IL-2和IL-10对Treg细胞体外扩增影响的差异研究

目的 分析细胞因子IL-2和IL-10对Treg细胞体外扩增的促进作用,比较扩增的Treg细胞和自然分选Treg细胞对CTL功能活性的影响.方法 采用不同浓度细胞因子IL-2和IL-10作为诱导剂,分析2种细胞因子体外诱导Treg细胞增殖的有效性及最适浓度,同时以2种细胞因子诱导扩增的Treg细胞和自然分选的Treg细胞分别作用于CTL,分析采用体外扩增Treg细胞抑制CTL活性的可能性.结果 100 ng/ml IL-2能够诱导Treg细胞增殖明显增加,经48、96 h和144 h诱导后,其增殖比例分别达到10%、18%和20%,而IL-10的使用浓度需达到150 ng/ml才能获得同样的扩增比例;与自然分选的Treg细胞对比,采用细胞因子体外扩增的Treg细胞具有同等抑制CTL功能活性的效力,组间无显著性差异(P＞0.05).结论 采用添加IL-2培养体系是体外扩增Treg细胞的优选方法,其增殖效能强于IL-10;体外扩增Treg细胞与自然分选Treg细胞对CTL的功能抑制没有明显差异.     

CD4+CD25+Treg细胞调节T细胞的作用机制分析

目的通过检测Treg细胞表达介导抑制性共刺激分子CTLA4和分泌抑制性细胞因子,并设置Treg细胞与效应性T细胞共培养和分隔培养实验模型,分析Treg细胞对效应性T细胞形成抑制作用的可能机制及各机制的主次要关系.方法对比分析Treg细胞与效应性T细胞膜分子CTLA4、CD28表达和细胞因子IL-10、TGF-β1分泌水平;以TransWell Millicell-PCF分隔培养槽分隔培养Treg细胞与不同淋巴细胞组成的反应体系,采用向共培养及分隔培养体系加入与不加入IL-10、TGF-β1抗体的阻断方法,检测Treg细胞对不同组混合淋巴细胞反应的抑制效率.结果 Treg细胞分泌IL-10和TGF-β1的浓度水平明显高于效应性T细胞,Treg细胞培养上清中IL-10和TGF-β1水平分别达到(380±36.3) pg/ml和(790±56.8) pg/ml,Treg细胞分泌IL-10和TGF-β1的浓度水平与效应性T细胞比较,均有显著性差异(P<0.01).共刺激分子CTLA4、CD28在Treg细胞和效应性T细胞膜表面的表达水平存在明显差异,Treg细胞以表达CTLA4为主.Treg细胞对共培养体系混合淋巴细胞反应的抑制效率明显高于分隔培养,通过分泌IL-10对效应性T细胞的抑制作用亦明显强于通过TGF-β1.结论细胞接触机制是Treg细胞抑制效应性T细胞的主要作用机制,而细胞因子机制中,以通过分泌IL-10的方式对效应性T细胞的抑制作用更明显.     

转化生长因子在FK506肾毒性机制中的作用

目的探讨转化生长因子(TGF-β)在FK506肾毒性机制中的作用.方法体外培养肾小管细胞株,细胞增殖以3H-thymidine掺入法测定.培养液中TGF-β含量用ELISA法测定.结果①FK506以浓度依赖方式抑制肾小管细胞的增殖,当FK506浓度为0.01μmol/L和10μmol/L时,细胞增殖分别为对照组的95%±7%和20%±3%;②FK506促进肾小管细胞产生TGF-β;当FK506浓度为0、1、5μmol/L时,TGF-β含量分别为(488.03±46.70)ng/L、(702.16±46.83)ng/L、(677.73±24.15)ng/L;③外源性TGF-β也以浓度依赖方式抑制肾小管细胞的增殖,在5μg/L时达最大抑制,为对照组的32%±2%.结论促进肾小管细胞TGF-β的过度产生是FK506的肾毒性作用机制之一.     

慢性乙型肝炎患者外周血Treg细胞对DC细胞的抑制作用

目的 检测慢性乙型肝炎患者外周血中Treg细胞的比例,并探讨其对DC细胞的免疫抑制作用.方法 抽取慢性乙型肝炎(CHB)患者和正常对照组的外周血,流式细胞术检测CD4+CD25+Treg细胞的比例以及DC细胞表面CD80和人白细胞(位点)DR抗原(HLA-DR)的表达;在DC培养的不同时间内加入不同比例CHB患者的Treg细胞,检测DC对淋巴细胞增殖功能的影响;检测DC培养的不同时间内加入不同比例CHB患者的Treg细胞后培养上清中细胞因子白细胞介素-10(IL-10)和肿瘤转化因子-β(TGF-β)的表达.结果 正常人外周血中Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞的比例为(4.12±1.36)％,CHB患者外周血中Treg细胞的比例为(10.54±3.27)％,CHB患者外周血中的Treg细胞比例明显高于正常组,差异有统计学意义;CHB患者表面分子CD80的表达为(60.12±5.23)％,HLA-DR的表达为(61.21±4.28)％;而正常组的CD80的表达为(84.13±4.33)％,HLA-DR的表达为(86.57±3.82)％,CHB患者DC细胞表面分子CD80和HLA-DR的表达均显著低于正常组,差异有统计学意义;经Treg细胞处理后,DC细胞刺激淋巴细胞的增殖能力下降,淋巴细胞增殖的抑制率较正常组均显著升高;Treg细胞与DC细胞比例为1∶1、1∶10以及1∶100时,IL-10和TGF-β的表达均显著高于正常组,并且随着Treg细胞的比例增高,细胞因子的水平也相应增高,差异有统计学意义.结论 CHB患者外周血中Treg细胞比例增高,可能是通过诱导IL-10和TGF-β的表达抑制DC细胞的免疫功能.     

舌鳞癌患者外周血Th17细胞及其细胞因子变化的临床意义

目的 探讨舌鳞癌患者外周血辅助性T细胞17(Th17)及其细胞因子变化的临床意义.方法 以该院2013年1月至2016年1月收治的66例舌鳞癌患者为研究对象,同期行健康体检的42例志愿者为对照.采集所有研究对象外周血,流式细胞术检测外周血Th17细胞比例,ELISA法检测白细胞介素(IL)-17、转化生长因子-β(TGF-β)和IL-6因子水平.结果 观察组和对照组外周血Th17细胞比例、IL-17、TGF-β、IL-6分别为(1.46±0.41)%、(0.31±0.12)%,(123.36±21.20)pg/mL、(20.76±8.95)pg/mL,(215.80±21.52)pg/mL、(26.90±10.41)pg/mL,(17.32±8.02)pg/mL、(5.85±1.49)pg/mL,差异有统计学意义(P<0.05).Th17细胞比例、IL-17、TGF-β和IL-6水平随着舌鳞癌临床分期的增加而升高(P<0.01).TGF-β与IL-17水平呈正相关(r=0.626,P=0.021),IL-6水平与Th17细胞比例和IL-17均呈正相关(r=0.626、0.597,P=0.021、0.034).结论 Th17细胞和IL-17表达的增加在舌鳞癌的发生、发展中发挥着重要作用,Th17细胞和IL-17因子可成为抗肿瘤治疗的重要靶点.     

急性胰腺炎大鼠血中抗炎症细胞因子的变化和生长抑素的调节作用

目的探讨实验性急性胰腺炎大鼠血中抗炎症细胞因子IL-10和TGF-β1的变化及生长抑素对其的调节作用.方法实验用SD大鼠随机分为正常对照组6只;胰腺炎组10只,采用开腹胰管注射5%牛黄胆酸钠(1.0-ml*kg-1)诱导急性胰腺炎,不治疗;生长抑素治疗组10只,胰腺炎诱导成功后0.5-h静脉注射施他宁20-μg*kg-1.胰腺炎组和生长抑素治疗组动物在术后2-h(n=6)、6-h(n=6)和24-h(n=8)处死,抽血,用ELISA法检测血中IL-10和TGF-β1及血淀粉酶含量,称胰腺湿重.结果对照组动物血IL-10浓度为(32.05±14.87)ng*L-1,TGF-β1浓度为(66.4±13.20)ng*L-1.胰腺炎组24-h后血IL-10和TGF-β1含量均显著升高(P<0.05),分别为(68.13±19.90)ng*L-1和(103.77±28.95)ng*L-1.生长抑素治疗组24-h血IL-10和TGF-β1浓度分别为(42.20±14.55)ng*L-1和(45.98±18.10)ng*L-1,明显低于胰腺炎组(P<0.05).结论急性胰腺炎时血中抗炎症细胞因子升高,并可能和胰腺炎后期的免疫抑制效应有关.生长抑素对抗炎症细胞因子的升高有抑制作用.     

肝癌切除术对肝癌患者外周血CD4+CD25+T调节细胞的影响

目的:探讨肝癌切除术对肝癌患者外周血CD4+CD25+T调节细胞(Treg)的影响及临床意义?方法:42例原发性肝癌患者均行肝癌切除术,采用流式细胞术检测患者手术前及术后1个月外周血中Treg占单个核细胞(PBM)的比例,同样的方法检测肝癌组织和正常肝组织中Treg占单个核细胞的比例;采用ELISA检测肝癌组织和正常肝组织中转化生长因子-β(TGF-β),白介素-10(IL-10)的水平?结果:肝癌患者外周血及肝癌组织中Treg比例明显高于对照组 (13.98±3.03)% vs (8.23±2.15)%,(17.74±4.12)% vs (6.98±2.36)%,P均 < 0.05,且Ⅲ~Ⅳ期患者外周血中Treg比例显著高于Ⅰ~Ⅱ期患者?肝癌切除术后1个月外周血Treg较术前明显减少(13.98±3.03)% vs (9.87±2.78)%,P < 0.05?肿瘤组织中TGF-β?IL-10的水平明显高于正常肝组织(P < 0.05)?结论:肝癌患者外周血Treg水平明显升高,且与TNM分期呈正相关?肝癌切除术能明显降低外周血Treg比例,这可能与手术切除肿瘤微环境中高水平Treg?TGF-β?IL-10有关?     

首发精神分裂症患者调节性T细胞及相关细胞因子变化

目的 探讨首发精神分裂症患者调节性T细胞及细胞因子变化及与精神症状的关系。方法 采用流式细胞仪技术检测27例首发精神分裂症患者和27例健康体检者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg）占CD4+T细胞的百分率,酶联免疫吸附试验检测血清IL-10及TGF-β1水平,采用阳性与阴性症状量表（PANSS）评定精神分裂症患者精神症状。Treg细胞、TGF-β1与年龄、病程、教育年限和精神症状以及细胞因子的相关性采用Spearman相关分析。结果首发精神分裂症患者Treg细胞百分率为（0.03±0.01）%,明显低于对照组（0.04±0.02）%（t=-3.681,P=0.001）;首发精神分裂症患者血清TGF-β1[（1.40±1.16）pg/ml]水平明显高于对照组[（0.75±0.81）pg/ml]（t=2.376,P=0.021）,但IL-10水平在精神分裂症组[（0.12±0.25）pg/ml]和对照组[（0.12±0.26）pg/ml]间比较差异无统计学意义（t=0.432,P=0.668）。首发精神分裂症患者的Treg百分率与教育年限呈正相关（r=0.452,P=0.018）,与年龄、病程和精神症状无相关性;TGF-β1与年龄、病程、教育年限和精神症状之间均无相关性。首发精神分裂症患者的Treg细胞百分率与IL-10、TGF-β1间均无相关性。结论首发精神分裂症存在免疫抑制机制受损,Treg及TGF-β1可能在首发精神分裂症患者免疫失衡的病理生理机制发挥着重要的作用。     

人胚腱细胞转化生长因子-β受体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ密度分析

目的 观察转化生长因子-β受体I 、II和III （TβRI 、II 、III）在体外培养的肌腱细胞中的表达情况,探讨TGF-β1对细胞周期及增殖指数PI值的影响。方法 采用免疫组化法鉴定受体的表达,流式细胞仪法分析了同一细胞周期不同亚时相的TβRI 、II 、III受体数目差别并观察了不同浓度的TGF-β1对细胞周期及增殖指数PI值(S+G2M)的影响。结果 TβRI 、II 、III在体外培养的肌腱细胞中均有表达,TβR I 、II 、III平均荧光强度在G1期分别是7.93±0.20、8.76±0.16、8.46±0.14,而在G2M期分别是17.7±0.36、18.9±0.35、18.3±0.67。细胞周期分析表明：TGF-β1作用下,G0/G1%呈降低趋势,而S%呈升高趋势,反映细胞增殖活力的PI值也呈升高趋势,尤以5 ng/ml 以上浓度时为显著(P<0.05)。结论 在肌腱细胞周期的不同亚时相,肌腱细胞TβRI 、II 、III各自密度均具显著差别（P<0.01）,TGF-β1能促进腱细胞增殖。TGF-β受体系统不同亚时相的差别可能是其调控细胞增殖活动的生物学基础。     

耐受型DC/TGF-β联合诱导的iTreg细胞能有效抑制自身免疫性关节炎

目的 初步探讨通过成熟耐受型DC(mtDC)与转化生长因子-β(TGF-β)联合诱导的诱导型调节性T细胞(iTreg细胞)对自身免疫性关节炎的抑制作用.方法 在体外,对CD4+CD25-T细胞进行TGF-β诱导和mtDC细胞扩增,获得iTregmtDC细胞.通过流式细胞术、细胞计数、CBA等方法检测iTregmtDC细胞的表型、对CD4+T效应细胞增殖的抑制作用.在体内实验中,iTregmtDC细胞以1×106个细胞/ml的剂量过继性输注入胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠体内,并通过关节病变评分、病理组织病变评分、血清中细胞因子、总anti-CⅡIgG的分泌情况来评价iTregmtDC细胞对CIA的抑制作用.结果 在体外,通过TGF-β 和mtDC细胞两轮诱导/扩增后,TregmtDC细胞得以大量扩增,并能持续表达高水平的Foxp3.在体外,与iTreg细胞相比,TregmtDC细胞有更强的抑制效应T细胞增殖的能力.在体内,与iTreg细胞相比,TregmtDC细胞的过继性输注能更有效地减少发病关节处的炎性浸润,进一步改善CIA的症状;对CIA小鼠体内细胞因子的分泌有更强的调节能力,能更显著地减少炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-17(IL-17)的分泌,并促进大量TGF-β产生;更明显地降低总anti-CⅡIgG的分泌量;进而更有效地抑制CIA病程的发展.结论 与iTreg相比,iTregmtDC细胞能通过调节体内细胞因子和抗CⅡIgG的分泌更有效地抑制CIA病程发展.     

Direct protective effect of interleukin-10 on articular chondrocytes in vitro

Objective To assess whether interleukin-10 (IL-10) is chondroprotective in vitro.Methods Chondrocytes were isolated from femoral cartilage of rats (7-10 days) by digesti on with collagenase Ⅱ.The first passage cells were grown in 24- well plates with DMEM, supplemented with 10% fetal bovine serum, for 2-4 days.The ce lls were then cultured in 0.1% fetal bovine serum DMEM medium, and given respec tively interleu kin-1 (IL-1) 100 μ/ml, IL-1 100 μ/ml+recombinant murine interleukin-10 ( rmIL-10) 20 ng/ml, rmIL-10 20 ng/ml, and cultured for 48 hours.Scanning el ectron morphology and immunohistochemical study of nitric oxide synthase 2 and matric metalloproteinase 3 mRNA in situ hybridization were performe d.Cell proliferation and morphology were observed under inverted microscope fr om the beginning of cell culture for three weeks.Results IL-1 stimulated granule production in the cytoplasma of chondrocytes, and the c ells died in the second and third weeks of culture.IL-10 antagonized IL-1, p rotected the cells from death and maintained chondrocyte proliferation.Scannin g electron morphology showed that IL-1 stimulated the formation of numerous mic rovilli on the cell surface, while thin and less numerous microvilli were found in cultures with IL-10.Immunohistochemical study and in situ hybridization sh owed that IL-10 inhibited NOS2 and MMP3 expression.Conclusion IL-10 not only inhibits the synthesis of inflammatory cytokines, but also direc tly protects chondrocytes by antagonizing IL-1.     

Brahma相关基因1在脂多糖诱导的急性肝炎中的作用

目的  观察Brahma相关基因1（BRG1）在脂多糖（LPS）诱导的急性肝炎中的表达变化,并观察干预BRG1表达对炎症因子分泌的影响。方法  体内实验,腹腔注射LPS（2.5 mg/kg）构建小鼠肝炎模型,通过免疫组织化学及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测BRG1的表达变化;体外实验,在人肝细胞HepG2及HepaRG培养基中加入LPS（100 ng/ml）,Western blot检测BRG1的表达变化,转染BRG1质粒或特异性siRNA,通过ELISA检测白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）等促炎因子的分泌。结果  体内实验,腹腔注射LPS（2.5 mg/kg）可以显著诱导小鼠的肝细胞坏死,肝细胞核浓聚,肝小叶组织结构破坏及ALT、AST的水平明显升高;同时LPS处理后肝细胞中的BRG1表达上升,BRG1在细胞核中浓聚。体外实验,LPS（100 ng/ml）处理后的HepG2及HepaRG细胞中BRG1的表达升高。同时BRG1过表达可显著促进促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的释放,相反BRG1沉默后可显著抑制促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α的释放。结论  LPS可促进小鼠肝脏中及体外培养肝细胞的BRG1蛋白表达,干预BRG1表达可影响细胞释放IL-1、IL-6及TNF-α的能力。

     

Effect and Mechanism of Epidermal Growth Factor on Proliferation of GL15 Gliomas Cell Line

The effects of epidermal growth factor (EGF) on proliferation of G15 glioma cells and the possible mechanisms were investigated. GFAP and EGFR expression was detected by immunohisto-chemical method. After the cells were treated with EGF at different concentrations, cell count method was used to determine the proliferation of glioma cells, cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry (FCM), and laser scan confocal microscope (LSCM) was used to measure the cyto-plasmic free calcium. The results showed that GFAP was diffusedly expressed in GL15 cells and EGFR was over-expressed. EGF at doses of≤1 ng/mL could significantly stimulate cell proliferation, cells in phase G0/G1 decreased, and those in phase S increased. EGF at doses of 10 and 100ng/ml could inhibit the cell proliferation significantly, and the apoptosis ratio in high dose of EGF group was higher than in control group. EGF could significantly induce a quick rise of intracellular free calcium, but the peak value of intracellular free calcium activated by high dose of EGF was higher than by low dose of EGF. It was suggested that EGF had a dual effect on gliomas: low dose of EGF could stimulate the cell proliferation of gliomas, but high dose of EGF could induce the cell apoptosis and inhibit the proliferation of gliomas, which might be contributed to the difference of intracellular free calcium.     

IL-13对正常人表皮成纤维细胞产生炎症因子作用的实验研究

目的探讨白介素-13（IL-13）对正常人表皮成纤维细胞（NHDF）产生炎症因子的影响。方法使用不同浓度IL-13（0.1、1、10ng/ml）刺激体外培养的NHDF,应用ELISA方法检测IL-13刺激NHDF24h后,白介素-6（IL-6）,白介素-8（IL-8）,巨噬细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）的蛋白表达水平。结果0.1ng/mlIL-13刺激下,IL-6、MCP-1和Eotaxin的蛋白表达水平分别为（727.33±39.88）pg/ml、（414.67±13.01）pg/ml、（124.67±8.67）pg/ml;1ng/mlIL-13刺激下,分别为（1222.50±49.95）pg/ml、（705.33±25.15）pg/ml、（205.33±16.59）pg/ml;10ng/mlIL-13刺激下,分别为（1502.83±5.31）pg/ml、（1329.17±56.08）pg/ml、（457.50±15.32）pg/ml,均明显高于对照组[（283.50±15.86）pg/ml、（205.17±3.76）pg/ml、（13.50±5.01）pg/ml,P〈0.05或0.01],并具有浓度依赖性。IL-8蛋白表达水平与对照组无显著性差异（P〉0.05）。结论IL-13可刺激NHDF产生IL-6、MCP-1和Eotaxin,这些炎症因子的大量表达可能参与了IL-13在皮肤组织纤维化过程中的病理性作用。     

白介素-1β对原代培养海马神经元毒性的研究

目的 探讨IL-β对体外培养的海马神经元活性及合成和分泌脑源性神经营养因子(BDNF)的影响.方法 采用SD新生鼠进行海马神经元原代培养.培养7d的细胞以细胞免疫化学法枪测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达,计算阳性细胞率.实验分IL-β为0ng/ml的正常组和IL-β为5 ng/ml、10ng/ml、20ng/ml 3个实验组,进行海马神经元无血清培养48 h.采用甲基噻唑基四唑(MTT)试验检测细胞活性,ELISA法检测培养上清BDNF的含量.结果 NSE细胞免疫化学鉴定显示阳性细胞达到90%以上;IL-1β降低体外培养的海马神经元活性,各剂量组按浓度在590nm波长处检测OD值为(0.5585±0.2407; 0.4295±0.1401; 0.4191±0.1050),与正常组(0.9462±0.2972)比较,差异具有显著性(分别为P<0.05,P<0.01,P<0.01 ANOVA);IL-1β降低体外培养的海马神经元合成和分泌BDNF水平,各剂量组显著BDNF含量分别是[(8.65±0.71)pg/ml,(8.90±0.35)pg/ml,(7.90±0.35)pg/ml],与正常组(12.40±1.77)pg/ml比较差异具有显著性(均P<0.05 ANOVA).结论 IL-1β可导致体外培养海马原代神经元的损伤,其机制可能与海马神经元合成和分泌BDNF的减少有关.     

体外培养扩增CD4+CD25+调节性T细胞的实验观察

目的 观察细胞因子体外培养扩增CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的作用,以便从体外获取大量Treg细胞.方法 将从C57BL/6幼稚小鼠脾脏和淋巴结中提取的Treg与从DBA/2小鼠骨髓中提取的成熟树突细胞(mDC)混合培养,并分别加入白细胞介素-2(IL-2)、IL-4或IL-15,检测Treg增殖和凋亡的情况,与不加入任何细胞因子为对照.分别将培养获得的Treg与C57BL/6幼稚小鼠的效应性T细胞(Teff)混合培养,测定扩增后的Treg对Teff的抑制活性.检测扩增后Treg的Foxp3表达,从而证明培养获得的Treg仍保持其表型.结果 在保持其对Teff抑制活性的同时,IL-2组、IL-4组、IL-15组Treg的增殖细胞前体频率分别为31.3%、28.9%、34.5%,明显高于对照组(14.5%),均P＜0.05;增殖指数分别为1.9、1.7、1.8,明显高于对照组(1.5),均P＜0.05.IL-2组、IL-4组、IL-15组Treg的凋亡细胞比例分别为12.8%、11.4%、12.7%,均明显低于对照组(28.9%),均P＜0.05.扩增后的Treg仍高表达Foxp3(91.75%).结论 IL-4、IL-15和IL-2一样,具有促进Treg增殖、减少其凋亡的作用,并同时保持对Teff的抑制功能.扩增后的Treg仍保持其表型,高表达Foxp3.     

四妙勇安汤的有效成分对血管内皮细胞增殖的影响

目的：研究四妙勇安汤的有效成分对脐静脉内皮细胞（ECV304）增殖的影响,以探讨其促血管新生的可能机制。方法：体外培养ECV304,单体进行干预,利用MTT及BrdU-ELISA法检测其对ECV304增殖的影响。结果：绿原酸10^1ng/ml-10^2ng/ml,阿魏酸10^2ng/ml-10^4ng/ml浓度组为促细胞增殖的优选浓度。结论：绿原酸、阿魏酸促内皮细胞增殖能力与血清有协同作用。