miR-125a/TRAF6调控通路在破骨细胞分化中的作用研究

目的研究miR-125a在破骨细胞分化过程中的作用及其作用机制,方法单核细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子-κB配体的受体激活剂(RANKL)诱导CD_(14)⁺PBMCs向破骨细胞分化。生物信息学运算预测miR-125a的靶基因以及结合于miR-125a启动子区域的转录因子。实时定量PCR法检测miR-125a以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制试验用于研究miR-125a在破骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合。结果(1)miR-125a表达在CD_(14)+PBMCs向破骨细胞分化。生物信息学运算预测miR-125a的靶基因以及结合于miR-125a启动子区域的转录因子。实时定量PCR法检测miR-125a以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制试验用于研究miR-125a在破骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合。结果(1)miR-125a表达在CD_(14)⁺PBMCs前体细胞高表达,随着诱导时间的延续逐渐下降,在诱导第5天开始明显下降并在第15天达到最低值,表明miR-125a的表达在破骨细胞分化过程中呈现明显下降趋势。(2)miR-125a参与调控RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化,过表达miR-125a明显抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表达和CD_(14)+PBMCs前体细胞高表达,随着诱导时间的延续逐渐下降,在诱导第5天开始明显下降并在第15天达到最低值,表明miR-125a的表达在破骨细胞分化过程中呈现明显下降趋势。(2)miR-125a参与调控RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化,过表达miR-125a明显抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表达和CD_(14)⁺PBMCs向破骨细胞的分化。(3)miR-125a直接作用于靶基因肿瘤坏死因子相关因子6(TRAF6),TRAF6是RANKL/RANK/NFATc1信号转导通路的转录因子,过表达miR-125a降低了TRAF6的蛋白表达水平,而TRAF6的mRNA水平无明显改变。结论 miR-125a通过作用于新的FRAF6/NFATC1/miR-125a负反馈调控环路在破骨细胞的分化中发挥了重要的调控作用,调控miR-125a的表达可能成为骨代谢疾病新的治疗靶点。     

巨噬细胞集落刺激因子对破骨细胞生物作用的实验研究

目的　探讨在实验条件下巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF)在骨代谢过程中对破骨细胞的生物作用。方法　用不同浓度的M CSF和活化核因子κB的受体配体 (RANKL)与鼠骨髓细胞培养 ,在加入或不加入牛骨片的情况下诱导产生破骨细胞。分别用抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)染色法和骨小坑染色法检测TRAP阳性的破骨细胞量及破骨细胞功能。结果　在一定范围内 ,M CSF在RANKL存在的条件下诱导TRAP阳性破骨细胞成熟 ,并随M CSF剂量的增加TRAP阳性细胞数明显增加 (r =0 .75 0 4,P <0 .0 1) ;且骨小坑数量也与M CSF剂量呈明显正相关 (r=0 .93 65 ,P≤ 0 .0 0 0 1)。缺乏M CSF或RANKL均不能诱导TRAP阳性的破骨细胞产生 (P =0 .0 191)。结论　破骨细胞的增殖、分化及成熟是由M CSF和RANKL共同调节的。M CSF是破骨细胞代谢过程中的关键因子 ,具有促进破骨细胞对骨吸收的作用。M CSF对骨代谢的主要作用之一是上调破骨系统。     

肿瘤坏死因子α对小鼠破骨细胞分化的影响

目的:在诱导破骨细胞分化的体外骨髓细胞培养系统中,研究破骨细胞分化因子(RANKL)存在和不存在的情况下,肿瘤坏死因子α(TNF-α)对破骨细胞分化的影响.方法:选用小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)依赖性非附着性骨髓细胞,在含有25μg/L M-CSF和0,l,10,100μg/L TNF-α的α-MEM培养液中培养5 d后,观察抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)阳性多核细胞的形成;细胞在含有25 μg/L M-CSF和30μg/L sRANKL的α-MEM培养液中进行培养,比较加入和不加人10μg/L TNF-α培养4、5、6和9 d后,所形成的TRAP( )多核细胞的数目和骨吸收面积.结果:TNF-α在没有RANKL的情况下,不能诱导小鼠骨髓细胞形成破骨细胞.在RANKL存在的情况下,TNF-α可促进破骨样细胞的形成和骨吸收,但对破骨细胞分化的促进作用仅表现在培养的早期.结论:在RANKL存在的情况下TNF-α可促进破骨细胞的分化,但不能取代RANKL.TNF-α加速破骨细胞的形成,却并不延长其生存时间.     

OGP(10-14)及其类似物G48A对成骨细胞IGF-1和Cbfα1表达的影响

目的 探讨成骨生长肽羧基端片段[OGP(10-14)](G36G)及其类似物CM8A对大鼠成骨细胞核心结合因子α1(Cbfα1)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)mRNA表达的影响.方法 体外分离SD大鼠成骨细胞,传代培养后取第3代细胞并用于实验.根据不同处理因素,将成骨细胞分为G36G组(培养液含1×10-11mol/L G36G)、G48A组(培养液含1×10-13mol/L G48A)、甲状旁腺激素(PTH)组(培养液含I×10-8moL/L PTH)和对照组(未处理).运用RT-PCR技术分别检测各组成骨细胞Cbfα1、IGF-1mRNA的表达,并进行统计学比较.结果 G36G组、G48A组、PTH组和对照组Cbfα1 mRNA表达分别为1.123±0.081、1.101±0.115、1.104±0.054、0.893±0.067;IGF-1 mRNA表达分别为1.130±0.067、1.213±0.111、1.173±0.180、0.908±0.081.经统计学分析,G36G组、G48A组和PTH组Cbfα1、IGF-1 mRNA表达较对照组显著上升(均P＜0.05),而其三组间比较无显著差异(P＞0.05).结论 OGP(10-14)及其类似物G48A对大鼠成骨细胞Cbfα1和IGF-1 mRNA的表达具有上调作用.     

OGP(10-14)及其类似物G48A对成骨细胞IGF-1和Cbfα1表达的影响

目的探讨成骨生长肽羧基端片段[OGP(10-14)](G36G)及其类似物G48A对大鼠成骨细胞核心结合因子α1(Cbfα1)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)mRNA表达的影响。方法体外分离SD大鼠成骨细胞,传代培养后取第3代细胞并用于实验。根据不同处理因素,将成骨细胞分为G36G组(培养液含1×10-11mol/LG36G)、G48A组(培养液含1×10-13mol/LG48A)、甲状旁腺激素(PTH)组(培养液含1×10-8mol/LPTH)和对照组(未处理)。运用RT-PCR技术分别检测各组成骨细胞Cbfα1、IGF-1mRNA的表达,并进行统计学比较。结果G36G组、G48A组、PTH组和对照组Cbfα1mRNA表达分别为1.123±0.081、1.101±0.115、1.104±0.054、0.893±0.067;IGF-1mRNA表达分别为1.130±0.067、1.213±0.111、1.173±0.180、0.908±0.081。经统计学分析,G36G组、G48A组和PTH组Cbfα1、IGF-1mRNA表达较对照组显著上升(均P<0.05),而其三组间比较无显著差异(P>0.05)。结论OGP(10-14)及其类似物G48A对大鼠成骨细胞Cbfα1和IGF-1mRNA的表达具有上调作用。     

破骨细胞分化中NFATc1/miR-125a作用通路的研究

目的研究破骨细胞分化中miR-125a受转录因子NFATc1的调控模式及其作用机制,寻找骨代谢疾病新的治疗靶点。方法单核细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子-κB配体的受体激活剂(RANKL)诱导CD_(14)~+外周血单核细胞(PBMCs)向破骨细胞分化。生物信息学运算预测结合于miR-125a启动子区域的转录因子,过表达实验和抑制实验用于研究转录因子对miR-125a在破骨细胞分化中表达的影响,荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合,凝胶迁移电泳实验(EMSA)和染色质免疫沉淀实验(CHIP)验证转录因子与miR-125a启动子区域的结合。结果凝胶迁移电泳和染色质免疫沉淀实验证明了NFATc1结合于miR-125a的启动子靶位点。过表达NFATc1抑制miR-125a的表达;抑制NFATc1的表达则升高miR-125a的表达。结论 miR-125a在作用于其靶基因——肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)6的同时受到转录因子NFATc1的负反馈调控,发挥其在破骨细胞分化中的调控作用。表明通过调控NFATc1的表达来改变miR-125a的表达,可能成为骨代谢疾病新的治疗靶点。     

甲状旁腺素对大鼠正畸牙根吸收后修复期破骨细胞的影响

目的探讨皮下间断注射少量甲状旁腺素(PTH)(1-34)对大鼠正畸牙根吸收后修复期破骨细胞的影响。方法 63只雄性6~8周SD大鼠建立正畸牙根吸收动物模型后,随机分为空白对照组、阴性对照组和实验组。空白对照组大鼠不注射任何药物,阴性对照组间断注射6μg/kg生理盐水,实验组皮下间断注射6μg/kg PTH(1-34)(PTH:1μg/mL)。分别在中断加力0、7、10、14、17、21、25d处死大鼠取材,免疫组织化学测定牙根修复期压力侧牙周组织中核因子κB受体活化因子配体(RANKL)表达变化,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察实验区破骨细胞变化。结果中断加力后修复早期仍可见破骨细胞,实验组相对于其他两组破骨细胞数目差异无统计学意义(P>0.05);实验组相对于其他两组破骨细胞分化因子表达早期增强,晚期减弱(P<0.05)。结论皮下间断注射少量PTH(1-34)对牙根修复期仍持续的牙根吸收不会产生抑制作用。     

两种不同细胞培养方法对破骨细胞分化及Notch2基因表达的影响

目的:探讨两种不同培养方法对体外破骨细胞分化的影响,分析破骨细胞分化过程中的关键信号Notch2分子的mRNA和蛋白表达水平的差异,为进一步破骨细胞功能实验奠定基础。方法:单独培养:从4周龄的小鼠腿骨骨髓腔分离骨髓细胞,巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和破骨细胞生成因子(RANKL)诱导大鼠骨髓细胞形成破骨细胞;共培养:从4周龄的小鼠大腿骨骨髓腔分离骨髓细胞,与原代成骨细胞共培养,VitD3和前列腺素E2(PGE2)诱导。对获得的破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色和细胞计数,并测定破骨细胞分化过程中的关键信号Notch2分子的mRNA和蛋白表达水平。结果:两种培养方法获得的破骨细胞均为TRAP染色阳性的多核巨细胞;共培养方法得到的破骨细胞数目为(240±36)个/孔,而单独培养法为(160±23)个/孔。共培养组Notch2分子mRNA表达水平为4.1±1.2,单独培养组为2.4±0.6,共培养组高于单独培养组(P<0.05),共培养组Notch2蛋白表达水平亦高于单独培养组。结论:与通过RANKL和M-CSF诱导破骨细胞分化的培养方法相比,利用成骨细胞和破骨前体共培养可诱导出更多的破骨细胞和高水平的Notch2表达。培养方法影响破骨细胞的数量和Notch2基因的表达水平。     

雌二醇对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响

目的　研究骨髓基质细胞在向成骨细胞分化的介质中 ,17β 雌二醇 (E2 )对其骨形态发生蛋白受体 (BMPR)ⅠA及核结合因子α1(Cbfα1)mRNA表达的影响 ,探讨雌二醇对成骨细胞生成的作用。方法　用 1,2 5 (OH) 2 D3和地塞米松(DEX)诱导大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化 ,应用RT PCR和Northernblot技术 ,观察不同浓度E2对骨髓基质细胞分化过程中BMPR ⅠA及Cbfα1mRNA表达的影响 ,以α 磷酸奈酚为底物测定细胞碱性磷酸酶的活性 ,VanGieson染色法显示Ⅰ型胶原的含量。结果　E2能明显抑制骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中BMPR ⅠA及Cbfα1mRNA的表达 ,且呈剂量依赖性 ,并被Northernblot结果所证实。ALP活性随E2浓度增加而降低 ,细胞Ⅰ型胶原的合成量随E2浓度增加而减少。结论　E2能明显抑制体外培养的骨髓基质细胞分化过程中BMPR ⅠA及Cbfα1mRNA的表达 ,降低成骨细胞生成。     

抗坏血酸抑制核因子κB受体活化子配体诱导RAW264.7细胞的分化和功能

目的研究抗坏血酸对核因子κB受体活化子配体(RANKL)诱导体外培养的破骨前体细胞RAW2647形成成熟多核破骨细胞的影响,探讨抗坏血酸在破骨前体细胞分化中的作用及机制。方法利用不同浓度的抗坏血酸与RANKL单独或共同处理RAW2647细胞,MTT法测定细胞增殖,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法观察TRAP阳性多核细胞,逆转录聚合酶链反应(RTPCR)测定破骨细胞表型基因和功能基因的表达,Western印迹方法检测碳酐酶Ⅱ基因蛋白表达,破骨细胞的骨吸收功能用骨吸收陷窝面积计数法分析。结果抗坏血酸和RANKL都抑制RAW2647细胞的增殖(P<005),但它们之间无协同作用。抗坏血酸本身不能诱导RAW2647细胞形成破骨细胞,但可抑制RANKL诱导的TRAP阳性多核破骨细胞形成(P<005)。抗坏血酸下调RANKL诱导的碳酐酶Ⅱ和RANK基因mRNA表达及碳酐酶Ⅱ基因蛋白表达,抑制骨吸收功能(P<005)。结论抗坏血酸能直接抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和功能。     

大段同种异体骨移植在骨肿瘤性骨缺损修复中的应用

目的探讨大段深冻同种异体骨及异体半关节移植在治疗四肢骨肿瘤切除后大段骨缺损中的疗效。方法1993年6月～2003年12月应用大段深冻同种异体骨及异体半关节移植治疗四肢骨肿瘤切除后大段骨缺损患者53例，年龄13～58岁，平均36，5岁，其中大段骨移植45例，异体半关节移植8例，异体骨移植长度9～25cm，平均13cm。钢板固定23例，动力髋（或动力髁）固定12例，交锁髓内钉固定12例，普通髓内钉固定6例。结果随访资料完整者48例，术后随访6～132个月，平均38个月，异体骨愈合45例，不愈合3例。主要并发症：复发3例，骨不连3例，感染2例（后治愈），骨折2例，内固定失败1例。关节功能按Mankin标准评定；优18例，良15例，中9例，差6例。结论大段深冻同种异体骨及异体半关节是四肢骨肿瘤切除后大段骨缺损较为理想的修复材料。     

同种异体冻干骨加自体骨移植治疗骨缺损

目的报道采用同种异体冻干骨和自体骨混合一起移植治疗骨质缺损的治疗结果.方法自1995年～2000年对20例大块骨质缺损因自体骨源不足而采用同种异体冻干骨和自体骨按一定比例混合一起进行植骨修复.年龄9岁～65岁,平均32.3岁.骨缺损范围30cm3～90cm3.随访1年～5年,平均1年7个月.结果术后平均5.5个月移植骨和宿主骨骨性愈合.3月～6个月功能恢复正常,无不良反应.结论对治疗大块骨质缺损,应用同种异体冻干骨和自体骨按一定比例混合一起进行植骨治疗是一种有效的方法,可得到类似于自体骨移植的治疗效果.     

同种骨治疗骨缺损20例疗效观察

目的　研究同种骨移植治疗骨缺损的疗效。方法　 2 0例接受同种骨移植的骨缺损患者平均随访 37个月 ,观察术后植骨部位的骨愈合情况。结果　术后除 1例因感染而失败外 ,其余均达到骨性愈合或基本愈合。结论　同种松质骨移植后的骨愈合优于皮质骨 ,插入植骨、紧密对位、坚强内固定有利于植入骨的愈合。同种骨移植是临床治疗骨缺损的一个有效方法     

异体骨结合骨髓间质干细胞移植治疗骨缺损的动物实验

【目的】研究使用异体骨混合骨髓间质干细胞移植治疗骨缺损的可行性及动物实验初步结果。【方法】将15只新西兰白兔双侧桡骨造成1 cm骨缺损模型,随机选择同一只动物的一侧为实验侧,自体配对的另一侧为对照侧。将表面脱钙的同种异体骨和来源于受体的体外培养增殖的骨髓间质干细胞混合植入实验侧骨缺损,对照侧仅植入同样制作的异体骨。12周后,进行X线检查、生物力学检查和组织学检查,将结果进行对比。【结果】动物在术后12周,实验侧X线片光密度测量结果,破坏载荷时扭矩和扭角测量结果均优于对照侧;组织学评分中,实验侧骨痂量评分优于对照侧,骨连接成熟程度和骨髓发育程度两者没有明显差异。【结论】骨髓间质干细胞可以促进异体骨在移植后的成骨作用,在增多成骨量的同时不影响骨组织发育。     

异体骨结合骨髓间质干细胞移植治疗骨缺损的动物实验

 【目的】研究使用异体骨混合骨髓间质干细胞移植治疗骨缺损的可行性及动物实验初步结果。【方法】将15只新西兰白兔双侧桡骨造成1 cm骨缺损模型,随机选择同一只动物的一侧为实验侧,自体配对的另一侧为对照侧。将表面脱钙的同种异体骨和来源于受体的体外培养增殖的骨髓间质干细胞混合植入实验侧骨缺损,对照侧仅植入同样制作的异体骨。12周后,进行X线检查、生物力学检查和组织学检查,将结果进行对比。【结果】动物在术后12周,实验侧X线片光密度测量结果,破坏载荷时扭矩和扭角测量结果均优于对照侧;组织学评分中,实验侧骨痂量评分优于对照侧,骨连接成熟程度和骨髓发育程度两者没有明显差异。【结论】骨髓间质干细胞可以促进异体骨在移植后的成骨作用,在增多成骨量的同时不影响骨组织发育。     

骨转移癌与良性骨肿瘤的鉴别诊断的探讨

本文对14例骨转移癌和20例良性骨肿瘤患者进行三相骨显象检查,并用TF比值和患/健比值进行良、恶性的鉴别。TF比值对良、恶性鉴别的灵敏度为58%,特异性为75%,准确率为66%。而用患/健比值进行鉴别,其灵敏度为65%,特异性为85%,准确率为73%,略优于TF比值的诊断效能。本文认为三相骨显象的患/健比值有助于良、恶性骨病的鉴别诊断。     

中华真地鳖对兔骨折断端局部骨密度的影响

目的:观察中华真地鳖对兔桡骨骨折断端局部骨密度及骨愈合的影响。方法:取新西兰大白兔24只建桡骨骨折模型,随机分为两组,对照组12只给予生理盐水灌胃,实验组12只给予中华真地鳖药液灌胃。术后第15天、第30天、第60天每组随机取4只兔子处死后取出前臂尺桡骨,行X线摄片、骨密度测量及HE染色检查。结果:术后第15天、第30天时,实验组大白兔骨密度高于对照组,差异比较有统计学意义(P<0.05);X线摄片以及HE染色检查示实验组大白兔骨折断端生长良好,骨小梁及骨基质的形成均早于对照组。结论:中华真地鳖能加快骨折愈合过程。     

自体骨移植术中引导骨再生技术的应用研究

目的：探讨自体骨移植术中引导骨再生技术的临床应用及疗效。方法方便选取2013年6月-2014年12月该院收治的26例进行牙槽嵴骨增量手术的患者资料进行回顾性分析,按治疗方法的不同分为观察组与对照组,观察组为给予自体骨移植+膜引导再生技术的患者;对照组为给予单纯的块状自体骨移植的患者,对比两组患者术后牙骨吸收的情况。结果两组患者皆出现移植骨吸收情况,对照组患者骨块吸收值(1.977±0.383)mm相较于观察组患者骨吸收值(0.558±0.220)mm情况更为明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论自体骨移植+膜引导再生技术有利于再生骨的重建及种植体的骨性愈合,骨增量临床效果明显,值得在临床中推广应用。     

冷冻骨和冻干骨生物力学性能研究

目的探讨经冷冻和冷冻脱脂干燥处理的冷冻骨和冻干骨的生物力学性能变化,为同种异体骨移植术和牵张成骨术联合应用提供参考。方法健康杂种狗6只,取其下颌骨分为新鲜骨组Ⅰ、冷冻骨组、新鲜骨组Ⅱ、冻干骨组,每组分别进行弯曲试验、压缩试验。结果冷冻骨组最大弯曲力、抗弯强度、弯曲挠度均明显低于新鲜骨组Ⅰ（P＜0．05）,弯曲弹性模量明显高于新鲜骨组Ⅰ（P＜0．05）。冻干骨组最大弯曲力、弯曲强度、弯曲挠度均明显低于新鲜组骨Ⅱ（P＜0．05）,弯曲弹性模量明显高于新鲜组骨Ⅱ（P＜0．05）。冷冻骨组最大压缩力、抗压强度、压缩挠度均明显低于新鲜骨组Ⅰ（P＜0．05）,压缩弹性模量明显高于新鲜骨组Ⅰ（P＜0．05）,冻干骨组最大压缩力、抗压强度、压缩挠度均明显低于新鲜骨组Ⅱ（P＜0．05）,压缩弹性模量明显高于新鲜骨组Ⅱ（P＜0．05）。结论与新鲜骨相比,冷冻骨和冻干骨的生物力学压缩强度,抗弯强度均依次下降,冻干骨下降更明显;而弯曲弹性模量、压缩弹性模量均依次增加。