Genistein抑制兔晶体上皮细胞膜酪氨酸蛋白激酶及蛋白激酶C磷酸化的研究

目的：研究gemistein对兔晶体上皮细胞增殖及胞膜酪氨酸蛋白激酶(TPK)、蛋白激酶C(PKC)活性的影响，探索使用genitein防治后发性白内障。方法：兔晶体上皮细胞培养，应用Casnctllie改良法检测不同浓度genistein及bFGF作用后,兔晶体上皮细胞膜TPK活性的变化；同位素掺入法检测gemistein及bFGF作用后，兔晶体上皮细胞胞膜及胞浆PKC活性的变化。结果：不同浓度genistein作用后兔晶体上皮细胞TPK活性均较对照组明显下降，genistein可抑制bFGF诱导的TPK活性升高，genistein对PKC活性无明显抑制作用，但可抑制bF(求诱导的PKC活性升高。结论：gerristein在体外可通过抑制生长因子激活的蛋白激酶活性升高而抑制兔晶体上皮细胞增殖。     

PKC信号传导通路对缺氧人视网膜色素上皮细胞表达VEGF的作用

目的 :探讨蛋白激酶C(PKC)信号传导通路对缺氧状态下培养的视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞表达VEGF的作用 .方法 :在缺氧状态下分别培养人RPE细胞 6 ,1 2和 2 4h ;将不同浓度的PKC激动剂佛波醇 1 2 豆蔻酰 1 3乙酸 (phorbol 1 2 myristate 1 3 acetate,PMA)及PKC抑制剂Chelerythrine分别加入人RPE细胞培养液 ,在缺氧状态下培养 2 4h .用免疫组化方法检测各组RPE细胞中VEGF的表达 ,经计算机图像处理 ,定量分析 .结果 :在缺氧状态下 ,RPE细胞对VEGF的表达较非缺氧组RPE细胞显著增加 (P <0 .0 1 ) ;较对照组 ,PMA可增强缺氧状态下RPE细胞VEGF的表达 (P <0 .0 1 ) ,Chelerythrine则减弱VEGF的表达 (P <0 .0 1 ) .结论 :缺氧诱导VEGF在RPE细胞中的表达 ,其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的     

枸杞提取物对小鼠视网膜色素上皮细胞下沉积物形成的抑制作用

目的 研究枸杞提取物对高脂饮食及氢醌诱发的小鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞下沉积物形成的抑制作用.方法 8个月龄的雌性C57BL/6小鼠40只.8只予正常饮食,作为年龄对照组;32只高脂肪饮食喂养6个月后,饮水中加入氢醌(0.8％)继续饲养3个月,随机分为模型对照组(8只)、治疗组(分高剂量、中剂量、低剂量组,每组8只),治疗组以枸杞浸膏灌胃,高剂量3.75 g/(kg·d)、中剂量2.50 g/(kg·d)、低剂量1.25 g/(kg·d),每日1次,持续3个月.观察期满处死动物,摘取眼球.电镜观察RPE细胞下沉积物及Bruch膜;real time-PCR、western blot检测半胱氨酸组织蛋白酶B(Cat B)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)mRNA转录及蛋白表达.结果 造模后RPE细胞损害、RPE细胞下沉积物形成均较年龄对照组明显增加,模型对照组Bruch膜较年龄对照组明显增厚,枸杞提取物能减轻RPE细胞损害、减少沉积物的形成、抑制Bruch膜的增厚.Cat B、Cys C mRNA及蛋白表达模型对照组较年龄对照组增强,枸杞提取物能下调模型小鼠视网膜Cat B、Cys C的表达,随剂量的增加而作用加强,具剂量依赖关系,以Cys C表达下调更显著.结论 枸杞提取物能减轻高脂饮食和氢醌引起的模型小鼠RPE细胞损害,抑制RPE细胞下沉积物形成及Bruch膜增厚,机制可能是减少活性氧介质的产生,下调Cat B、CysC的表达,并使这2种酶的综合作用向Cat B作用倾斜有关.     

高血糖对大鼠视网膜蛋白激酶C的影响

目的 :观察高血糖对STZ诱发糖尿病大鼠视网膜蛋白激酶C(ProteinkinaseC ,PKC)表达的影响。方法 :将 6 0只大鼠分为对照组 1 0只和观察组 5 0只。观察组用STZ造模。 9个月时将大鼠处死 ,通过免疫组织化学法观察两组大鼠视网膜PKC的表达。结果 :观察组PKC蛋白表达增加 ,与对照组比较差异有意义 (P <0 .0 1 )。结论 :高血糖具有促使糖尿病大鼠视网膜组织PKC激活的作用     

新生儿缺氧缺血性脑病模型鼠脑内蛋白激酶C膜转位的变化

目的 探讨蛋白激酶C(PKC)在新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)发病机制中的作用.方法 24只大鼠随机分为3组:正常对照组(N),模型对照组(C).HIE组(HIE);利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western-blot)等生化技术,观察脑皮层和海马PKC膜转位的变化.结果 N组皮层、海马PKC膜转位水平分别为0.28±0.02、0.29±0.02;C组为0.29±0.02、0.30±0.02;HIE组为0.38±0.04、0.40±0.06;HIE组皮层、海马PKC膜转位水平明显增高,分别与N组、C组相比,有明显差异(P＜0.01),N组和C组相比,差异无显著性(P＞0.05).结论 PKC可能参与HIE病理生理机制的形成.     

银杏叶提取物对体外培养视网膜色素上皮细胞凋亡的影响

目的 研究银杏叶提取物(EGb 761)对体外培养的人视网膜色素上皮细胞hRPE细胞凋亡的影响,探讨银杏叶提取物在糖尿病视网膜病变防治中的应用价值.方法 体外培养人视网膜色素上皮细胞(hRPE),分别设立阴性对照(正常培养)组,阳性对照组和EGb 761处理组,EGb 761浓度分别为0.1、0.5和1.0g/L.首先采用浓度500microM双氧水(H2O2)作用2 h诱导细胞凋亡,再分别加入不同浓度EGb 761,作用24 h后采用流式细胞仪、TURNAL染色法检测细胞凋亡,比较银杏叶提取物作用组与对照组间细胞凋亡率的差异.实验结果采用SPSS12.0软件统计分析.结果 阴性对照组hRPE未检测到凋亡细胞,阳性对照组(H2O2作用2h)hRPE细胞凋亡率为(18.66±3.62)%;EGb 761浓度分别为0.1、0.5和1.0g/L组hRPE细胞凋亡率为(14.00±1.98)%,(9.82±1.40)%,(4.94±2.06)%,组间差异有显著性(P＜0.01).结论 EGb 761减少H2O2诱导的人视网膜色素上皮细胞的凋亡,作用强度与药物浓度正相关,EGb 761可能通过减少网膜色素上皮细胞的凋亡而减少糖尿病性视网膜病变的发生.     

蛋白激酶Cα亚型在中国仓鼠卵巢上皮细胞中的表达

目的 研究中国仓鼠卵巢上皮(CHO)细胞是否表达蛋白激酶C(PKC)α亚型.方法 参照GenBank数据库PKCα亚型的cDNA序列,通过EMBL-EBI数据库的CLUSTALW选取种属间同源性最高的序列;利用GENERUNNER软件设计PKCα亚型的特异引物,RT-PCR扩增CHO细胞PKCα亚型的cDNA序列;利用AT克隆技术将PKCα连接到pGEM-T载体上,经蓝白斑筛选,酶切鉴定后测序;Western blotting方法检测CHO细胞中PKC α亚型.结果 RT-PCR和Western blotting方法均表明CHO细胞表达PKCα亚型,并经测序证实.结论 CHO细胞中发现PKCα亚型的存在,为深入研究PKC α亚型的结构、功能及与细胞内信号转导通路的关系奠定基础.     

不放视网膜下液手术治疗视网膜脱离

报告98例98眼不放视网膜下液,视网膜脱离手术结果。仅电凝封孔,巩膜外加压。一次手术成功89例,占91％,2次手术复位5例,占5％、一次手术复位后又发现新孔2例,失败2例。不放液简化了手术,避免了放液可能引起的并发症。正确选择适应证,可提高一次手术成功率。     

早期实验性近视眼视网膜色素上皮细胞的培养及超微结构变化的研究

目的：研究豚鼠早期实验性近视眼视网膜色素上皮(RPE)细胞的培养及超微结构的改变,探索近视的发病机制。方法：2周龄豚鼠30只随机分为A、B、C组,每组10只,再随机选取5只(10眼)正常2周龄豚鼠不作任何干预,作为正常对照眼。选取任意眼戴一10 DS凹透镜,分别饲养6d、15d、30 d后除去镜片,验光及测眼轴长度确定...     

人视网膜色素上皮细胞脱分化模型的建立

目的建立人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞脱分化的模型,体外模拟增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）中RPE的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）过程。方法将ARPE-19细胞培养在无血清、含N2和NEAA的petri dish中,建立RPE的EMT模型,采用倒置荧光显微镜观察细胞形态的转变,采用基因芯片和定量PCR来检测EMT相关基因的表达,采用Western blotting和ELISA来检测相关蛋白的表达。结果 ARPE-19细胞在建模后形态明显发生了改变,基因芯片和Q-PCR检测显示一些与EMT相关的因子（如TGF-β1,Vimentin,CD46）及炎症因子（IL-15）和细胞因子（EGF）的表达上调,ELISA在蛋白水平上显示建模后细胞表达的TGF-β1,IL-15,和EGF蛋白明显增多,Western blotting显示Vimentin蛋白的表达也显著上调。结论 ARPE-19在N2和NEAA的petri dish中培养可以诱导EMT的发生。     

原代人视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏培养

目的 :观察对原代人视网膜色素上皮 (retinalpig mentepithelium ,RPE )细胞进行冻存和复苏培养的效果 .方法 :将 6只尸供眼 ,常规酶消化法分离、纯化的人原代RPE细胞 ,分为两组 ,实验组为即刻进行常规梯度降温液氮冷冻保存 ,1wk后行常规复苏培养 ;对照组为细胞直接进行后续实验 .台盼蓝拒染观察细胞存活率及生长状态 ;计算细胞贴壁率 ;初步计算克隆形成率 .结果 :RPE细胞存活率分别为试验组 (90± 7) % ,对照组 (87± 1 5 ) % ,两组相比无显著性差异(P >0 .0 5 ) ;两组接种细胞贴壁率从 2 4h开始分别为 (5 .0±3.1 ) %～ (6 1 .0± 7.3) %和 (1 5 .0± 6 .3) %～ (6 0 .0± 3.3) % ;培养 4 8h之前 ,两组之间存在统计学差异 (P <0 .0 5 ) ,4 8h之后组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;培养 5 ,7和 1 0d初步克隆形成率两组分别为 (1± 0 ) % ,(1± 1 ) % ,(3± 1 ) %和 (1±0 ) % ,(3± 1 ) % ,(2± 1 ) % ,组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ,n=3) .冻存后复苏培养的RPE细胞生长状态良好 ,增生活跃 ,与对照组类似 .结论 :对原代人RPE细胞进行冻存 ,复苏培养的RPE细胞活性、存活能力、单细胞分裂增生能力不受影响 .     

细胞因子对视网膜色素上皮细胞CD44表达的影响

目的:探讨细胞因子对视网膜色素上皮(RPE)细胞CD44表达的影响及可能的调节机制.方法:取体外培养的第二代兔眼RPE细胞,消化接种于12孔板,分别加入不同浓度(10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L)的碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、血小板源生长因子(PDGF)和肝细胞生长因子(HGF,共同培养12 h后,用流式细胞仪观察RPE细胞膜上CD44的表达情况.以不加任何因子的培养液作阴性对照.结果:正常兔RPE细胞可表达少量CD44.经各种细胞因子诱导后, RPE细胞CD44表达均增加,尤其4种细胞因子联合作用时表达上调最明显,表达水平与细胞因子浓度呈剂量依赖关系.结论:细胞因子b-FGF、TNF-α、PDGF、HGF能诱导RPE细胞CD44表达增强,从而可能促进RPE细胞的黏附及迁移.     

金雀异黄素诱导培养人视网膜色素上皮细胞凋亡

目的 :探讨金雀异黄素对培养人视网膜色素上皮细胞 (hRPE)的促凋亡作用 .方法 :将不同浓度的金雀异黄素作用于培养人视网膜色素上皮细胞 ,通过TUNEL染色和光、电镜的形态学观察 ,观察金雀异黄素对培养hRPE凋亡的诱导作用 .结果 :不同浓度的金雀异黄素可以诱导RPE凋亡 ,5 0mg·L-1 金雀异黄素作用 2 4h即有TUNEL阳性的凋亡细胞出现 ,作用时间在 2 4 ,4 8和 72h ,其凋亡细胞百分数的中位数分别为 7.6 % ,9.8%和 1 3.7% ;当金雀异黄素浓度为 75和1 0 0mg·L-1 时 ,以上 3个时间点凋亡细胞百分数的中位数分别为 1 0 .3% ,1 6 .4 %和 2 3.4 % ;1 5 .4 % ,2 1 .2 %和 35 .8% .透射电镜观察 ,5 0mg·L-1 浓度作用于细胞 ,胞核内染色体出现边集 ,表现凋亡的早期征象 ;75mg·L-1 作用呈现典型的凋亡特征 ;1 0 0mg·L-1 作用于细胞 ,除凋亡细胞外 ,部分细胞出现胞质的进行性溶解 ,有胞膜破坏现象 ,坏死细胞比例增多 .结论 :金雀异黄素可诱导RPE凋亡的发生 ,并有剂量和时间效应关系 .1 0 0mg·L-1 金雀异黄素使RPE坏死     

维拉帕米对兔视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用

目的：观察维拉帕米对兔视网膜色素上皮细胞增殖的影响。寻找有效、安全、方便的药物以防治增增性玻璃体视网膜病变。方法：分别将不同浓度的维拉帕米加入体外的兔ＲＰＥ细胞,用噻唑蓝（ＭＴＴ）比色法在自动酶标测定仪测５４０ｍｍ处的吸光值Ａ「旧称光密度（ＯＤ）」,计算出不同浓度条件下的细胞增殖抑制率及５０％抑制浓度,同时用２％台盼蓝色,测定细胞活性。结果：Ｖｅｒ在所设浓度范围内均明显抑制血清诱导的兔ＲＰＥ细胞的     

猪视网膜色素上皮细胞的体外培养

目的：将猪视网膜色素上皮(RPE)细胞进行体外培养，为研究RPE细胞的功能及治疗有关眼底疾病提供细胞来源。方法：采用胰酶2次消化法分离猪RPE细胞，15％DMEM培养液培养，每天倒置显微镜观察细胞生长情况，并作流式细胞仪分析培养细胞的细胞周期。以免疫组织化学法鉴定培养细胞的来源。结果：离体培养细胞初期呈圆形，富含黑色素，12～24h贴壁呈圆形、梭形及不规则形。传代后细胞渐趋透明。免疫组化证实RPE细胞均为鼠抗人角蛋白染色阳性。细胞周期分析提示体外培养的RPE细胞保持正常的繁殖能力。结论：培养的细胞可作为体外猪RPE细胞的来源。     

羊膜对培养的人视网膜色素上皮细胞增殖影响的实验研究

目的　观察羊膜是否对视网膜色素上皮细胞 (Retinalpigmentepithelial ,RPE)的生长有影响 ,探讨羊膜用于治疗增殖性玻璃体视网膜病变 (Proliferativevitreoretinopathy ,PVR)的潜在可能性。方法　运用MTT比色法 ,观察羊膜匀浆在不同浓度 (4 0、80、160 μg ml)及不同作用时相点 (2 4、48、96h)对人RPE增殖的影响。 结果　①在第 2 4小时 ,3个浓度羊膜匀浆均对人RPE增殖起抑制作用 ,而且随浓度增加抑制作用减弱 ,抑制率 (5 0 774%、2 7 3 87%、14 80 2 % )间相差显著 (P <0 0 5 ) ;在第 48、96小时 ,羊膜匀浆在低浓度时 ,对人RPE增殖起抑制作用 ,而在中、高浓度为促增殖作用 ,其中在第 48小时抑制率 (4 494%、-0 944 %、-3 693 % )间相差不显著 (P >0 0 5 ) ,在第 96小时时抑制率 (8 3 88%、-9 42 5 %、-17 65 1% )间相差显著 (P <0 0 5 )。②羊膜匀浆浓度为 40 μg ml ,各时相点对人RPE均为抑制增殖 ,抑制率间相差非常显著 (P <0 0 1) ;在浓度为 80 μg ml、160 μg ml时 ,随着作用时间延长 ,羊膜匀浆对人RPE增殖的作用逐渐由抑制变为促进作用 ,抑制率间相差显著 (P <0 0 5 )。结论　羊膜匀浆在低浓度 ,短时间内对人RPE增殖有抑制作用 ,而在高浓度、长时间则对RPE增殖有促进作用。羊膜匀浆用     

Immunocytochemical characteristics of cultured human retinal pigment epithelial cells

Rehnal Pigment epithelial cells (RPEC), as one ofthe most ~t cell layers in the eye, po~ a nof fUnctions cmcial in PreServing the integhty Of the visualsystem. The hantenance of healthy RPEC is critical fornOImal retinal funCtion, and the etiologies Of many retinaldisolders may have their Prifnaly origins in the pigment epitheliam. The PIDlilbmtion of RPEC in foe yi~s and onthe surfaCe Of retina is the pathological cause Of Pmlifelative yi~whnOPathy (PVR). On the other hand the a…     

氯离子转运通道在人视网膜色素上皮细胞吞噬过程中的作用

目的：探讨丁脲胺或DNDS作用下视网膜色素上皮（RPE）细胞顶端膜和基底膜上氯离子转运通道对RPE吞噬功能的影响,阐明氯离子转运通道参与PRE吞噬作用的机制。方法:利用微孔滤膜培养系统体外培养极性化单层RPE细胞,以荧光包被的乳胶株作为吞噬标记物,建立RPE细胞吞噬模型,分别以1、5、10、50、100、500和1 000 μmol·L^-1丁脲胺,以及0.01、.10、0.50、1.00、3.00、5.00和10.00 mmol·L^-1DNDS作用RPE细胞6 h后,应用流式细胞仪定量检测RPE细胞吞噬指数。结果:不同浓度丁脲胺作用于RPE细胞顶端膜或基底膜,RPE细胞对乳胶株的吞噬指数与对照组比较差异无显著性（P>0.05）;0.01和0.10μmol·L-1DNDS作用于RPE细胞基底膜,RPE细胞对乳胶株的吞噬指数与对照组比较差异无显著性（P>0.05）,而0.50、1.00、3.00、5.00、10.00 mmol·L^-1的DNDS作用于RPE细胞基底膜,RPE细胞对乳胶株的吞噬指数降低（P<0.05或P<0.01）,并随着浓度的增加,吞噬指数逐渐降低;但同样浓度的DNDS作用于RPE细胞顶端膜,RPE细胞对乳胶株的吞噬指数无明显改变（P>0.05）。结论:顶端膜的丁脲胺敏感性Na⁺-K⁺-2Cl^－协同转运载体不参与RPE吞噬乳胶株的过程,而基底膜的DNDS敏感性Cl－/HCO₃^－交换蛋白及氯离子通道在DNDS作用后,对人RPE细胞非特异性吞噬过程发挥抑制作用。     

转录因子诱导人脐带间充质干细胞转分化为视网膜色素上皮样细胞的研究

目的 探讨采用关键转录因子将人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)转分化为视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)样细胞的方法。方法 通过流式细胞技术鉴定hUC-MSCs的表面标记分子;通过诱导hUC-MSCs分化成为脂肪、骨和软骨细胞确定其多系分化能力;采用慢病毒包装系统获得分别含有11个转录因子Sox2、Pax6、Rax、Six6、Nr2e1、Otx2、Lhx2、Crx、Mitf-A、Klf4和c-Myc的病毒,并通过感染hUC-MSCs来诱导hUC-MSCs向RPE样细胞分化。结果 hUC-MSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,但不表达CD11b、CD34, CD45和HLA-DR等分子标记,在成脂、成骨、成软骨分化培养基中可分化为脂肪、骨和软骨细胞。视网膜及RPE发育相关的关键转录因子能够将hUC-MSCs直接转分化为RPE样的细胞,并表达ZO-1、RPE65、Bestrophin-1(Best-1)、CK8/18、Cralbp、Mertk、Tyrosinase(Tyr)、PEDF等RPE细胞的特征分子。结论 视网膜及RPE发育相关的关键转录因子可直接将hUC-MSCs分化为RPE样细胞。