纳米粒子介导的BMP-2基因转染对移植血管内膜增生的抑制作用

［摘要］ 目的：研究人骨形态发生蛋白2（BMP-2）基因局部转染后,BMP-2基因蛋白过表达对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的抑制作用,探讨防治移植静脉再狭窄的新途径。方法:以包载BMP-2基因的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的纳米级粒子混合物(BMP-2-PLGA)转染培养的兔VSMC,作为BMP-2-PLGA纳米粒子组,同时设空白PLGA纳米粒子组及对照组,MTT法测定细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期。建立自体静脉移植兔模型,随机分成转基因组、空白载体粒子组及单纯静脉移植对照组,分别于术后3、7、14和28 d取出移植静脉,Verhoeff染色检测血管内膜厚度,Western blotting法检测BMP-2蛋白的表达,免疫组织化学法检测BMP-2及增殖细胞核抗原(PCNA)表达。结果：与对照组比较,BMP-2-PLGA纳米粒子组细胞发生明显的G1期阻滞(P<0.05),细胞增殖抑制率及细胞凋亡率增加(P<0.05)。与空白载体粒子组及单纯静脉移植对照组比较,转基因组兔血管内膜平均厚度明显减少(P<0.05),空白载体粒子组与单纯静脉移植对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白载体粒子组及单纯静脉移植对照组比较,转基因组兔移植静脉组织BMP-2蛋白表达于术后3、7和14 d明显增多(P<0.05),PCNA表达于术后7～28 d明显降低（P<0.01）;空白粒子组与单纯静脉移植对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：BMP-2基因的表达能够有效抑制自体静脉移植后内膜增生及VSMC的增殖,促进体外培养VSMC的凋亡。
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骨形态发生蛋白2基因治疗骨缺损研究进展

因创伤、肿瘤切除等原因造成的骨缺损的治疗一直是临床医师面临的一大难题。自体骨移植或异体骨移植治疗骨缺损仍然是临床上治疗骨缺损的金标准。目前应用骨形态发生蛋白2基因结合骨组织工程的方法治疗修复骨缺损是新的研究热点。骨形态发生蛋白2基因结合人工合成支架、生物可降解支架和自体组织移植是最新的研究解决方法,并取得一定的骨缺损修复效果。     

Ad-BMP-2基因转移诱导兔下颌骨骨膜成骨的实验研究

目的 探讨腺病毒介导的骨形态发生蛋白2(Ad-BMP-2)部基因转移对兔下颌升支外侧骨膜处异位成骨的诱导作用.方法 选用18只成年新西兰大白兔作为实验动物,在一侧下颌升支外侧骨膜处注射0.2mL Ad-BMP-2(共含病毒滴度2×10~9 pfu)为实验组,对侧注射等量的PBS为对照组,术后2、5、10周分别处死6只动物,行大体观察、影像学和组织学检查,观察新骨形成的时间和空间变化特点.结果 Ad-BMP-2局部注射引起一定程度的炎症反应,随时间延长逐渐减弱;第2周,注射区域的细胞开始增生和分化,有较多成纤维细胞样细胞聚集;第5周,类骨基质开始形成,部分区域开始矿化;第10周,有编织骨和髓腔样结构形成.骨化程度在不同个体间存在差异.对照组始终没有新骨形成.结论 一定浓度的Ad-BMP-2可以诱导下颌升支外侧骨膜处的异位骨形成,增加皮质骨的厚度.     

骨形态发生蛋白-2在骨修复中的作用研究进展

骨修复是一个十分复杂的过程，受到多种因素的控制，其中骨生长因子对于局部成骨的重要作用已经实验证实，而骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是诸多因子中唯一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子。在BMPs众多亚型中最重要的并且近年来研究较多的是骨形态发生蛋白-2（BMP-2），本文仅对BMP-2在骨修复过程中的作用研究进展综述如下。     

BMP2真核表达载体的构建

目的 为研究骨缺损的基因治疗提供实验基础,构建人骨形态发生蛋白2真核表达载体.方法 采用双酶切方法克隆载体将骨形态发生蛋白2基因与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建pcDNA3.1-BMP2表达基因载体.结果 通过测序分析证实,成功构建BMP2真核表达载体.结论 成功构建BMP2表达载体.     

BM P-7成熟肽基因克隆及序列测定

目的 克隆人骨形态发生蛋白-7成熟肽基因。方法 根据Genebank人骨形态发生蛋白-7基因序列合成两条引物，从培养的人胎儿软骨细胞中提取mRNA，利用One step RT—PCR技术扩增出人骨形态发生蛋白-7成熟肽的基因序列，将PCR扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5α进行克隆筛选鉴定及测序。结果 琼脂糖凝胶电泳检测RT—PCR产物显示一长约451bp的条带。阳性克隆质粒经双酶切可切出约451bp的片段，DNA测序结果与Genebank中的序列相符。结论 利用RT—PCR技术可成功的从人胎儿软骨细胞中克隆出人BMP-7成熟肽基因。     

mBMP-4真核表达载体的构建及表达

0　引言　骨形态发生蛋白 - 4(BMP- 4)具有诱导成骨潜能细胞向软骨细胞和成骨细胞方向分化并形成新骨的能力 .随着基因转染技术的应用 ,将外源基因转入靶细胞内 ,通过靶细胞表达外源基因而发挥作用成为可能 .本研究的目的是通过基因克隆和 DNA重组技术构建可在真核细胞内表达的 BMP- 4表达载体 ,并观测外源基因在细胞内表达的情况 ,为探索将基因转移技术应用于骨折及骨不连等疾病的治疗奠定一定的实验基础 .1　材料和方法1.1　试剂　质粒 pc DNA3和 p SPT- 18- m BMP- 4均由吕振华博士馈赠 ,Eco R I和 H ind III,T4DNA连接酶、…     

BMP2基因重组慢病毒载体质粒的构建及鉴定

目的构建重组慢病毒载体质粒pLV.EX2d.P/neo-EF1A>BMP-2/T2A/EGFP并进行鉴定。方法从Genbank获得BMP2基因序列,结合载体上的酶切位点需要,设计上下游引物,通过PCR方法扩增目的基因片段,利用Gateway技术BP反应构建pDown-BMP2-T2A-EGFP,并进行阳性克隆测序,应用LR反应把pDown-BMP2-T2A-EGFP重组入慢病毒目的载体质粒pLV.Des2d.P/neo,进行阳性克隆测序。结果获得长度为1 191bp的BMP2目的基因片段,质粒pLV.EX2d.P/neo-EF1A>BMP2/T2A/EGFP经双酶切后凝胶电泳鉴定正确,测序结果与Genbank报道序列一致。结论成功构建重组慢病毒载体质粒pLV.EX2d.P/neo-EF1A>BMP2/T2A/EGFP。     

骨形态发生蛋白治疗骨折和骨缺损的发展及临床疗效

骨折和骨缺损是骨科临床常见病症,在传统治疗方法中存在骨折或骨缺损愈合过程缓慢、骨组织来源不足以及修复后的骨组织力学性能不佳等缺点。在骨形态发生蛋白家族被发现后,学者们对其生理学进行了许多研究,并结合各种载体系统及应用基因治疗技术将其作为新型治疗方法引入临床。本文对骨形态发生蛋白的研究进展、在临床前期及临床应用中的疗效、优势及有待解决的问题等予以综述。     

腺病毒介导的BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞及对其增殖、成骨分化的影响

目的: 用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),研究转染对其增殖、成骨分化的影响.方法: 用Ad-BMP-2转染兔BMSCs,利用免疫细胞化学法、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪观察细胞周期的变化,分析转染对BMSCs增殖的影响.酶标法检测ALP活性;免疫荧光检测骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原表达,分析转染对BMSCs成骨分化的影响.结果: BMP-2基因在转染细胞内mRNA水平和蛋白水平均有较高表达,蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达.流式细胞仪检测G1期、S期细胞比例与空白对照组无差异.ALP活性明显增高,骨钙素、Ⅰ型胶原免疫荧光检测,见胞浆内有大量显绿色荧光的阳性物质.结论: 在腺病毒载体介导下BMP-2基因成功导入BMSCs,细胞增殖未因转染而受影响,并可持续表达基因产物,向成骨细胞分化.     

具有自塑能力可吸收注射型纳米骨浆

目的　为研制一种适应整形外科微创技术发展的一种可注射、可吸收、无产热、原位立即变硬的骨替代材料。方法　通过合成研制一种有缓冲性的黏滞性骨浆 ,在体外研究其生物相容性 ,同时在犬的双侧肱骨缺损模型上研究其自塑形和生物吸收特性。结果　实验证明该种植入材料具有极好的塑形性能 ,在 12～18周内完全吸收 ,临床上治疗骨折的X线显像充实 ,植入物吸收和骨再生存在一个合适的比例。结论　该文阐述了一种生物可吸收可调节硬化时间的注射性骨浆 ,该种骨浆的特性符合多数骨增生过程 ,具有自动充填 ,不产热 ,即便在潮湿和血运丰富的情况下亦有硬化 ,植入成分被设计为产生中性pH值的骨浆 ,能重建骨组织 ,不含有聚合体或可塑剂。大量体外研究表明该材料具有高度生物相容性和非致热源性。     

Construction of Adeno-associated Virus System for Human Bone Morphogenetic Protein 7 Gene

To construct the recombinant adeno-associated virus （rAAV） vector with human bone morphogenetic protein 7 （BMP7） and observe the BMP7 mRNA expression in vitro, BMP7 CDS sequence was cloned into expression plasmid pAAV-MCS of AAV Helper Free System. The recombinant plasmid was identified with enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid, pAAV-RC, pHelper were co-transfected into AAV-293 cells according to the calcium phosphate-based protocol. The viral stock was collected by 4 rounds of freeze/thaw. After purified and concentrated, the recombinant virus titer was determined by dot-blot assay. HEK293 cells were transfected with the recombinant virus at different MOI, and the expression of BMP7 mRNA was detected by RT-PCR. The results showed rAAV-BMP7 was constructed and packaged successfully. The physical particle titer was 2.5×10^11 vector genomes/mL. There was different expression level of BMP7 mRNA after transfecton. These data suggested that recombinant AAV mediated a stable expression of hBMP7 mRNA in 293 cells. The AAV production method may pave the way of an effective strategy for the jaw bone defection around dental implants.     

表达人骨形成蛋白2的成纤维细胞系的建立与鉴定

目的:建立能稳定表达BMP2的成纤维细胞系.方法:运用阳离子聚合物转染试剂,将含有人BMP2基因的真核表达载体pcDNA3.1-B2导入NIH3T3细胞,通过G418筛选获得阳性细胞克隆,RT-PCR、免疫组化和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BMP2基因的稳定转染和蛋白表达.结果:转染细胞内有BMP2mRNA的转录,胞内及胞外有BMP2蛋白的表达.结论:采用阳离子聚合物转染法可成功地将外源性hBMP2基因导入NIH3T3细胞,为进一步研究诱导牙周膜细胞骨化分化建立基础.     

重组人骨形成蛋白2基因在大肠杆菌中的克隆

目的：在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因,方法：由人成骨细胞中提取细胞总RNA,利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA;将获得基因片段重组到pCI质粒中,转化到大肠杆菌Top10后挑选克隆,利用限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定重组质粒。结果：质粒DNA酶切分析及核酸序列分析证实,获得的基因片段为人BMP2全编码序列,结论：克隆获得人骨形成蛋白2基因,为表达骨形成蛋白2奠定了基础。     

骨形成蛋白2基因多态性与冠脉钙化相关性研究

目的：研究骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)基因多态性在重庆汉族人群中的分布及与冠脉钙化（coronary artery calcification,CAC）的相关性。方法：收集2019年3月至2019年5月260例重庆医科大学附属第一医院心内科重庆汉族冠脉造影患者临床资料及血液样本,通过测序检测患者BMP2 rs961253、rs235768、rs1049007,OPG rs2073617、rs2073618, S100A12 rs2916191基因位点序列,应用ELISA法检测血清BMP2、OPG、S100A12水平。结果：CAC组167例,年龄（67.13±9.64）岁;对照组93例,年龄（60.46±9.89）岁。高血压、糖尿病、肥胖患者更容易发生CAC,CAC组男性发病率、载脂蛋白A1、C反应蛋白、白细胞数以及血清BMP2、S100A12、OPG水平明显高于对照组（P<0.05）。BMP2 rs961253基因型频率及等位基因频率分布在CAC组和对照组之间有统计学差异（P<0.05）。钙化组中,BMP2 TT基因型血...     

稳定表达人骨形成蛋白2成纤维细胞的建立与鉴定

目的 探讨ＢＭＰ对细胞分化的调节作用,为ＢＭＰ基因疗法的建立提供依据。方法 构建了含有人ＢＭＰ２开放阅读框（１．２ｋｂ）的真核表达载体ｐＢＫ－Ｂ２利用脂质本转染方法将其导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,通过Ｇ－４１８筛选获得了性细胞克隆,细胞原位杂交和免疫组化检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达情况。结果 转染细胞内有ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的转录及其蛋白的表达,结论：人ＢＭＰ２基因ＮＩＨ３Ｔ３细胞中得到稳定有效的方法。     

重组人骨形成蛋白－2与异种骨复合移植的扫描电镜观察

目的：明确含有重组人骨形成蛋白－２（ｒｈＢＭＰ－２）的新型复合异种骨的骨修复能力。方法：将ｒｈＢＭＰ－２与经综合化学处理的新生小羊骨松质（ＣＢ）结合，制备成复合异种骨．将复合异种骨植人兔下颌骨缺损，并以单纯松质骨移植、自体骨移植作为对照组，术后２、４、８、１２周分别取材做扫描电镜观察。结果：复合异种骨移植后，植骨区有大量新骨形成，新骨的量随移植时间延长而逐渐增多。自体骨移植组扫描电镜下表现与复合异种骨组基本相同。而单纯骨松质载体移植后，植入区多为纤维结缔组织，新骨形成少．结论：ｒｈＢＭＰ－２可显著促进复合异种骨内的新骨形成。这种新型复合异种骨可能是一种较理想的植骨材料，可望用于人体植骨     

骨形态发生蛋白2临床应用的不良反应

骨形态发生蛋白2（BMP2）是一种能够诱导骨形成的活性蛋白质,参与并调控诱导间充质干细胞向成骨细胞分化过程,于2002年被美国食品药品管理局批准用于单节段腰椎前路椎体融合术。然而在临床使用BMP2过程中,逐渐发现其可导致异位骨化、骨溶解及移植物下沉、骨囊肿形成、炎症反应相关并发症、神经根炎、逆行性射精和肿瘤形成等不良反应的发生。这些不良反应可能与BMP2的超适应证使用、超生理剂量使用存在一定相关性。本文主要对BMP2临床应用的不良反应进行综述,以为临床更加安全、有效地应用BMP2提供参考。