脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵配伍对BEL-7402人肝癌细胞的抑制作用

目的:研究蟾酥中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基和蟾毒灵三种成分单体及配伍对BEL-7402人肝癌细胞的抑制作用。方法:采用MTT法测定蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基单体不同浓度和时间点,三种成分两两配伍以及三种成分配伍对BEL-7402人肝癌细胞增殖的抑制作用。结果:蟾毒灵对BEL-7402人肝癌细胞增殖的抑制作用最强,其次是华蟾酥毒基,脂蟾毒配基的作用最弱;脂蟾毒配基不能增强华蟾酥毒基、蟾毒灵的作用,且有抑制作用的趋势;华蟾酥毒基与蟾毒灵混合使用与单独使用的抑制作用无明显区别。结论:欲发挥三种成分的抗肿瘤作用,应该单独使用,或者华蟾酥毒基与蟾毒灵混合使用。     

脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵不同配伍的镇痛作用比较

目的:研究蟾酥中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基和蟾毒灵三种成分配伍后的镇痛效果,以筛选出三种成分的最佳配伍方式。方法:采用醋酸致小鼠扭体法进行镇痛实验研究。结果:蟾毒灵的镇痛作用最强,其次是华蟾酥毒基,脂蟾毒配基的作用最弱;脂蟾毒配基用量较大时,与华蟾酥毒基配伍表现为相互的抑制作用,用量较小时则为协同作用;脂蟾毒配基与蟾毒灵配伍表现为相互的抑制作用;华蟾酥毒基与蟾毒灵配伍主要表现为蟾毒灵的镇痛作用;三者共同配伍时,未表现出相互间的协同或抑制作用。结论:欲发挥三种成分的镇痛作用,应该单独使用,或者华蟾酥毒基与蟾毒灵混合使用,以保证其安全性、有效性和质量可控性。     

蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基大鼠体内药动学研究

目的 建立检测大鼠血浆中3种蟾蜍甾烯类化合物蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的HPLC法,并用于蟾酥在大鼠体内的药动学研究。方法 分别于大鼠尾iv给予蟾酥提取物0.8 mg/kg后2、5、10、15、20、30、45、60、90 min,眼眶取血,采用乙腈沉淀蛋白与液液萃取相结合方法进行血浆样品预处理,以HPLC法测定大鼠血浆中蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的质量浓度,以Kinetica软件拟合药动学参数。结果 蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基均得到很好的分离,重现性、精密度、线性关系良好,达到体内分析要求;经非房室模型拟合,得到蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基在大鼠体内主要药动学参数;iv给药30 min时,血药浓度均降至C_max的1/5以下。结论 建立的蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基血药浓度测定方法操作简单、结果准确可靠;蟾蜍甾烯类成分在大鼠体内代谢较为迅速,所得数据可为蟾酥提取物的药动学研究提供参考。     

RP -HPLC法同时测定蟾麝救心滴丸中蟾酥华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量

目的建立采用RP—HPLC法同时测定蟾麝救心滴丸中蟾酥华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量的方法。方法采用反相HPLC法测定华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量,C18色谱柱;流动相：乙腈-水,梯度洗脱（0→25min,56：44;26→44min,0：100;45→50min,56：44,V／V）,流速：1．0ml／min,检测波长为296nm,柱温为35℃。结果华蟾酥毒基在0．2118—2．118μg范围内呈现良好的线性关系（r=0．9997）,平均回收率为99．49％,RSD值为1．2％（n=6）;酯蟾毒配基在0．2012—2．012μg范围内,呈现良好的线性关系（r=0．9996）,平均回收率为99．97％,RSD值为1．7％（n=6）。结论RP-HPLC法简便可行、准确、重现性好,可作为蟾麝救心滴丸中蟾酥华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量测定方法。     

华蟾酥毒基诱导人骨肉瘤细胞 U-2OS 凋亡的实验研究

目的：观察华蟾酥毒基对人骨肉瘤细胞 U-2OS 增殖和凋亡的影响,从而探讨华蟾酥毒基诱导骨肉瘤凋亡的可能机制。方法：应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测华蟾酥毒基对人骨肉瘤细胞 U-2OS 增殖的影响;应用流式细胞术检测华蟾酥毒基及华蟾酥毒基联合泛 Caspase 抑制剂 Z-VAD-FMK 对人骨肉瘤细胞 U-2OS 细胞凋亡的影响;应用蛋白质印迹法检测华蟾酥毒基对凋亡通路相关蛋白表达的影响。结果：四甲基偶氮唑蓝比色法实验结果表明,华蟾酥毒基以时间和浓度依赖的方式抑制 U-2OS 细胞生长。流式细胞术结果显示,100 nM华蟾酥毒基干预后,U-2OS 细胞凋亡率为（46．87±11．23）％,但当华蟾酥毒基与泛 Caspase 抑制剂 Z-VAD-FMK 共同干预后,细胞凋亡率仅为（2．34±0．98）％,与空白对照组及华蟾酥毒基联合 Z-VAD-FMK 组相比,华蟾酥毒基能显著提高细胞凋亡率（P ＜0．01）。蛋白质印迹法结果显示,华蟾酥毒基能够显著提高促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8、Cleaved Caspase-9的表达。结论：华蟾酥毒基对人骨肉瘤细胞 U-2OS 的生长有显著抑制作用,并能够促使肿瘤细胞凋亡,其作用机制可能与激活 Caspase 依赖的凋亡途径有关。     

华蟾素实验研究及临床应用概况

<正> 华蟾素(Cinobufotalin)是中华大蟾蜍全皮中提取的水溶性制剂。近年来,国内对华蟾素的实验研究不断深入,其临床应用范围也不断拓展。现就其实验研究及临床应用概况综述如下。 1 实验研究 1.1 化学成分:华蟾素注射液是传统性生物药蟾酥的灭菌水溶性制剂,蟾酥含多种成份:华蟾蜍毒素,华蟾蜍素,华蟾蜍次素,去乙酰华蟾蜍素,蟾蜍配基,椿氨酸,辛二酸等。脂蟾毒配基,蟾毒灵和华蟾毒精是蟾酥的主要毒性和活性成分,通过对中华大蟾蜍皮的化学成份研究,发现其抗癌有效成分有四个蟾蜍毒素:蟾毒灵3—丁二酰精氨酸酯(Ⅱ),蟾毒它灵3—丁二酰精氨酯(Ⅰ),华蟾毒精3—丁二酰精氨酸酯(Ⅲ),脂毒素酯基3—丁二酯精氨酸酯(Ⅳ)。     

华蟾酥毒基诱导人骨肉瘤细胞U-2OS凋亡的实验研究

目的:观察华蟾酥毒基对人骨肉瘤细胞U-2OS增殖和凋亡的影响,从而探讨华蟾酥毒基诱导骨肉瘤凋亡的可能机制。方法:应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测华蟾酥毒基对人骨肉瘤细胞U-2OS增殖的影响;应用流式细胞术检测华蟾酥毒基及华蟾酥毒基联合泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对人骨肉瘤细胞U-2OS细胞凋亡的影响;应用蛋白质印迹法检测华蟾酥毒基对凋亡通路相关蛋白表达的影响。结果:四甲基偶氮唑蓝比色法实验结果表明,华蟾酥毒基以时间和浓度依赖的方式抑制U-2OS细胞生长。流式细胞术结果显示,100 n M华蟾酥毒基干预后,U-2OS细胞凋亡率为(46.87±11.23)%,但当华蟾酥毒基与泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK共同干预后,细胞凋亡率仅为(2.34±0.98)%,与空白对照组及华蟾酥毒基联合Z-VADFMK组相比,华蟾酥毒基能显著提高细胞凋亡率(P0.01)。蛋白质印迹法结果显示,华蟾酥毒基能够显著提高促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8、Cleaved Caspase-9的表达。结论:华蟾酥毒基对人骨肉瘤细胞U-2OS的生长有显著抑制作用,并能够促使肿瘤细胞凋亡,其作用机制可能与激活Caspase依赖的凋亡途径有关。     

华蟾酥毒基抑制人前列腺癌PC3细胞体外增殖研究

目的探讨华蟾酥毒基对人前列腺癌PC3细胞体外增殖和凋亡的影响及其可能存在的作用机制。方法细胞分为不加药对照组,5、50、100、500 nmol/L华蟾酥毒基组,共5组。各组作用于PC3细胞24、48 h后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测华蟾酥毒基对人前列腺癌PC3细胞增殖的影响。不同浓度华蟾酥毒基作用于PC3细胞48 h后,光学显微镜观察PC3细胞形态变化;克隆形成实验检测华蟾酥毒基对前列腺癌PC3细胞克隆形成能力的影响;流式细胞术检测华蟾酥毒基作用48 h后各组PC3细胞凋亡情况;蛋白质印迹法检测华蟾酥毒基对髓样细胞白血病-1(MCL-1)蛋白表达的影响。结果 24 h后华蟾酥毒基可在体外抑制PC3细胞增殖(P 0. 01),48 h后华蟾酥毒基对PC3细胞增殖抑制作用更为明显(P 0. 05),华蟾酥毒基对PC3细胞增殖能力有较好的抑制作用,且呈剂量和时间依赖性。细胞克隆形成实验发现,0. 5 nmol/L华蟾酥毒基即可抑制细胞克隆形成(P 0. 05),并且此种抑制作用与药物浓度呈正相关(P 0. 05)。流式细胞术结果显示,0. 5nmol/L以上华蟾酥毒基均可诱导PC3细胞凋亡,随浓度增加凋亡率显著增加(P 0. 01),50 nmol/L华蟾酥毒基干预48 h后,PC3细胞凋亡率为39. 667%;同时光学显微镜下细胞增殖抑制明显,并呈凋亡形态改变。蛋白质印迹法结果显示,不同浓度华蟾酥毒基均可下调抗凋亡蛋白MCL-1蛋白表达(P 0. 01),以50 nmol/L华蟾酥毒基作用于PC3细胞48 h下调MCL-1蛋白表达更为显著(P0. 01)。结论华蟾酥毒基可抑制前列腺癌PC3细胞的体外增殖,并可诱导肿瘤细胞凋亡,其机制可能与抗凋亡蛋白MCL-1表达下调有关。     

蟾毒灵抗肿瘤信号通路的研究进展

蟾毒灵是从中药蟾酥中提取的单体化合物，具有抗肿瘤的作用。细胞信号传导是细胞通过细胞膜或胞内受体感受信息分子的刺激，经细胞内信号转导系统转换，从而影响细胞生物学功能的过程，信号通路的激活失活可影响下游基因的表达引起细胞的异常增殖，促进肿瘤的生长、侵袭和转移。蟾毒灵可以通过调节多条信号通路影响肿瘤细胞增殖、凋亡、自噬和侵袭转移。     

华蟾素精和羟基华蟾毒精的人肠内细菌代谢研究

目的：研究人肠内细菌对蟾酥中主要成分华蟾毒精和羟基华蟾毒精的代谢。方法：采用体外人肠内细菌粗酶与华蟾毒精和羟基华蟾毒精温孵法;根据波谱学和化学数据鉴定代谢产物的结构;根据原形化合物和代谢产物的体外抑制人癌细胞系（HCT-8、KB、BGC、BIU和HeLa)的生长评价其抗肿瘤活性。结果：华蟾毒精可由人肠内细菌代谢产生去乙酰基华蟾毒精;羟基华蟾毒精可由人肠内细菌代谢产生去乙酰基羟基华蟾毒精;原形化合物具有强抑制人癌细胞生长的活性,而其代谢产物无活性。结论：华蟾毒精和羟基华蟾毒精由肠内细菌代谢而失活。     

蟾酥灵对HL-60/ADR作用的研究

目的 :探讨中药蟾酥灵对HL -60 /ADR耐药细胞在抑制生长、诱导凋亡方面的作用和影响。方法 :①MTT比色法观察对细胞的抑制 ;②流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 :①蟾酥灵抑制HL -60 /ADR耐药细胞的生长 ,药物浓度与HL -60 /ADR细胞生长抑制率之间呈指数关系 ;②随着药物浓度的增加 ,HL -60 /ADR细胞凋亡率也增加。结论 :蟾酥灵可抑制HL -60 /ADR细胞生长 ,促进细胞凋亡呈剂量依赖性     

Anti-tumor effect of bufalin on the orthotopic transplantation tumor model of human hepatocellular carcinoma in nude mice

Objective: To investigate anti-tumor effect of bufalin on the orthotopic transplantation tumor model of human hepatocellular carcinoma in nude mice. Methods: BEL-7402 cells of human hepatocellular carcinoma were inoculated to form subcutaneous tumors in nude mice by subcutaneous injection. Then the subcutaneous tumors were implanted into the liver of nude mice, and the orthotopic transplantation tumor models of human hepatocellular carcinoma were established. Seventy-five models were randomized into 5 groups ( n = 15) . Bufalin was injected intraperitoneally into the 3 groups at dose of 1.5,1 and 0.5 mg/kg for day 15 - 24, respectively. NS group were injected equal volume saline as above and adriamycin were injected intraperitoneally into ADM group at dose of 8.0 mg/kg for day 15. Ten mice in each group were killed at day 25 and detected on morphological and ultrastructural changes in myocardium, brain, liver, kidney and tumor tissues by pathology and electron microscope. The survival time in each group     

蟾毒灵对CAPAN-2胰腺癌细胞增殖和细胞周期的影响

目的 研究蟾毒灵在胰腺癌CAPAN-2细胞系中的抗肿瘤作用,探讨其在胰腺癌中的抗肿瘤分子机制。方法 CCK-8法测定蟾毒灵对人胰腺癌CAPAN-2细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测蟾毒灵对细胞凋亡和细胞周期的影响;Western blotting法检测蟾毒灵作用于CAPAN-2细胞后Caspase-3酶原(pro-caspase-3)、Bcl-2、Bax、CDC25C、cyclinB1、CDC2蛋白表达水平的变化情况。结果 蟾毒灵对胰腺癌CAPAN-2细胞有抑制增殖的作用,并呈现出时间和浓度依赖性;蟾毒灵未能诱导CAPAN-2细胞凋亡,但经蟾毒灵处理后,CAPAN-2细胞周期被阻滞在G2/M期;经蟾毒灵处理后,CAPAN-2细胞中CDC25C、cyclinB1、CDC2等关键周期蛋白的表达量显著下降,但是pro-caspase-3、Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白的表达没有发生明显改变。结论 蟾毒灵可显著抑制胰腺癌CAPAN-2细胞增殖,通过诱导G2/M细胞周期阻滞而非诱导细胞凋亡,在CAPAN-2细胞中发挥抗肿瘤作用。     

蟾蜍灵对食管癌ECA109细胞凋亡的影响及机制探讨

目的 观察蟾蜍灵对食管癌ECA109细胞凋亡的影响并探讨其机制.方法 MTT法检测蟾蜍灵对细胞的增殖抑制作用;流式细胞术分析细胞凋亡情况;Western-Blot法检测凋亡抑制蛋白survivin,caspeas-3蛋白的表达.结果 随着蟾蜍灵浓度及作用时间的增加,细胞存活率逐渐降低(P＜0.05),细胞凋亡率明显增高(P＜0.05);随着药物浓度增加,survivin蛋白表达逐渐下降,同时活化caspase-3.结论 蟾蜍灵可诱导食管癌ECA109细胞凋亡,其机制可能与抑制survivin蛋白和活化caspase-3有关.     

蟾毒灵体外抑制人舌鳞癌Tca8113细胞增殖和促凋亡作用及对Na+/K+-ATP酶的影响

目的 探索蟾毒灵对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、凋亡的影响及可能作用机制.方法 以人舌鳞癌Tca8113细胞为研究对象,MTT法检测10、20、40、80、160 nmol/L浓度蟾毒灵体外抑制Tca8113细胞增殖的活性;检测蟾毒灵干预下肿瘤细胞Na+-K+-ATP酶活性的变化;Western blot发检测Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达.结果 蟾毒灵有抑制Tca8113细胞的活性,且呈剂量-时间依赖性;在蟾毒灵干预下Tca8113细胞Na+-K+-ATP酶收到抑制;Western blot结果显示凋亡相关Bax、caspase-3蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调.结论 蟾毒灵通过抑制细胞膜Na+-K+-ATP酶活性,通过调节Bcl-2凋亡通路的相关蛋白,最终激活caspase-3,诱导人舌鳞癌Tca8113细胞凋亡.     

蟾毒灵对裸鼠人结肠癌血管新生相关VEGFA蛋白表达的影响

目的:通过实验研究观察蟾毒灵对人结肠癌血管新生的作用。方法:CCK-8法检测不同浓度蟾毒灵对人脐静脉内皮细胞增殖的影响;构建裸鼠人结肠癌移植瘤模型,随机分为对照组(0.9%生理盐水)、蟾毒灵组(1.5 mg·kg~(~(-1))·d~(-1)),药物干预4周后,观察各组裸鼠移植瘤瘤体生长情况,Western blot检测瘤体组织中血管内皮生长因子A(VEGFA)的表达。结果:蟾毒灵在2.5~320.0 ng/ml的浓度区间内,其对人脐静脉内皮细胞的生长抑制率为1.67%~95.40%,IC50为20.86 ng/ml,呈剂量依赖性。蟾毒灵组裸鼠移植瘤瘤体明显小于对照组(P0.01),蟾毒灵组瘤体中VEGFA蛋白的表达明显低于对照组(P0.05)。结论:蟾毒灵可抑制血管内皮细胞增殖,抑制裸鼠人结肠癌移植瘤瘤体的生长,其机制可能与下调VEGFA蛋白的表达有关。     

蟾蜍灵对K562细胞凋亡诱导作用及bcl-2基因表达的影响

目的探讨中药蟾酥有效成分蟾蜍灵（bufalin）对人白血病细胞系K562细胞增殖和凋亡及bcl-2基因表达的影响。方法MTT实验测定K562细胞对蟾蜍灵的敏感性;原位缺口末端标记法（TUNEL）观察细胞凋亡率;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂情况;半定量RT—PCR技术检测bcl-2mRNA表达。结果蟾蜍灵对K562细胞生长具有明显的抑制作用,MTT实验显示,蟾蜍灵对K562细胞的IC50值为0．013μmol·L^-1,统计学分析表明差异具有显著性（P〈0．01）;蟾蜍灵可明显诱导K562细胞调亡（P〈0．01）,药物作用6h、12h和24hK562细胞的凋亡率分别为20．36％、34．35％和48．16％;经琼脂糖电泳,蟾蜍灵作用细胞可见到DNA梯形条带;bcl-2mRNA表达3h开始下降,6～12h持续下调,与对照组相比具有显著差异（P〈0．01）。结论蟾蜍灵对K562的增殖抑制作用可能是因为它的凋亡诱导作用,而K562细胞凋亡可能是由于bcl-2基因表达改变。     

蟾蜍灵对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响

目的:探讨蟾蜍灵(bufalin)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)凋亡的影响.方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞.分为对照组、LPS刺激组和蟾蜍灵干预组,应用台盼蓝拒染法检测蟾蜍灵对GMC的细胞毒性作用,应用透射电镜观察系膜细胞超微结构的变化,采用逆转录PCR检测Bax和Bcl-2基因mRNA的表达.Western blot法检测Bax和Bcl-2的蛋白表达.结果:透射电镜观察蟾蜍灵干预组可见凋亡早期形态学改变.逆转录PCR和Western blot结果显示蟾蜍灵组较脂多糖组Bax表达增多,Bcl-2表达减少,差异均具有统计学意义(P＜0.01),蟾蜍灵干预后,Bax较Bcl-2表达过量.结论:蟾蜍灵可能通过调节Bax和Bcl-2的相对表达量而诱导脂多糖作用后肾小球系膜细胞发生凋亡.     

蟾蜍灵诱导人急性淋巴白血病细胞凋亡的实验研究

目的研究蟾蜍灵对人急性淋巴白血病(CEM)细胞的作用。方法台盼蓝拒染法观察蟾蜍灵对细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测蟾蜍灵作用后细胞凋亡情况。结果10~80nmol/L蟾蜍灵于24h开始明显抑制CEM细胞生长(P<0.01)。24,48和72h抑制细胞增殖50%的药物浓度分别为15.13,9.59和6.57nmol/L;20nmol/L,40nmol/L蟾蜍灵作用24h后出现典型的细胞凋亡形态学改变;20nmol/L蟾蜍灵处理12,24和48h凋亡细胞百分率分别为2.46%、17.92%和66.26%;40nmol/L蟾蜍灵处理12,24和48h凋亡细胞百分率分别为5.19%、32.71%和80%以上;凋亡细胞百分率呈剂量和时间依赖性。结论蟾蜍灵以时间、剂量依赖方式抑制CEM细胞生长、诱导凋亡。     

蟾蜍灵增强全反式维甲酸对 NB4细胞的诱导分化作用

目的研究蟾蜍灵与全反式维甲酸(ATRA)联合对急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4细胞的诱导分化作用。方法细胞存活率测定采用锥虫蓝拒染法,诱导分化采用形态学分析、四唑氮蓝(NBT)还原试验及细胞分化抗原CD11b的流式细胞仪解析。结果蟾蜍灵5 nmol/L与ATRA30 nmol/L联合明显诱导NB4细胞向成熟粒细胞分化、联合应用较单独应用ATRA时NBT还原率增加了59.7%及CD11b表达增加了22.4%。结论蟾蜍灵与ATRA联合应用可显著增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用。