人肝癌特异性EB病毒载体—p^EBAF介导hGM—CSF基因的转移及表达

目的：探索人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF)基因在肝癌细胞中特异性表达的新途径。方法：构建p^EBAF/hGM-CSF基因克隆,用脂质体转染法将它分别导入分泌甲胎蛋白（AFP）的肝癌细胞株HepG2和不分泌APF的细胞株SMMC7721,构建两围基因的细胞克隆HepG2/hGM-CSF,SMMC7721/hGM-CSF,用MTT比色法测定细胞上清中hGM-CSF活性。结果：HepG2/hGM-CSF细胞上清hGM-CSF活性平均为46．5ng/ml/10^6/24h,SMMC7721细胞上清中无明显hGM-CSF活性。结：载体p^EBAF介导的hGM-CSF基因能在分泌AFP的肝细胞中获得特异性表达。     

编码hGM-CSF基因的慢病毒包装及表达

目的：构建编码人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)慢病毒载体转染小鼠结肠癌细胞CT26,建立持续高表达hGM-CSF基因的CT26细胞株。方法：采用PCR法获得hGM-CSF DNA片段,插入转移载体L166;用CaCl2法将载体L166－hGM CSF、L205和L311共同转染到慢病毒包装细胞293T中,72h后收集上清液。测定慢病毒的滴度;用ELISA法检测慢病毒感染后的CT26细胞上清液中hGM CSF的表达。结果：通过酶切电泳证实重组转移载体L166-hGM-CSF含有预期的hGM-CSF片段。收集慢病毒转染CT26细胞,滴度达4.69×105IU/ml。ELISA法检测慢病毒转染的CT26细胞上清液中有hGM-CSF的表达超过2个月。终浓度15μg/ml的嘌呤霉素成功筛选出单克隆CT26细胞株。结论：收集的慢病毒能够有效的将其所携带的目的基因导入CT26细胞并使其在细胞中高效持续表达2个月以上。     

转hGM－CSF基因人膀胱癌细胞株的建立及其生物学特性

采用逆转录病毒载体将ｈＧＭ－ＣＳＦ基因导入人膀胱癌细胞株ＢＩＵ－８７细胞中，建立转基因细胞株ＢＩＵ／ＧＭ。经ＰＣＲ－ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ杂交证实ＧＭ－ＣＳＦ基因已整合到ＢＩＵ／ＧＭ细胞基因组中。经流式细胞仪细胞ＤＮＡ周期分析表明，转基因前后ＢＩＵ－８７细胞增殖状态无变化。免疫荧光检测发现ＧＭ－ＣＳＦ基因导入及表达不能促进ＢＩＵ－８７细胞表面ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＤＲ、ＤＱ抗原的表达。转基因细胞经６０Ｇｙ／ｓＸ线灭活后，丧失增殖能力，但能维持一定水平的ＧＭ－ＣＳＦ分泌活性达２周。本文为进行转基因瘤苗的深入研究奠定了初步基础。     

GM-CSF基因修饰的肿瘤疫苗

肿瘤细胞瘤苗是最早的瘤苗形式,至今仍是人们研究的热点。近些年随着基因转染技术的发展,人们在增强用于疫苗的肿瘤细胞免疫原性方面做出了不懈的努力,其中采用了转基因的方式提高肿瘤疫苗的免疫效果。在众多转染细胞因子的瘤苗中,转染粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因的肿瘤疫苗效果相对显著。GM-CSF是一种强烈刺激巨噬细胞和树突细胞等抗原呈递细胞的增殖、分化、活化、成熟和趋化的细胞因子。GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞用放射线灭活后体内注射,可增加局部炎性反应,大量多核细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DC）浸润,促进了肿瘤抗原的呈递,能够诱导强烈的抗肿瘤免疫反应。GM-CSF转导疫苗为GVAX系列肿瘤疫苗,对GVAX肿瘤疫苗进行了大量的I/Ⅱ期临床研究,其中包括黑色素瘤、前列腺癌、非小细胞肺癌（NSCLC）和肾癌。这些临床试验均证实这种方法是十分安全的,并能有效刺激机体产生抗肿瘤免疫反应。     

pIRES2-EGFP-mGM质粒的构建及其在GM-CSF基因修饰性肿瘤疫苗中的应用

目的:构建一个含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因,并能够用于鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)基因修饰性肿瘤疫苗研究的质粒载体。方法:利用常规分子生物学方法设计并构建含有一个mGM-CSF基因和一个EGFP基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-mGM质粒,经EcoR I及BamH I双酶切鉴定并测序。通过脂质体法转染LA795肺癌细胞,用荧光显微镜检测细胞中EGFP的表达,用ELISA法检测细胞中mGM-CSF的表达。结果:构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-mGM,用脂质体法转染LA795肺癌细胞后,经荧光显微镜和ELISA法检测,可见细胞内有EGFP及mGM-CSF的表达。结论:成功地构建真核表达载体pIRES2-EGFP-mGM,并在LA795肺癌细胞中表达,为研究GM-CSF对肿瘤的生物学作用以及GM-CSF在基因修饰性肿瘤疫苗中的应用奠定了基础。     

慢病毒载体介导的TGF-β1基因修饰小鼠未成熟树突状细胞的实验研究

目的探讨慢病毒载体介导的转化生长因子β1(TGF-β1)基因修饰小鼠未成熟树突状细胞(iDCs)的方法。方法体外原代培养小鼠骨髓细胞,经粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导以及抗CD11c抗体包被的免疫磁珠分选获得iDCs,取部分iDCs经肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导为成熟DCs(mDCs),用光学显微镜观察细胞形态,流式细胞术分析细胞的表面分子。将iDCs分为感染组[感染携带绿色荧光蛋白(GFP)与TGF-β1基因的慢病毒颗粒]、感染对照组(感染携带GFP、不携带TGF-β1基因的慢病毒颗粒)及空白对照组(未感染慢病毒颗粒)。采用倒置荧光显微镜及酶联免疫吸附试验(ELISA)对各组iDCs中GFP及TGF-β1的表达进行检测。结果经体外诱导培养及免疫磁珠分选后,获得大量高纯度iDCs,随培养时间延长,iDCs表现出典型的树突状形态;iDCs表面MHCⅡ、CD80及CD86表达水平均明显低于mDCs。感染组iDCs中GFP与TGF-β1蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)。结论携有TGF-β1基因的慢病毒成功感染小鼠iDCs,并使其表达目的蛋白。     

不同刺激因子对树突状细胞未成熟状态影响的实验研究

目的探讨重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)在大鼠体内对树突状细胞(DC)数量及成熟度的影响,为诱导移植免疫耐受提供新途径。方法将Wistar雄性大鼠随机分成3组,对照组,GM-CSF预处理组,G-CSF预处理组。分别在给药的3,5,7,9,11d取脾脏并分离DC。采用流式细胞技术检测DC的数量及未成熟树突状细胞(imDC)及imDC/DC的比值。结果DC数量增长与两组药物刺激时间呈线性关系;两组imDC/DC与刺激时间呈正相关性,其中预处理后的第7d达最大值;两种刺激因子对大鼠体内DC增值的数量不具有统计学差异;两种预处理因素对大鼠体内DC成熟度的表达具有统计学差异。结论GM-CSF或G-CSF在大鼠体内作用时,可增加DC的数量及imDC/DC的比率。提示体内使用G-CSF在促进DC的未成熟状态以及诱导免疫耐受方面可能比GM-CSF更明显。     

重组腺病毒为载体的人GM—CSF基因在不同受体细胞中的表达研究

将携带人ＧＭ－ＣＳＦ基因的重组腺病毒分别感染人外周血 单个核细胞、胃癌、乳腺癌、直肠细胞，并将该基因转染的人胃癌、乳腺癌、直肠癌细胞以３５Ｇｙ剂量辐照处理后，检测上述细胞培养上清中ＧＭ－ＳＣＦ含量。     

靶向树突状细胞的肿瘤疫苗OVA慢病毒载体构建及其体外抗肿瘤效应

目的构建靶向树突状细胞(dendritic cell,DC)的肿瘤疫苗pHR-CMV-EGFP-OVA慢病毒表达载体,并观察肿瘤抗原特异性DC激活T细胞对小鼠Lewis肺癌细胞(lewis lung carcinoma cell,LLC)的抗肿瘤效应,为肺癌的临床治疗提供实验依据。方法以分子克隆方法构建携带模拟肿瘤抗原鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的慢病毒表达载体,经XhoⅠ及XbaⅠ双酶切后电泳和DNA测序验证;应用脂质体法三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,转导LLC,进行单克隆化筛选培养后,经RT-PCR、Western blot检测所获得的OVA稳定表达细胞株中OVA的表达;分离纯化小鼠骨髓DC;用慢病毒感染DC;分离纯化小鼠脾T淋巴细胞;应用MLR和MTT法检测肿瘤抗原负载的DC刺激T淋巴细胞对LLC的杀伤作用。结果 (1)构建的pHR-CMV-EGFP-OVA慢病毒表达载体经酶切后电泳和DNA测序,结果显示载体构建正确;(2)获得了纯化的小鼠骨髓来源的DC;(3)获得了携带肿瘤抗原OVA的LLC和DC;(4)负载肿瘤抗原的DC刺激T淋巴细胞能有效地杀伤负载相同肿瘤抗原的LLC。结论本研究成功地构建了携带肿瘤模拟抗原OVA的慢病毒表达载体pHR-CMV-EGFP-OVA,并成功地转导LLC与DC,获得了稳定表达OVA的肺癌细胞株和携带OVA的DC,基于肿瘤抗原靶向DC的抗肿瘤策略能有效地杀伤LLC,为靶向DC的肺癌免疫治疗提供了体外实验依据。     

基因修饰的树突状细胞融合后的瘤苗抗肿瘤免疫应答的实验研究

目的观察粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因修饰的树突状细胞（ＤＣ）与肿瘤细胞融合后，体内诱导的抗肿瘤免疫应答及对荷瘤小鼠的治疗效果。方法从Ｃ５７ＢＬ／６小鼠脾脏中分离ＤＣ，用重组腺病毒载体进行ＧＭ－ＣＳＦ基因修饰，再与Ｆ１０小鼠黑色素瘤细胞进行融合，通过抗Ｉａ抗体磁珠阳性选择和贴壁培养富集融合细胞。结果经灭活的、由ＧＭ－ＣＳＦ基因修饰的ＤＣ与Ｂ１６．Ｆ１０融合的ＦＤ－ＧＭ能在体内诱导出更强的细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ），抵抗野生型Ｂ１６．Ｆ１０细胞的再次攻击，使经治疗的肺转移荷瘤小鼠的存活期明显延长，肺转移结节显著减少。结论肿瘤细胞与ＧＭ－ＣＳＦ基因修饰的树突状细胞融合后进行体内免疫，能诱导出显著的抗肿瘤免疫反应，可望成为肿瘤基因治疗的新途径。     

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cDNA的克隆及鉴定

目的:克隆人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长cDNA以构建相应腺病毒表达载体。方法:根据人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因序列设计合成可扩增人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cD-NA的特异性引物,用RT-PCR法从骨髓细胞总RNA中扩增人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cDNA,并克隆至pGEM-T载体中,经酶切鉴定后再行序列分析。结果:逆转录多聚酶链反应扩增产物长度与预期的456 bp一致;用M13正、反向引物行荧光测序,证实克隆出的序列与GenBank的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cDNA序列完全一致;人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长cDNA被成功地插入到质粒pGEM-T中。结论:克隆人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长cDNA为构建相应腺病毒表达载体及应用B7-1行肿瘤免疫基因治疗提供了可能性。     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子对正常参考血管重构的影响

目的 观察血管成形术后,病变近端正常参考血管重构的发生以及与病变部位血管重构的关系,并观察了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对血管重构的影响.方法 健康新西兰大白兔28只随机分为GM-CSF组和单纯损伤组.GM-CSF组皮下注射GM-CSF10 μg·kg-1·d-1,单纯损伤组皮下注射同等量生理盐水.7 d后球囊扩张损伤髂动脉.分别于术前、术后4周耳缘静脉采血检测一氧化氮(NO)浓度;4周后提取损伤动脉标本,观察内膜增生情况并测定病理形态学参数.结果 术后4周GM-CSF组N0浓度(98±10)μmol/L高于单纯损伤组(83±12)μLmol/L.单纯损伤组球囊损伤处血管残余管腔面积(LA)小于GM-CSF组[(0.87±0.40)mm2 vs(1.34±0.52)mm2,P＜0.05],损伤处内膜+中膜面积(I+M)大于单纯损伤组[(2.62±0.48)mm2 vs(2.26±0.43)mm2,P＜0.05],两组损伤处外弹力膜环绕面积(EELA)差异无统计学意义[(3.48±0.80)min2 vs(3.60±0.91)mm2,P＞0.05].单纯损伤组参考血管LA小于GM-CSF组[(1.60±0.48)mm2 vs(1.99±0.54)mm2,P＜0.05],两组参考血管I+M无明显差异,LA与I+M之间不存在相关性,而参考血管EELA与LA及I+M之间有明显的相关性(r=0.91,P＜0.001;r=0.685,P＜0.001).两组参考血管LA、EELA与损伤处血管LA、EELA也明显相关(r=0.919,P＜0.001;r=0.909,P＜0.001).结论 血管重构不仅发生在病变血管,同时也发生在近端参考血管.GM-CSF可以促进受损内皮细胞修复,改善负性血管重构.     

糖尿病创面愈合与GM-CSF关系的研究

目的探讨糖尿病创面愈合与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的关系。方法70只C 57B L/6小鼠分为野生小鼠组（对照组,n=35）和糖尿病模型组（DM组,n=35）。腹腔麻醉后在背部中线两侧各制作0.8cm×0.8cm创面。创面动态摄像并于相应时间段取标本,观察创面组织愈合情况,同时计算创面愈合率;EL ISA法测定创面GM-CSF表达。结果创面形成后第3天起,DM组小鼠创面愈合率较对照组明显下降,以创面形成后7 d内变化最为明显;创面形成后第1天,两组小鼠创面GM-CSF表达均明显增高;创面形成后第1天和第3天,对照组小鼠创面GM-CSF表达显著高于DM组。结论GM-CSF的低表达可能与创面愈合早期炎症细胞浸润减少有关。     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子对大鼠甲状腺C细胞数量的影响

目的探讨粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对大鼠甲状腺滤泡旁细胞(又称C细胞)的影响.方法将48只健康SD大鼠随机分为3组,即对照组、小剂量GM-CSF(10μg/kg·d-1)组和大剂量GM-CSF(50 μg/kg·d-1)组,每组16只,雌雄各半.腹腔注射,连续7d,然后用免疫组化S-P法观察大鼠甲状腺C细胞数量.结果小剂量GM-CSF组C细胞平均数(85.97±20.12)个/HP与对照组(93.58±16.67)个/HP之间无统计学意义(P＞0.05),大剂量GM-CSF组C细胞平均数(67.43±13.73)个/HP小于小剂量GM-CSF组(P＜0.05);雄性大鼠免疫反应阳性C细胞平均数(88.88±17.16)个/HP大于雌性大鼠(75.78±20.82)个/HP,P＜0.05.结论GM-CSF对大鼠甲状腺免疫反应阳性C细胞的数量具有负性调节作用.     

小剂量G-CSF联合GM-CSF动员外周血CD34+细胞

目的 探讨小剂量粒单巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员外周血干细胞的效率。方法 20例成人恶性血液病按统计学配对方法等分为2组。非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)患者化疗方案为环磷酰胺2.0 g/d,静脉滴注,第1~2天,足叶乙甙0.2 g/d,静脉滴注,第1~3天;急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者用阿糖胞苷2.0 g/d,静脉滴注,第1~3天,足叶乙甙用法同NHL。当白细胞低于1.0×10⁹/L时研究组10例应用GM-CSF 2.5 μg/d·kg·b.w.联合G-CSF 2.5 μg/d·kg·b.w.;对照组单用G-CSF 5 μg/d·kg·b.w.,全部皮下注射5~6 d。白细胞5.0×10⁹/L以上时应用CS-3000 pluse分离外周血单个核细胞,流式细胞术计数CD34⁺细胞。结果 产品细胞分类计数单个核细胞占95%~99%,在研究组CD34⁺细胞平均采集9.4(8.4~10.2)×10⁶/kg·b.w.,CFU-GM 42.4(21.9~72.8)×10⁴/kg·b.w.,对照组平均采集CD34⁺细胞4.8(4.1~8.3)×10⁶/kg·b.w.,CFU-GM 28.1(7.1~60.2)×10⁴/kg·b.w.,2组差异显著(P<0.05)。副作用2组相似。结论 恶性血液病患者化疗后应用G-CSF联合GM-CSF动员CD34⁺细胞的效果优于单用G-CSF。     

狼疮性肾炎外周血粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体表达的研究

目的:探讨粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-CSFR)在狼疮性肾炎(LN)发病中的意义.方法:运用流式细胞术对32例LN病人、15例正常人的外周血GM-CSFR水平进行测定分析.结果:LN外周血单核细胞GM-CSFR表达水平显著高于正常对照组(P＜0.01);外周血中性粒细胞GM-CSFR表达水平两组差异不显著(P＞0.05).外周血单核细胞GM-CSFR表达水平与蛋白尿程度呈正相关.结论:GM-CSFR与系统性红斑狼疮的发病及LN的肾脏损害密切相关.     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在急性冠脉综合征中的作用

目的 观察急性冠脉综合征（ACS）患者血清粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）水平的变化,并进一步探讨与内皮损伤及血小板活化之间的关系。方法 采用液相竞争放射免疫法检测38例急性冠脉综合征患者（其中不稳定型心绞痛患者20例、急性心肌梗死患者18例）、20例稳定型心绞痛患者及20例正常对照组血清GM—CSF浓度,用酶联免疫双抗体夹心法测定其血浆血管性血友病因子（vWF）及P-选择素含量。结果 ACS患者血清GM—CSF、血浆P-选择素、vWF的水平明显高于稳定型心绞痛患者及正常对照组（P均〈0．01）,急性心肌梗死患者的上述指标亦明显高于不稳定型心绞痛患者（P〈0．01）。ACS患者血清GM—CSF分别与血浆P-选择素、vWF呈正相关（r=0．588及r=0．579;P均〈0．01）。结论 急性冠脉综合征患者血清GM-CSF浓度升高,可能与急性冠脉综合征患者血小板的激活、内皮损伤及血栓形成有关。     

mRNA疫苗冲击树突状细胞诱导抗肿瘤免疫反应的研究

目的：以消化道肿瘤组织mRNA冲击自体DC，诱导特异性免疫应答。方法：20例消化道肿瘤患者外周血分离PBMC(外周血单核细胞)，在IL-4、GM-CSF联合作用下诱导DC，从消化道肿瘤组织中提取mRNA并分别在有脂质体或无脂质体介导下冲击DC，与未经纯化的T细胞混合培养，诱导CTL(细胞毒性T淋巴细胞)。以CTL作为效应细胞，以胃癌细胞系803为靶细胞，LDH释放实验检测杀伤活性。结果：细胞表面标记检测显示诱导前后CD3、CD4、CD14显著下降，CD40、CD86、CD1a、CD83、HLA-DR显著升高，表明IL-4、GM-CSF、联合作用下有效诱导出DC，混合淋巴细胞增殖实验表明该DC具有抗原递呈，刺激淋巴细胞增殖的功能。经脂质体介导的mRNA冲击DC诱导的特异性杀伤反应与未经脂质体介导的mRNA冲击DC诱导的特异性杀伤反应比较，其杀伤率经统计学分析无显著性差异。而二者与单纯经IL-2诱导的未经纯化的T细胞产生的非特异性杀伤比较均有显著性差异。结论：以肿瘤细胞mRNA冲击DC诱导CTL可有效杀伤肿瘤细胞，有可能成为一独特的免疫治疗方法。     

前列腺特异性膜抗原、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子双顺反子DNA疫苗的构建及其免疫活性的测定

目的:构建前列腺特异性膜抗原(PSMA)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)核酸疫苗并测定其免疫活性.方法:应用DNA疫苗载体pIRES构建pIRES-PSMA-mGM-CSF、pIRES-PSMA、pIRES-mGM-CSF重组质粒,酶切鉴定正确后与pIRES空质粒分别免疫C56BL/6小鼠(每组15只),LDH释放试验测定各自免疫后小鼠的特异性细胞毒性T细胞(CTL)杀伤活性.结果:成功构建上述重组质粒;pIRES-PSMA-mGM-CSF免疫后小鼠特异杀伤率最高,pIRES-PSMA、pIRES-mGM-CSF次之,pIRES空质粒最差(P＜0.05),各组杀伤效果以效靶比为101时最高.结论:PSMA及mGM-CSF双顺反子DNA疫苗有望在前列腺癌的基因治疗中发挥积极的作用.