性磁共振分子探针SPIO-OCT.用MTT法分析不同浓度探针对标记细胞生长增殖的影响,普鲁士蓝染色评价其细胞磁性标记情况,并对不同浓度的探针、不同数目的标记细胞行体外磁共振成像.细胞磁性标记对照组采用超顺磁性氧化铁颗粒(Resovist).结果:细胞被分子探针磁性标记后,胞质内可见蓝染颗粒,且探针标记浓度越高,胞质内蓝染颗粒越多;分子探针细胞阳性标记率达96.15%,高于对照组(80.00%);MTT结果显示,不同浓度的探针对细胞增殖影响差异无统计学意义(P＞0.05);探针在Fe2+浓度为20 mg/L时,T2WI呈明显低信号、无磁敏感伪影,此浓度标记的细胞数量越多,T2WI信号降低越明显,6×106个磁标记细胞T2WI上呈显著低信号.结论:磁共振分子探针SPIO-OCT可安全、高效标记SSTR表达阳性的乳腺癌细胞,其理想标记和成像浓度为Fe2+20 mg/L,体外核磁信号强度可在一定程度上反应磁标记细胞的数量.     

超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞方法研究

目的:使用超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)对成肌细胞进行体外标记,探讨SPIO标记方法及SPIO对细胞的影响.方法: 常规方法进行成肌细胞培养,应用脂质体包被的SPIO标记成肌细胞,用光镜及电镜观察标记效率及对细胞增殖的影响,台盼蓝染色及JC-1观测SPIO对细胞活力的影响.结果: 普鲁士蓝染色证实了每个标记细胞胞质内有多少不等的蓝染铁颗粒,单纯SPIO标记有效率为50%,脂质体包被的SPIO标记有效率为100%,电镜也观测到细胞内的SPIO颗粒.SPIO标记对细胞无毒性,不影响细胞的增殖及活性.结论: 脂质体包被SPIO标记成肌细胞方法简单、高效、无毒,可用于磁共振对标记细胞进行活体内外无创动态示踪研究.     

磁标记大鼠神经干细胞移植入脑缺血大鼠的磁共振示踪

[目的]使用菲立磁（Feridex）体外标记胎鼠神经干细胞（neural stem cells,NSCs）,并在移植脑缺血大鼠后进行活体MRI示踪观察。[方法]分离、培养大鼠胚胎源性神经干细胞,使用“Feridex-多聚赖氨酸复合物（FE-PLL）” ,标记神经干细胞,对标记细胞分别进行普鲁士蓝染色、电镜观察,将FE-PLL标记神经干细胞分别移植人脑缺血大鼠左右侧脑室内,活体移植后1、5、14d体内MRI示踪。[结果]菲立磁可以高效率地标记神经干细胞,普鲁士蓝染色显示FE-PLL标记神经干细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。电镜结果显示FE-PLL标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。MRI检查发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变。[结论]菲立磁可以用来体外标记神经干细胞,利用MRI技术可以对脑内移植后的标记细胞进行初步的活体追踪。     

大鼠骨髓内皮祖细胞SPIO标记及检测

目的：研究大鼠骨髓内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCS）的分离、培养、SPIO标记,SPIO对EPCS的标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响,为进一步的实验研究奠定基础。方法：SD大鼠体重120～150 g,采用梯度密度离心法和贴壁法获取大鼠EPCS,采用25μg/ml SPIO对其标记,比较标记和未标记的EPCS。普鲁士蓝染色观察铁标记率,台盼蓝检测细胞活力,MTT法检测细胞增殖力,Calcein-AM/PI染色检测细胞活性及细胞膜完整性,AO/PI染色检测细胞凋亡率。结果：分离培养EPCS 7～10 d,细胞集落相互连接,呈典型的铺路石样外观。普鲁士兰染色显示SPIO（25μg/ml,24 h）对细胞的标记率接近94%;比较SPIO标记及未标记的EPCS,细胞活力分别为（94.34±0.25）%和（95.33±0.31）%;MTT法检测两组间相比差异无统计意学义（P〉0.05）;Calcein-AM/PI染色检测细胞的活性和膜完整性,存活率分别为96%和97%;AO/PI染色两组细胞的凋亡率均为5%。结论：采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养。25μg/ml浓度的SPIO细胞标记率高,对细胞毒性小,且不影响EPCS的活力、增殖及凋亡。     

超顺磁性纳米铁标记大鼠骨髓基质干细胞的实验研究

目的研究超顺磁性纳米铁粒子（superparamagnetic iron nanoparticle,SPIO）标记骨髓基质干细胞（bone mar-row stem cells,BMSCs）对其存活、增殖能力的影响,确定最佳标记浓度。方法分离、纯化4周龄SD大鼠的BM-SCs,分别用15、25、50 mg/L浓度的SPIO标记1×106个BMSCs分别作为实验组1、实验组2、实验组3,未做标记的BMSCs为对照组。用普鲁士蓝染色法和透射电镜鉴定SPIO-BMSCs的效率,台蓝染色法观察SPIO-BMSCs的存活,MTT比色法检测SPIO-BMSCs增殖活性。结果普鲁士蓝染色显示,随SPIO浓度的升高,标记的细胞染色程度逐渐加深。透射电镜检查显示细胞内含致密铁颗粒。实验组1的细胞增殖性与对照组差异无统计学意义（P〉0.05）,实验组2和实验组3与对照组相比,死亡细胞增多,细胞增殖性受到明显抑制（P〈0.05）。结论培养基SPIO浓度在15 mg/L时,SPIO对BMSCs标记效率较高,且不影响其存活、增殖。     

外加磁场诱导超顺磁氧化铁标记骨髓间充质干细胞迁移 的体外研究

 【目的】 观察外加磁场能否诱导用超顺磁氧化铁标记的大鼠骨髓间充质干细胞在体外条件下定向迁移。 【方法】 使用超顺磁氧化铁标记大鼠骨髓间充质干细胞,采用普鲁士蓝染色鉴定其标记率。台盼蓝染色检测标记细胞生存能力,MTT法检测标记干细胞的增殖活力。外加磁场进行划痕试验及Transwell试验验证磁场对标记细胞的定向诱导迁移作用。 【结果】 普鲁士蓝染色显示骨髓间充质干细胞的超顺磁氧化铁标记率接近100%,台盼蓝染色标记细胞生存率与对照组无差异(P > 0.05),MTT检测标记干细胞的增殖活力与未标记干细胞无差异(P > 0.05)。外加磁场可加速标记细胞填补划痕试验空白区的速度,同时可增加transwell试验跨膜的细胞数(P < 0.05),而未加磁场情况下标记细胞与未标记细胞迁移速率无差异(P > 0.05)。 【结论】 外加磁场可在体外条件下诱导超顺磁氧化铁标记的骨髓间充质干细胞定向迁移。     

磁共振示踪超小超顺磁性纳米铁颗粒标记大鼠C6脑胶质瘤细胞的效果分析

目的 监测不同浓度超小超顺磁性纳米铁颗粒（USPIO）对不同数量大鼠C6胶质瘤细胞离体及载体标记的效果。方法采用0、25、50μg／ml浓度的USPIO标记1×10^6,2×10^6和1×10^7大鼠C6胶质瘤细胞,离体MRI扫描T1WI,T2WI,GRE／30°序列成像,测定细胞群信号。0、25、50μg／ml^3种浓度USPIO标记1×10^6大鼠C6胶质瘤细胞后,立体定向分别接种于6只大鼠（每种浓度接种2只）的右侧额叶,载体MRI扫描T1,WI,T2WI,GRE／30°序列成像,测定其信号强度。结果不同数量的大鼠C6胶质瘤细胞与0、25、50μg／ml浓度的USPIO培养12h,离体MRI不同序列测定不同浓度USPIO标记相同数量的细胞群,GRE／30。和T2,WI测定的各组之间差异均有统计学意义,50与25μg／ml组与0μg／ml组比较,差异均有统计学意义（t=4．19与3．38,P〈0．05）;同一浓度USPIO标记大鼠C6胶质瘤细胞,信号强度与细胞数量有关（t=5．16,2．35,4．41;P〈0．05）。普鲁士蓝染色镜下观察,发现标记的细胞从25到50μg／ml染色程度逐渐加深。载体25μg/ml浓度的USPIO标记大鼠C6胶质瘤细胞在MRI成像中清楚显示病变的范围及信号强度。结论USPIO可以标记大鼠C6胶质瘤细胞。MRI的信号强度与同一浓度USPIO标记细胞的数量成反比,25μg／ml浓度USPIO标记的肿瘤细胞,活体接种脑内完全可以达到MRI示踪的目的。     

Superparamagnetic Iron Oxide Labeling of Spinal Cord Neural Stem Cells Genetically Modified by Nerve Growth Factor-β

This study established superparamagnetic iron oxide （SPIO）-labeled nerve growth fac-tor-β （NGF-β） gene-modified spinal cord-derived neural stem cells （NSCs）. The El4 rat embryonic spinal cord-derived NSCs were isolated and cultured. The cells of the third passage were transfected with plasmid pcDNA3-hNGFβ by using FuGENE HD transfection reagent. The expression of NGFβ was measured by immunocytochemistry and Western blotting. The positive clones were selected, allowed to proliferate and then labeled with SPIO, which was mediated by FuGENE HD transfection reagent. Prussian blue staining and transmission electron microscopy （TEM） were used to identify the SPIO particles in the cells. The distinctive markers for stem cells （nestin）, neuron （β-Ⅲ-tubulin）, oligodendrocyte （CNPase） and astrocyte （GFAP） were employed to evaluate the differentiation ability of the labeled cells. The immunocytochemistry and western blotting showed that NGF-β was expressed in spinal cord-derived NSCs. Prussian blue staining indicated that numerous blue-stained particles appeared in the cytoplasma of the labeled cells. TEM showed that SPIO particles were found in vacuolar structures of different sizes and the cytoplasma. The immunocytochemistry demonstrated that the labeled cells were nestin-positive. After differentiation, the cells expressed β-Ⅲ-tubulin, CNPase and GFAP. It was concluded that the SPIO-labeled NGF-β gene-modified spinal cord-derived NSC were successfully established, which are multipotent and capable of self-renewal.