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相似文献
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1.
目的:采用原核表达体系对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)受体型酪氨酸激酶(recep-tor tyrosine kinase,RTK)进行体外表达、纯化及活性鉴定.方法:以包含EGFR cDNA的pRK5质粒为模板,PCR选择扩增编码EGFR-RTK的cDNA片段,插入pQE30质粒后转染大肠杆菌M15.IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体蛋白经复性后亲和层析法纯化,ELISA方法测定蛋白活性.结果:成功地将933 bp的EGFR-RTK cDNA片段插入载体pQE30中,构建了表达载体pQE30-RTK.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为37 000的EGFR-RTK融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的65.2%.复性、纯化后的EGFR-RTK蛋白经ELISA检测,结果发现随着加入蛋白量的增加,酶促反应产物磷酸化酪氨酸的量也逐渐增加,两者具有线性关系.结论:本实验成功地利用原核表达系统表达了具有生物学活性的EGFR-RTK,较传统的昆虫细胞表达系统更为简便、经济.  相似文献   

2.
BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂的分子设计及其生物活性   总被引:1,自引:0,他引:1  
Peng H  Qi J  Huang N  Xie P  Wang JX  Yang CZ 《中国医学科学院学报》2004,26(2):145-149,i004
目的用计算机虚拟筛选法寻找BCR-ABL酪氨酸激酶小分子抑制剂.方法采用ABL酪氨酸激酶催化区在非活化时的独特构象作为受体结合位点,对有机小分子三维结构数据库进行DOCK筛选,寻找先导化合物;用MTT法检测挑选的化合物对细胞增殖的抑制作用;用Western blot和免疫共沉淀方法检测化合物对BCR-ABL表达与活性的影响.结果从DOCK筛选得到能量得分靠前的1 000个化合物中,选择了15个化合物进行生物学测试.体外试验表明,8个化合物对K562细胞有明显的抑制作用(IC50值在10~200μmol/L之间),发现了两种新骨架结构的先导化合物,它们对BCR-ABL活性有明显的抑制作用,但对ABL的表达无影响.结论筛选出对BCR-ABL酪氨酸激酶有明显抑制作用的两个先导化合物.计算机虚拟筛选方法通过对化合物数据库进行"筛选",可以大大提高先导化合物发现的效率,加快新药研究的步伐.  相似文献   

3.
目的 应用荧光共振能量转移(FRET)法检测丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白水解酶(NS3 - 4A)活性,建立HCV蛋白酶抑制剂筛选模型.方法 将质粒pMAL-c2/NS3 - 4A转化到大肠杆菌K12TB1中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析柱纯化得到麦芽糖结合的NS3 - 4A融合蛋白,用FRET法测定蛋白水解酶活性,建立特异性蛋白酶抑制剂筛选模型,优化反应体系,评价模型的可靠性.结果 建立了HCV蛋白酶抑制剂高通量筛选模型,经优化确定了酶及底物用量.在模型可靠性评价中,Z因子高达0.80,变异系数为1.91%.蛋白酶的Km值为4.74 μmol/L,测得已知HCV蛋白酶抑制剂BILN 2061的Ki值为0.30 nmol/L.结论 建立的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂FRET法筛选模型稳定可靠,适用于高通量筛选.  相似文献   

4.
目的:利用酵母模型进行保罗样激酶1(Polo-like kinase 1,PLK1)抑制剂的高通量筛选,并初步评估活性化合物的体外抗肿瘤效果。方法采用噻唑蓝比色法(MTT 法)检测初筛阳性化合物对不同细胞系增生的影响,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析化合物对体外纯化的 PLK1激酶的作用效果,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞周期分布和凋亡率,免疫印迹(Western blotting)检测化合物对周期蛋白 B1(cyclin B1)和 PLK1的作用。结果利用酵母模型初筛得到3个阳性化合物,MTT 法检测显示1号和3号化合物能抑制多种肿瘤细胞的增生而对正常细胞的毒性很小,ELISA 结果显示2号和3号化合物对体外纯化的 PLK1几乎无抑制作用,FCM 检测显示1号化合物处理组 G2/ M 期细胞比例高于对照组, Western blotting 表明1号化合物不影响 PLK1的蛋白表达,能导致 cyclin B1的表达增加。结论1号化合物通过抑制 PLK1激酶的活性发挥抗肿瘤作用而不影响 PLK1的蛋白表达,有望成为靶向 PLK1的抗肿瘤先导化合物。  相似文献   

5.
娄伦美  董志  傅洁民  曾凡新  姜立花 《重庆医学》2012,41(33):3498-3500
目的从8个YN33系列表皮生长因子受体(EGFR)蛋白酪氨酸酶抑制剂中筛选具有抗肿瘤活性的化合物,并进一步评价其在体外的抗肿瘤效果。方法首先采用体外激酶实验对YN33系列化合物进行初步筛选,观察它们对EGFR蛋白酪氨酸酶的抑制作用;采用MTS法观察筛选出的活性化合物在体外对人表皮癌A431细胞株、人胃癌N87细胞株和人乳腺癌BT474细胞株的增殖抑制作用,以及体外筛选出的YN33-5化合物对人正常胚肺成纤维MRC-5细胞增殖的抑制作用。结果激酶实验结果,发现4个具有抑制EGFR活性的化合物:YN33-3,YN33-5,YN33-6,YN33-8。YN33-5对A431、BT474、N87细胞株的半数抑瘤浓度(IC50)分别为:(9.743 3±2.795 9)μmol/L,(4.611 7±2.222 5)nmol/L和(44.048 3±21.793 1)nmol/L,抑制效应呈剂量依赖性。结论 YN33-5具有较好抗肿瘤活性,可抑制多种肿瘤细胞的增殖。  相似文献   

6.
目的 建立一种均相时间分辨荧光免疫分析方法用于蛋白酪氨酸激酶抑制剂的体外高通量筛选.方法 根据铕联穴状化合物(EuK)和异藻蓝蛋白(XL-665)两个荧光化合物在激发后的能量共振转移所发出的特异性荧光,采用多功能酶标仪在波长为612 nm和670 nm处测定荧光信号的变化;以血管内皮生长因子2(VEGFR-2)为蛋白酪氨酸激酶,检测蛋白酪氨酸激酶抑制剂Sunitinib的抑制活性.结果 建立了一种用于蛋白酪氨酸激酶抑制剂体外高通量筛选的均相时间分辨荧光免疫分析方法.在反应体系中,蛋白酪氨酸激酶VEGFR-2、三磷酸腺苷(ATP)和多肽底物浓度分别为5ng/μ1、100 μmol/L和1 μmol/L.在上述条件下,检测到Sunitinib 对 VEGFR-2酪氨酸激酶抑制活性的IC_(50)为86.7nmol/L,与文献报道的结果近似.结论 本实验所建立的均相时间分辨荧光免疫分析方法操作简便,重复性好,可用于蛋白酪氨酸激酶抑制剂的体外高通量筛选.
Abstract:
Objective To establish an in vitro homogeneous time-resolved fluorescence immunoassay method for high throughput screening of protein tyrosine kinase (PTK) inhibitors. Methods Specific fluorescence signals at 670 and 612 nm were measured by multifunctional microplate reader when the fluorescence was emitted through a resonance energy transfer between fluorescent materials (EuK and XL-665). The inhibitory activity of Sunitinib, a standard PTK inhibitor, on vascular endothelia growth factor receptor 2 (VEGFR-2) kinase activity was investigated. Results A homogeneous time-resolved fluorescence immunoassay was established for high throughput screening of PTK inhibitor. In this system, the concentrations of VEGFR-2, adenosine triphosphate (ATP) and poly-peptide substrate were 5 ng/μ1, 100 μmol/L and 1 μmol/L,respectively. Sunitinib inhibited VEGFR-2 kinase activity with an IC_(50) value of 86.7 nmol/L, which was close to the values tested using other methods. Conclusion The homogeneous time-resolved fluorescence immunoassay we established can be easily used for high throughput screening of PTK inhibitors.  相似文献   

7.
目的:探讨胃癌表皮生长因子受体(EGFR)免疫组织化学表达与EGFR基因突变的关系及其临床意义。方法:对105例手术切除的胃癌组织应用免疫组化方法检测EGFR蛋白表达,聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测EGFR基因突变的情况,分析EGFR蛋白表达与EGFR基因突变间的相关性。结果:免疫组织化学检测结果显示,105例胃癌中49例EGFR阳性表达,表达率为46.67%;而发生EGFR基因突变的仅3例,突变率为2.86%。EGFR蛋白表达与其基因的突变无相关性(P>0.05)。结论:EGFR的蛋白表达与其基因突变无相关性,EGFR基因突变可能不是蛋白表达增高的主要机制,不能作为筛选EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗胃癌的生物学指标。  相似文献   

8.
目的 建立适用于高通量筛选的黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)抑制剂筛选模型,并以此模型进行XO抑制剂筛选.方法 建立XO活性的紫外检测法及其抑制剂体外高通量筛选模型,并用此筛选模型对71 760化合物与粗提物进行筛选.结果 通过对筛选条件优化,建立了可靠的筛选模型,并对71 760样品进行了初筛,发现27个活性化合物,命中率O.038%,其中17个有较好量-效关系.结论 建立了稳定灵敏的适用于高通量筛选的XO抑制剂体外筛选模型,并发现了一些具有较好活性的化合物.  相似文献   

9.
HER2是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,它的过表达与肿瘤形成、恶性程度及预后密切相关.根据HER2的结构及其介导的信号转导途径,已研制开发出一系列HER2受体抑制剂.抗HER2抗体通过加速受体内化,阻止HER2与其他表皮生长因子受体(EGFR)家族成员形成异二聚体来阻断HER2的功能;一系列喹唑啉类小分子化合物能共价结合EGFR和HER2的ATP结合位点,阻断受体酪氨酸激酶活性;多瘤病毒增强子激活因子3(PEA3)和人腺病毒5型早期区1A(E1A)蛋白在转录或翻译水平下调HER2的表达;细胞内表达的68和100ku HER2-胞外区结构域能干扰HER2异二聚体的形成及其信号转导.  相似文献   

10.
目的 探索鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)调控β淀粉样蛋白前体(amyloid beta A4 protein,APP)的信号通路及其临床意义.方法 采用转化生长因子(transforming growth factors-α,TGF-α)诱导CNE2细胞24 h作为研究模型,分别采用EGFR酪氨酸激酶的选择性小分子抑制剂PD153035,MAPK抑制剂PD98059,PI3K抑制剂Wortmannin处理2 h再用TGF-α作用24 h作为实验组,Western blot检测阻断剂APP蛋白的表达和分泌变化情况.免疫组化检测EGFR和APP蛋白在NPC与慢性鼻咽炎症上皮组织中的表达差异.结果 PD153035+TGF-α组APP蛋白表达与分泌有所下调,wortmannin+TGF-α组APP蛋白下调明显,PD98059+TGF-α组APP表达无明显变化.EGFR和APP在NPC组织中的表达高于鼻咽炎症上皮组织,且差异有统计学意义(P<0.05).结论 NPC中APP蛋白主要受EGFR信号通路中的PI3K调控,EGFR和APP与NPC的发生有关.  相似文献   

11.
OBJECTIVE: To express a bioactive fusion protein comprising rat soluble transforming growth factor beta type II receptor and interferon gamma(rsTGFbetaR II-IFN gamma) in mammalian cells. METHODS: mRNA was extracted from rat liver and the sTGFbetaR II-IFN gamma genes amplified by RT-PCR, then the two gene segments were cloned into the same pSecTag2A expression vector, and pSecTag2A/rsTGFbetaR II-IFN gamma recombinant plasmid was obtained, which was later transfected into CHO cells using liposomes. The expression of pSecTag2A/rsTGFbetaR II-IFN gamma in the supernatant was detected by ELISA and Western blotting. The bioactivities of the fusion protein were tested by sTGF betaR II-IFN gamma and IFN gamma bioassays. RESULTS: pSecTag2A/rsTGFbetaR II-IFN gamma transfectants expressed rsTGF betaR II-IFN gamma fusion protein. The purified fusion protein exhibited anti-viral activity and antagonized the proliferation-inhibitive effect of TGFbeta1 on CCL-64 cells. It inhibits the HSC activation in vitro. CONCLUSION: The pSecTag2A/rsTGFbetaR II-IFN gamma recombinant plasmid constructed in this study can express bioactive rsTGFbetaR II-IFN gamma fusion protein.  相似文献   

12.
丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-a基因的克隆和表达   总被引:3,自引:3,他引:0  
目的:从丝瓜籽中克隆HIV整合酶抑制剂luffin-a基因,并构建其表达载体.方法:根据报道的cDNA序列,用RT-PCR的方法从未成熟的丝瓜籽中克隆luffin-a基因,T-A克隆后鉴定核苷酸序列.构建表达载体pET-44a( )-luffin-a,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达.用透析法对包含体复性;SDS-PAGE鉴定luffin-a表达产物,用MTT法分析其生物学活性.结果:克隆的luffin-a基因与国外报道的核苷酸序列同源性为99.73%,其所编码的氨基酸序列完全一致.经SDS-PAGE分析:luffin-a主要存在于包含体中.MTT法测定:复性后蛋白具有与蓖麻毒素A链相似的细胞毒性.结论:本研究成功地构建了luffin-a的表达系统,所表达蛋白经复性后具有生物学活性.  相似文献   

13.
目的:构建人L-ficolin基因的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:用PCR方法从质粒pCDNA3-L-ficolin中扩增L-ficolin cDNA片断,并将该片断插入pGEX-KG原核表达载体中,以进行插入基因的融合表达,表达后再用Thrombin切除GST以得到单纯的L-ficolin蛋白,SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定,并以细菌侵袭试验检测所得蛋白的生物学活性。结果:酶切结果证实,成功地构建了pGEX-KG-L-ficolin原核表达载体,并使之在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的分子质量(Mr)与预期值相一致。原核表达的L-ficolin蛋白具有调理吞噬作用,促进吞噬细胞吞噬细菌的能力,L-ficolin调理吞噬能力呈剂量依赖关系,并显著高于对照蛋白。结论:成功地构建了重组表达载体pGEX-KG-L-ficolin,经过Thrombin作用后得到的L-ficolin蛋白具有生物学活性,为进一步研究人L-ficolin的功能奠定了基础。  相似文献   

14.
目的:克隆人Canstatin cDNA,在E.coli中融合表达和纯化,并测定表达产物抑制新生血管生成活性.方法:从中国人胎盘组织提取总RNA,RT-PCR扩增出Canstatin cDNA,克隆入pTYB1载体中并测序,构建原核表达载体pTYB1-hCAN,IPTG诱导表达,几丁质亲和纯化,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验进行活性测定.结果:RT-PCR产物约为700bp,测序结果与文献报道序列一致.构建了人Canstatin原核表达载体vTYB1-hCAN,在大肠杆菌中表达.纯化的融合蛋白在CAM实验中能明显抑制血管生成.结论:克隆、表达了具有生物学活性的人canstatin蛋白.  相似文献   

15.
目的:构建一个能在MC3T3-E1细胞中稳定表达,并具有生物学活性的VEGF165和VEGF121基因表达载体。方法:采用RT—PCR技术从HL-60细胞中扩增人VEGF165和VEGF121基因,将获得的基因定向插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒中,测序正确后用脂质体将表达质粒转染入MC3T3-E1细胞。细胞经G418加压有限稀释筛选,采用ELISA法、Western blot法及免疫荧光法检测VEGF蛋白表达,并用MTT法检测表达的蛋白对血管内皮细胞株(HUECV304)的增殖活性影响。结果:通过基因测序表明获得的yEGF165和VEGF121与GeneBank登录的序列一致,构建的质粒分别为VEGF165/pcDNA3.1(+)质粒和VEGF121/pcDNA3.1(+)质粒,ELISA及Western blot检测结果均表明VEGF165和VEGF121基因转染MC3T3-E1后能在细胞中稳定表达,表达产物能明显促进HUECV304细胞生长。结论:基因转染的MC3T3-E1细胞能稳定、高效表达具有生物学活性的VEGF165和VEGF121重组蛋白。  相似文献   

16.
Ad-VEGI151对人脐静脉内皮细胞增殖的影响   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体的血管内皮细胞生长抑制因子基因(VEGI151)对静脉内皮细胞的增殖抑制作用.方法:利用腺病毒载体pCA13构建携带VEGI151基因的质粒,经293A细胞包装、扩增,Western印迹法检测病变细胞内基因的蛋白质表达.X-gal染色测定重组腺病毒载体系统的基因转移效率,结晶紫染色法检测细胞D570/630值,观察Ad-VEGI151对ECV304细胞增殖抑制作用的效果,免疫组织化学检测ECV304细胞内VEGI151基因的蛋白质表达.结果:应用细胞内质粒DNA同源重组法,将脂质体介导质粒pCA13-VEGI151与pJM17共转染293A细胞制备重组腺病毒,所获病毒滴度高,是一种制备重组腺病毒切实可行的方法.Ad-VEGI151在病变细胞内能成功表达蛋白,具有较高的基因转移效率,对静脉内皮细胞的增殖具有强烈的抑制作用,并能在靶细胞内表达有生物学活性的蛋白质.结论:以复制缺陷型重组腺病毒为载体的VEGI151基因能在靶细胞内表达具有生物学活性的蛋白质,抑制体外静脉内皮细胞的增殖,这为进一步肿瘤及新生血管性疾病的基因治疗提供了新的方法.  相似文献   

17.
目的:研究乳蛋白活性肽对小白鼠脂质过氧化的影响。方法:将30只健康成年昆明种小鼠随机分为3组。A:对照组,B:过氧化油组,C:乳蛋白活性肽组。A组用蒸馏水0.3 ml/d灌胃,B组用过氧化油和蒸馏水按1∶1比例0.3 ml/d灌胃,C组用乳蛋白活性肽与过氧化油按1∶1混合后0.3 ml/d灌胃。测定血清SOD活力、MDA含量及肝脏中脂褐质含量。结果:乳蛋白活性肽组MDA含量、脂褐质含量低于过氧化油组(P<0.05),SOD活力高于过氧化油组(P<0.05)。结论:乳蛋白活性肽可提高小白鼠血清SOD活力,降低血清MDA及肝脏脂褐质含量,具有一定的抗脂质过氧化作用。  相似文献   

18.
人ICOS-Ig融合蛋白的真核表达及其生物学活性   总被引:1,自引:0,他引:1       下载免费PDF全文
目的:真核表达人ICOS胞外区与IgG Fc融合蛋白,并对其生物学活性进行初步分析。方法:以RT-PCR方法克隆人ICOS胞外区片段和人IgG Fc片段,定向插入真核表达载体pSecTag2,构建重组质粒pSecTag2-ICOS-Ig,脂质体转染CHO细胞,可溶性表达并纯化ICOS-Ig融合蛋白。采用SDS-PAGE、蛋白质印迹、ELISA对融合蛋白进行鉴定,配体结合活性实验和混合淋巴细胞增殖反应实验检测融合蛋白的活性。结果:构建的ICOS-Ig融合蛋白表达载体在CHO细胞中表达ICOS-Ig蛋白。纯化获得的ICOS-Ig可以与配体ICOSL特异性结合,并抑制同种T淋巴细胞增殖反应。结论:成功构建了人ICOS胞外区与人IgG Fc融合蛋白真核表达系统,获得有生物学活性的ICOS-Ig融合蛋白。  相似文献   

19.
目的:构建重组表达载体pED-Tat-PFKMVV,在大肠杆菌中表达并通过纯化以获得重组多肽Tat-PFKMVV? 方法:用PCR的方法扩增出Tat-PFKMVV基因,插入含T7启动子的pED表达载体,构建重组表达载体 pED-Tat-PFKMVV,重组表达载体转化至大肠杆菌并表达,表达产物经洗涤?乙醇沉淀,酸水解和等电点沉淀纯化目的多肽?结果:克隆的Tat-PFKMVV基因与Genbank 对比,二者同源性为100%,酸水解位点正确?大肠杆菌表达的融合蛋白产物AnsB-C-Tat-PFKMVV经SDS-PAGE电泳显示相对分子量为17 000,质谱显示最终纯化产物Tat-PFKMVV蛋白相对分子量为2 659?通过GST-pull down实验证明Tat-PFKMVV蛋白能在体外解开神经元型一氧化氮合酶与肌肉型磷酸果糖激酶的偶联?结论:成功构建了表达AnsB-C-Tat-PFKMVV融合蛋白的原核表达体系,纯化得到了较高纯度的目的多肽Tat-PFKMVV?通过此过程建立了一套简单可行且高效的融合蛋白表达?水解?分离与纯化的方法?  相似文献   

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