用地高辛配基标记DNA探针及其应用

核酸杂交技术中,同位素标记DNA探针是最常用的技术,其优越性是检测灵敏度高,但同时有很多缺点。80年代初,Langer等开始用生物素标记多核苷酸探针。随着方法的不断完善,近年来已用于基因诊断、定位及表达等研究。本文报道一种新的非同位素标记技术,即用地高辛配基(digoxigenin-dUTP)标记DNA探针,其原理是具有类固醇半抗原性质的地高辛配基,通过随机引物(random pr-imer法)掺入到DNA上,与靶DNA进行碱基互补同源序列结合形成杂交产物,然后通过酶联免疫法与     

成人型多囊肾病儿童期发病机理初探

本文利用α-珠蛋白基因3-HVR探针对一个存在儿童期发病的成人型囊肾病(adult polycystic kidney disease,APKD)家系进行研究,发现该家系中APKD的发生是由于AP-KD1基因突变所致。但是APKD1基因突变本身并不足以导致该病的早发。结果提示APKD在儿童期的早发可能是其它遗传因素或环境因素共同作用的结果,或是基因组印记对APKD突变基因表达的修饰作用所致。     

武汉地区正常汉族人载脂蛋白B基因区域DNA多态频率的研究

应用载脂蛋白Ｂ（ＡｐｏＢ）ｃＤＮＡ探针（ＬＢ１．５），检测了２１名武汉地区正常汉族人血脂个体的ＡｐｏＢ基因限制性内切酶ＭｓｐⅠ限制性片断长度多态性（ＲＦＬＰ）等位基因频率。结果显示：２１份标本共出现２．３５ｋｂ（Ｍ_１）和２．６０ｋｂ（Ｍ_２）２条杂交片段；突变型等位基因Ｍ_２位于ＡｐｏＢ基因３’端侧翼的高变区（ＨＶＲ）内，其基因频率为０．０２４，并具有种族差异。Ｍ_２基因的检出和基因频率的获得，为进一步揭示ＡｐｏＢ基因区域在脂类代谢中的作用提供了一个很好的遗传标记。     

化学发光加强法核酸标记检测系统用于猪DNA指纹分析的研究

目的　探讨化学发光加强法(ECL)核酸直接标记和检测系统应用于猪的DNA指纹分析的可行性。方法　采用人源α-珠蛋白3'HVR探针,应用ECL核酸直接标记和检测系统,对西双版纳小耳猪进行了Southern杂交DNA指纹分析,获得了最适实验条件。结果　取10μg基因组DNA于30μl反应体系中,加入HinfⅠ或HaeⅢ内切酶3～5U/μgDNA,酶切消化4h,消化液在50V电压条件下4℃电泳20h,采用真空转移法进行脱嘌呤、碱变性、中和及转膜,时间分别为15min、15min及20min,转膜采用20×SSC真空转移1h至hybondN+尼龙膜上,大大提高了转膜效率。以HRP标记探针进行管中杂交,以化学发光法进行检测,室温放射自显影30min,获得了清晰可辨的DNA指纹图。结论　该方法可用于猪的DNA指纹分析,其效果与同位素标记探针的效果基本一致。     

杜氏盐藻2种碳酸酐酶基因5'上游的克隆与序列分析

目的：克隆盐藻2种碳酸酐酶基因(DCA1、CA1)5’上游区序列，并对其进行测序和序列分析。方法：利用Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、PvuⅡ和StuⅠ4种平端限制内切酶分别酶切盐藻基因组DNA，并与衔接头连接，构建成盐藻步行基因组文库GWL1、GWL2、GWL3和GWL4；巢式PCR方法从盐藻步行基因组文库中扩增DCA1和CA1基因5’上游区序列，双脱氧末端终止法测序。结果：DCA1基因，在GWL1、GWL3中分别扩增出约1．3kb和4、5kb的特异带，而CA1基因，则在GW12、GWL4中分别扩增出1．7kb和2．5kb的特异带；序列分析结果表明，所得序列的3’端与已知DCA1、CA1基因cDNA5’端序列完全一致。该2序列均有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA—box、CAAT—box)和富含GT的重复序列等许多相似之处。结论：采用基因组步行方法从已知cDNA周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的DCA1、CA1基因的5’上游区序列，可能是2种新的杜氏盐藻碳酸酐酶基因的启动子区序列。     

情感性精神病与Ha－ras基因限制性片段长度多态性关系的研究

用人Ｃ－Ｈａ－ｒａｓ－１全长基因组ＤＮＡ作探针，对３８例双相型情感性精神病人和正常对照人群６６人进行ＲＦＬＰ分析，ＳａｃＩ酶解产生５．２ｋｂ，５．７ｋｂ，６．２ｋｂ和６．８ｋｂ四种等位多态片段，但各等位片段的频率与北美人比较有较大差别。ＢＰ病人和正常人之间，等位片段分布及等位片段组成的基因型分布均无显著差异。对４个ＢＰ家系进行分析，其中两个家系可见到等位片段分离现象，但基因传递和情感性精神病之间的关系难以确定。研究结果不支持情感性精神病与Ｈａ－ｒａｓ基因连锁。     

雌激素受体基因多态性与脑梗死的相关性研究

目的　探讨中国汉族人群雌激素受体 (ER)基因PvuⅡ和XbaⅠ酶切多态性与脑梗死的相关性。方法　采用病例 对照研究方法和PCR RFLP方法 ,检测 2 34例脑梗死和 2 59例非脑血管病患者的ER基因PvuⅡ及XbaⅠ多态性 ,用多元Logistic回归模型分析与脑梗死的相关性。结果　经年龄、性别、吸烟、饮酒、文化程度、高血压、糖尿病、冠心病、高脂血症调整后可见 :(1 )ER基因PvuⅡ酶切多态性的Pp基因型致脑梗死发病危险性显著增加 (OR =1 97,95 %CI:1 2 1～ 3 2 1 ) ;(2 )ER基因XbaⅠ酶切多态性与脑梗死无显著相关性 ;(3)ER基因PPXx Ppxx基因型经高血压、高脂血症分层前后均致脑梗死发病危险性显著增加 (OR值分别为 1 67,2 52及 2 1 8,P <0 0 5) ;(4)ER基因PvuⅡ酶切多态性与高血压、糖尿病、高脂血症对脑梗死的发生具有明显的协同作用。结论　ER基因可能是中国人群脑梗死的遗传易感基因     

A study of DNA fingerprinting in China

A recombinant DNA insert which could be hybridized with variable number of tandem repeat (VNTR) sequence probe was obtained from the screening of human genomic DNA library and it was cloned into plasmid for using as a probe designated as ph 296. Highly individual specific DNA fingerprints was produced by hybridizing radioactive labelled ph 296 with restriction endonuclease Hinf I digested genomic DNA of Chinese individuals of Han origin. The number of DNA fragments greater than or equal to 4 kb per individual was 13.6 +/- 3.0; the frequency of shared DNA fragments in unrelated random-paired individuals was 0.25; and the probability that all fragments were detected in both random-paired individuals was 2.0 x 10(-9). ph 296 is an locus-specific probe. The application of DNA fingerprinting is discussed.     

转基因鼠中人α类珠蛋白基因簇染色质构象调控变化

目的 用人珠蛋白转基因鼠模型建立染色质构象捕获的技术体系,探讨人α类珠蛋白基因簇的染色质构象变化与基因表达调控的关系。方法 使人α类珠蛋白转基因纯合子公鼠与KM母鼠交配,从怀孕14．5d的母鼠体内取出珠蛋白基因表达组织胎肝和非表达组织胎脑细胞,用甲醛交联固定细胞核内的染色质构象,限制性内切酶Nco Ⅰ消化后用T4DNA连接酶连接,解交联后提取并纯化连接的基因组DNA,在连接位点的两侧设计引物,用半定量PCR分析胎肝和胎脑中人α类珠蛋白基因簇染色质构象模式。结果以含HS40的限制性酶切片段作固定片段时,在胎脑中其他限制性酶切片段与其交联效率随线型距离增加而降低;而在胎肝中,表达的珠蛋白基因α2、α1的酶切片段与其交联效率明显高于胎脑,含有已关闭珠蛋白基因ζ的酶切片段与其交联效率与胎脑相当。以含α2的限制性酶切片段作固定片段时,在胎脑中其他限制性酶切片段与其交联效率随线型距离增加而降低;而在胎肝中,上游调控元件HS40和33与其交联效率明显高于胎脑;HS10和8与其交联效率略低于胎脑。结论 在表达组织中,人α类珠蛋白基因簇上游远端调控元件通过形成染色质环与下游表达基因靠近,从而调控α类珠蛋白基因的表达;而在非表达组织中,无此染色质环形成。     

变性高效液相色谱检测乳腺癌患者血浆线粒体D环HVR2突变

目的 :探讨扩增乳腺癌患者血浆线粒体DNA(mito chondrialDNA ,mtDNA)的可行性 ,研究乳腺癌患者血浆线粒体DNA基因突变检测对于乳腺癌早期诊断及其预后的意义 .方法 :选取乳腺癌患者 10例 ,正常健康者 10人 ,提取血浆DNA ,采用聚合酶链反应 (PCR)扩增血浆线粒体DNA的D环HVR2 ,用两对引物扩增 ,用变性高效液相色谱法 (DHPLC)对产物进行突变筛选 .结果 :10例乳腺癌患者血浆提取的DNA能扩增出 11个目的片断 ,DHPLC检测到有 4例突变 ,正常健康者 10人扩增出 1例 .结论 :乳腺癌患者血浆DNA扩增与正常组有明显差异 (P <0 .0 5 ) ,血浆线粒体DNA基因突变检测对于乳腺癌早期诊断及预后有重要意义