广东登革3型病毒株的分离培养和鉴定

目的 对2009年发生于广东地区的3例家庭聚集性登革热患者血清进行登革病毒的鉴定和病毒株的培养分离.方法 用胶体金法检测患者血清中登革病毒特异性IgM、IgG抗体;C6/36细胞培养患者血清中登革病毒;RT-PCR扩增C-PrM基因序列的片段以检测患者血清中登革病毒RNA,PCR产物经序列测定后进行生物信息学分析.结果 3例患者血清学检测均为登革病毒特异性IgM阳性、IgG阴性;特异性RT-PCR产物长约290bp,经琼脂糖电泳和测序分析,证实3例患者血清中均存在登革3型病毒;从1例患者血清中培养分离到了登革病毒株,经RT-PCR和测序证实为登革3型病毒.结论 2009年发生于广东地区的3例登革热患者经病毒培养和分子生物学鉴定,证实均为登革3型病毒感染.     

河南省1例柬埔寨输入登革热病例的病原分子分型与全基因序列分析

目的鉴定河南省1例来自柬埔寨的登革热输入性病例的登革病毒(dengue virus,DENV)血清型和基因型及其序列特征和传播来源。方法患者血液标本来源于2019年国家疾病监测系统网络直报的登革热疑似病例。样品经快速检测DENV NS1抗原和IgM/IgG抗体,再提取血清中核酸,应用荧光RT-PCR法进行DENV血清型鉴定,同时用Vero和BHK-21细胞对血清标本进行病毒分离培养,阳性培养物扩增全基因组序列,进行序列系统进化分析。结果该病例实验室确诊为DENV 1型感染,并从血清标本中分离到病毒株,测序后拼接成全长10670 nt的全基因组序列,经系统进化分析,该病毒株属于DENV 1型基因Ⅰ型,与东南亚流行株具有较高同源性和较近亲缘关系。结论2019年河南省来自柬埔寨的输入性病例的病原体为DENV 1型基因I型,此为近年来东南亚输入我国的常见血清型和基因型。     

深圳市2015年首例输入性登革热病毒溯源分析

目的 对2015年深圳市报告的首例输入性登革热病例进行溯源分析。方法 收集该病例流行病学资料及血清样本,并通过免疫层析法和实时荧光RT-PCR对该病例血清中的特异性IgM抗体、IgG抗体、NS1抗原及病毒核酸进行检测。用C6/36细胞对血清进行病毒分离。对分离株的E基因进行序列测定,与不同型别的标准株及不同地区的分离株进行同源性分析并构建系统发生树。同时对糖基化位点、毒力位点上的序列进行比较。结果 从该病例血清中检测出IgM抗体、NS1抗原和2型登革病毒RNA,并成功从血清样本中分离出登革病毒DEN2-SZ1503。 SZ1503与标准2型登革病毒NGC株E基因的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为93.8％和97.8％。系统发生树表明SZ1503与SG（EHI）D2 / 06572Y13株（Malaysia 2013）,具有最高相似性,且位于系统发育树的同一分支中。该分离株同1051株（Indonesia 76）、10株（Somalia 84）和271-206株（Sri Lanka 90）一起属于基因型Ⅳ。SZ1503株E基因的糖基化位点与其他登革热2型毒株相同,毒力位点也与之前报道的毒株一致。结论 病毒学、血清学和流行病学结果表明,该输入登革热病例是由2型登革热病毒引起的,SZ1503病毒株的遗传特征与马来西亚流行的登革热病毒一致。     

兔源性Ⅱ型prM多抗对Ⅰ型登革病毒无增强活性的中和作用

目的从Ⅰ型登革病毒(dengue virus,DENV)感染患者血清中分离病毒,并探究Ⅱ型登革病毒prM多抗对该病毒体外感染细胞的影响。方法用C6/36细胞分离并扩大培养Ⅰ型登革患者血清中的登革病毒,根据细胞病变收取病毒,空斑实验测定病毒滴度。免疫荧光、流式细胞术及qRT-PCR检测病毒对细胞的感染,空斑减少中和实验和抗体依赖增强感染实验测定Ⅱ型登革病毒prM抗体对病毒的中和及增强活性。结果分离扩大培养了一株Ⅰ型登革病毒,滴度达到8×10~7pfu/m L。登革病毒可以在K562细胞复制增值,ana-1细胞可以主动吞噬病毒但病毒在此细胞内不复制。0.1、1μg/m L的多抗与病毒孵育后感染BHK细胞产生的空斑数与未加入抗体的空斑数相比,差异有统计学意义(P0.001)。另外,prM多抗并没有增加登革病毒对K562细胞的感染。结论成功扩大培养DENVⅠ毒株,体外实验结果证明兔源性prM多抗是一种无增强活性的中和型抗体。     

输入性登革热的实验室诊断

目的通过实验室检测发现并确诊1例输入性登革热阳性病例。方法采用实时荧光(RT-PCR方法对病人血清进行检测,并对RT-PCR扩增产物进行核苷酸序列测定,检测结果使用BLAST进行比对;并采用间接ELISA法和捕获ELISA法分别检测登革热特异性抗体IgG、IgM。结果通过实时荧光RT-PCR方法检测出该病例呈登革热病毒核酸Ⅲ型阳性;对RT-PCR扩增产物进行序列比对,结果显示与登革病毒III型同源性很好;ELISA法检测登革热特异性抗体IgG、IgM均为阴性。结论通过实验室确诊,该病例为登革热阳性病例。     

江苏省2009—2013年汉坦病毒分离株全基因序列测定及分析

目的:从分子水平分析2009—2013年江苏省分离汉坦病毒(Hantavirus,HV)的型别及变化,为疾病的预防控制提供实验依据?方法:采集2009—2013年江苏省肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)急性期患者血清及监测点鼠肺标本?采用胶体金法检测血清样本中汉坦病毒的IgM?IgG抗体,采用免疫荧光检测鼠肺样本中汉坦病毒抗原,并用VERO E6细胞分离病毒,RT-PCR检测标本培养物中病毒M片段以鉴定HV病毒,采用高通量测序技术对分离株进行全基因组测序,MEGA6.0软件对其进行序列比对和进化分析?结果:分离到的11株病毒与陕西分离株LR1?四川分离株S85-46以及汉坦病毒原型株76-118遗传距离最为接近,属于汉滩(Hantean,HTN)型病毒?分离株与2002年分离的江苏(A9?HTN型)株以及浙江株?安徽株处于不同的进化分支上,表明遗传关系较远?结论:江苏的汉坦病毒优势株发生了变化,而且发生了宿主转换?目前疫苗仍具有保护效力,但需加强监测?     

芜湖市输入性登革热1例的实验诊断与分析

目的:对芜湖市1例输入性登革热病例进行实验室检查,为临床病例的确诊提供参考依据。方法:对患者的病史、诊疗经过等资料进行归纳、分析,用登革病毒通用引物和血清型特异引物进行巢氏PCR检测和分析患者是否感染登革病毒及其登革病毒血清分型,并对扩增产物进行克隆测序和比对分析。结果:基因扩增产物显示与Ⅰ型登革病毒位置一致,产物序列在NCBI上比对分析,再次证实为Ⅰ型登革热病毒。结论:该患者确诊为登革热Ⅰ型病毒感染。     

固相酶联免疫测定法检测NS1抗原在登革病毒感染早期诊断中的应用

目的探讨固相酶联免疫测定（ELISA）法检测NS1抗原在登革病毒感染早期诊断中的应用价值。方法选取登革病毒感染早期患者血清171份,非登革病毒感染发热患者血清11份,正常人血清10份,采用ELISA法检测全部192份血清的登革病毒NS1抗原和IgM抗体;采用逆转录-聚合酶链反应-限制性内切酶酶切片段长度多态性分析（RT-PCR-RFLP）技术对发病5 d内的125份血清进行扩增和鉴定分型;并采用C6/36细胞微量培养法对发病第1、2天的41份血清进行登革病毒分离培养。结果登革病毒感染患者发病2 d内、3～5 d以及6～10 d血清NS1抗原的检出率分别是92.7%（38/41）、83.3%（70/84）、10.9%（5/46）;IgM抗体的检出率分别是2.4%（1/41）、51.2%（43/84）、97.8%（45/46）;非登革病毒感染的发热患者及正常人血清中,有1例疟疾患者血清登革病毒IgM抗体呈阳性,NS1抗原无一例阳性。RT-PCR在登革病毒感染患者发病第1、2天和3～5天的检出率分别是85.4%（35/41）、83.3%（70/84）;登革病毒感染患者发病第1、2天血清的病毒分离培养阳性率分别是80.0%（16/20）、38.1%（8/21）,总分离率58.5%（24/41）;RT-PCR-RFLP分型鉴定技术及间接免疫荧光法（IFA）均证实2006年广州流行株为登革Ⅰ型病毒。结论ELISA法检测登革病毒NS1抗原操作技术成熟,且具有敏感性高、特异性好的特点,对登革病毒感染的早期诊断和疫情的早期控制具有重要意义,适合于基层医疗机构常规应用。     

2003年广州市登革1型病毒流行株的分离及NS2基因序列分析

目的对广州市区2003年仲夏—批疑似登革病毒感染的患进行确诊，并从基因水平分析流行株的可能来源。方法用免疫层析法(ICT)检测早期疑似患的DV—IgN和IgG抗体；同时用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)、细胞培养病毒分离分别进行病原的分离和鉴定；对所分离到的毒株进行基因克隆、测序，并与国际参考株及国内流行株相应的序列进行同源性分析，结合患的流行病学资料推测本次流行株的可能来源。结果发病5d内患DV—IgM抗体阳性率为56．5％(13／23)，发病5～10d的患DV—IgM抗体阳性率为66．7％(16／24)；DV—IgG抗体无1例阳性。从18份发病5d内患的血标本中分离病毒7份，经RT—PCR和基因测序检测证实为DVI感染；用RT—PER检测30份早期患血标本，患的阳性率为83．3％(25／30)。基因序列分析表明，2003年流行株与登革1型病毒柬埔寨流行株及我国1997、1999年登革1型病毒流行株的同源性最高，分别为97％、97％、98％。所有患在发病前两个月均在广州市区某大院内居住，无输血史、无外出史。结论2003年广州登革热流行为登革1型病毒感染所致，推测广东可能存在登革1型病毒的疫源地。     

简并PCR在肠道病毒血清型鉴定中的应用

目的 探讨共有序列简并杂合寡核苷酸引物PCR（CODEHOP-PCR）在肠道病毒血清型鉴定中的临床应用价值。方法 以CODEHOP-PCR检测经实时荧光RT-PCR鉴定为EV71和CA16 手足口病患者的临床样本和病毒分离培养细胞上清的肠道病毒VP1基因片段,经琼脂糖凝胶电泳并回收、测序,与Genbank提供的序列比较,确定肠道病毒的血清型。结果 CODEHOP-PCR后的序列分析表明,所有的EV71毒株和CA16毒株与近几年国内报道的部分毒株同源性在96%以上,其血清分型结果验证了实时荧光RT-PCR分型结果的准确性。结论 CODEHOP-PCR合并测序用于肠道病毒血清型的准确鉴定,与传统的病毒分离及血清中和试验相比,具有更快速、准确的优点。     

广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株E基因序列分析

目的测定广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株的E基因序列并进行分析。方法收集广州市2006年登革热患者急性期血清,用C6/36细胞培养分离登革病毒,RT-PCR法扩增全长E基因,测定序列并绘制系统发生树,进行生物信息学分析。结果59份标本中38份病毒分离培养阳性,获得广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株GZ2006/1707的E基因序列,其同源性与东南亚缅甸、泰国、柬埔寨等地的流行株接近,但与广州市2002年Ⅰ型登革病毒流行株GZ2002/281较远。结论广州市2006年流行的登革病毒属输入性,但与2002年流行的登革病毒有不同的输入源。     

用RT-PCR方法检测登革病毒E基因核酸

目的：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术建立检测登革2型病毒E基因的方法。方法：分别抽提登革2型病毒NGC株和从登革出血热病人血清中分离得到的2型登革热病毒(DV)核酸(RNA)，合成CD-NA第一链，经过RT-PCR得到cDNA产物，用HinfI限制性内切酶酶切鉴定。结果：通过RT-PCR检测登革2型病毒核酸。结论：登革2型病毒E基因核酸的RT-PCR检测方法的建立为快速诊断登革病毒感染提供了可靠的方法。     

基于SPR免疫传感器技术的登革热血清学检测方法研究

目的建立一种非标记、多指标的登革热快速检测方法,应用于登革热疑似病例的血清样本的快速检测。方法采用表面引发聚合反应技术构建基于寡聚乙二醇高分子的抗蛋白质非特异性吸附表面,以抗登革热IgM、IgG和抗登革热NS1抗体分别作为捕获探针,建立登革热的多指标微阵列芯片。采用表面等离子共振检测技术的技术手段,在血清中检测登革热特异性抗体。结果该技术方法对262份登革热疑似病例血清进行检测,阳性检出率为6.9%(18/262),高于PCR 2.3%(6/262)和ELISA 5.3%(14/262),其中PCR阳性的6份血清样本均检测到NS1标记物,而14份ELISA阳性样本中,检测出其中12份,两者的检测符合率为85.7%。结论初步构建一种登革热综合性蛋白质芯片,结合SPR技术可并行检测多个项目,可为登革热的快速检测提供一个有力的技术平台。     

广东阳江市2001和2006年两次登革热流行特征分析

目的分析阳江市2001和2006年两次登革热流行特征，为今后防制工作提供参考。方法收集临床个案和疫点流行病学调查资料；病人采血检测登革病毒IgM抗体，用C6／36细胞分离登革病毒，并用单克隆抗体鉴定型别。结果阳江市2001年8月初至11月初发生登革热流行流行102d，高峰8上旬～10月中旬，确诊136例，发病率为5．31／10万；2006年6月下旬至9月上旬发生疫情，共流行67d，高峰8月中下旬，确诊22例，发病率0，84／10万；病例的消长情况与当地的蚊媒消长情况一致；8～11月份布雷图指数为0．00～111．00；实验诊断150例，临床确诊8例，从13例病人血标本中分离到11株病毒，均为登革病毒Ⅰ型。结论阳江市两次流行的登革热病例病情以轻型居多，发病人群以青壮年为主，人群在流行后经过5～6年普遍易感，流行高峰在8～10月，皆发现白纹伊蚊是当地的传播媒介。     

中山市一起登革热局部爆发的流行病学调查

目的分析中山市2004年一起登革热爆发的流行病学特征,为制定登革热预防控制措施提供科学依据。方法按登革热诊断标准进行回顾性流行病学调查,使用登革热IgM/IgG快速免疫色谱测试卡对疑似病例血清进行登革热抗体检测,用C6/36细胞对急性期病人血清进行病毒分离。使用布雷图指数(BⅠ)法进行蚊媒密度调查。结果本次疫情流行历时36d,共发病37例,登革热抗体阳性37例,分离到登革Ⅰ型病毒4株。病例主要集中在城区城乡结合部,男性16例,女性21例,发病年龄最小6岁,最大63岁,其中10～39岁27例,占72.97%。疫情发生时布雷图指数67.0,经采取以快速杀灭成蚊和清除伊蚊孳生地为主的综合防治措施后,疫情很快得到控制。结论本次疫情是由I型登革病毒引起,因早期病例误诊,未及时发现传染源,导致疾病传播。快速灭蚊和清除伊蚊孳生地是控制疫情的有效措施。针对该市的流行因素,今后应继续加强各项控制措施的执行落实,加强可疑病例的监测和杀灭蚊媒的工作,扩大原因不明发热病人血常规监测范围,特别是曾发生疫情的乡镇社区卫生服务站。     

登革病毒甲基纤维素微量蚀斑技术的建立

目的建立登革病毒甲基纤维素微量蚀斑技术。方法将4株登革病毒接种于C6/36细胞内,5-7d后染色,观察蚀斑情况并计数。将测得值与组织培养半数感染量测定结果比较。结果登革病毒甲基纤维素微量蚀斑技术重复性好,比组织培养半数感染量法敏感。结论甲基纤维素徽量蚀斑技术可靠易行,可用于登革病毒滴定。     

广州市2001-2010年登革热流行病学分析

目的分析广州市近年来登革热疫情特点及流行规律,为制定预防控制措施提供依据。方法收集广州市2001-2010年登革热疫情资料,用描述性流行病学方法分析其流行特征和流行因素。结果 2001-2010年广州市共报告登革热病例2458例,每年均有本地感染病例和输入病例的报告,其中本地感染病例2366例,输入性病例92例。年发病率在0/10万～20.14/10万之间。疫情涉及12个区县,主要集中在荔湾区(26.24%)、越秀区(25.65%)、天河区(14.41)、白云区(12.00%)和番禺区(8.77%)。4-12月均有病例报告,其中5月份前为输入性为主的散发病例,6-12月为流行期,8-10月病例数占总病例数的88.12%,为发病高峰期。男女性别比为1.06∶1。各年龄组均有发病,但发病率以中壮年和老年人群居高。职业分布以家务及待业、工人和学生为主。病例输入地主要以印尼、越南、泰国等东南亚地区为主。暴发的疫情主要由登革病毒Ⅰ型引起。结论广州市登革热仍为输入或输入引起本地传播的传染病,至今仍无证据表明已成为地方性疾病。