具强杀菌活性的兔Ⅱ型磷脂酶A2互补DNA克隆及其顺序确定的 …

目的：确定具强杀菌活性的兔Ⅱ型磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２）ｃＤＮＡ和蛋白质的一级结构，了解其杀菌功能与蛋白质一级结构的关系。方法：用ＰＣＲ方法从兔骨髓ｃＤＮＡ库中克隆出Ⅱ型磷脂酶Ａ２ｃＤＮＡ并确定ＤＮＡ顺序，推断出这的蛋白质一级结构；并与其它一些动物ＰＬＡ２的结构进行比较。结果：成功获得了该磷脂酶Ａ２和ｃＤＮＡ和蛋白质一级结构。它是目前上百种已知蛋白一级结构的磷脂酶Ａ２中碱性最强的蛋白，氨基酸组成中碱性     

STUDY ON THE RELATIONSHIP BETWEEN STRUCTURE AND BACTERICIDAL ACTIVITY OF THE POLYPEPTIDES DERIVED FROM THE C-TERMINAL HUMAN GROUP ⅡA PHOSPHOLIPASE A2

目的:研究人ⅡA型磷脂酶A2(group ⅡA phospholipase A2,PLA2GⅡA)碳末端衍生多肽的分子结构与杀菌活性的关系.方法:以人PLA2GⅡA一级结构碳末端的26个氨基酸残基为模板,分别合成3条多肽如下:①直链肽P1-26;②将其中一半的碱性氨基酸替换成中性氨基酸的P2-26;③碱性氨基酸(组氨酸和赖氨酸)全被替换成精氨酸的P3-26.采用琼脂铺板计数法测定多肽的杀菌活性.将不同浓度的3种多肽分别与G+菌(枯草杆菌)和G-菌(大肠杆菌)在37 ℃孵育2 h,然后铺板并置于37 ℃恒温箱培养18～24 h,记录每一琼脂板上的菌落数(CFU),并计算多肽作用后的杀菌率.结果:①碱性氨基酸减少的P2-26杀G+菌活性降低,仅为P1-26的1/4,但对G-菌杀菌效应稍增高;②碱性氨基酸全为精氨酸的P3-26杀G+菌和G-菌的活性与P1-26相比均明显降低.结论:人PLA2GⅡA衍生杀菌多肽P1-26的杀菌作用与其所含有的碱性氨基酸密切相关,减少碱性氨基酸的量可以减低它杀G+菌的活性,改变碱性氨基酸的类型也可以影响它的杀菌活性.     

大鼠心血管系统中Ⅱ型磷脂酶A2 mRNA表达及cDNA克隆

目的：探讨Ⅱ型磷脂酶A2（PLA2）mRNA在正常大鼠心血管系统中的分布情况,研究其基因和氨基酸顺序结构的特征,了解与心血管疾病有密切关系的PLA2。方法：从大鼠血、心肌、主动脉弓、下腔静脉近心段、腹主动脉和下腔静脉腹腔段的组织匀浆中提取总RNA,合成第一链cDNA,利用PCR扩增大鼠Ⅱ型PLA2 mRNA,并对大鼠腹主动脉的PLA2 cDNA进行克隆和序列分析。结果：在所检测的几个心血管系统组织中均能测到Ⅱ型PLA2 mRNA,大鼠腹主动脉的DNA和氨基酸结构与其他组织来源的PLA2有高度同源性。结论：Ⅱ型PLA2广泛存在心血管系统中,Ⅱ型PLA2 mRNA在血液和主动脉弓中的表达较高,提示这可能是一种有益的选择性表达,发挥着潜在的宿主防御细菌感染功能。     

低浓度肝素对重组人血小板型磷脂酶A2杀菌活性的抑制

目的：研究肝素对重组人血小板型磷脂酶A2(PLA2)杀菌活性的影响．探讨血小板型PLA2电荷性质在其杀菌机制中的作用。方法：将金黄色葡萄球菌与重组人血小板型PLA2共同孵育．试验组加入肝素．通过测定细菌菌落数来评价杀菌效果。结果：低浓度肝素对重组人血小板型PLA2杀菌功能有明显抑制作用．仅0．0300U/ml的肝素其杀菌抑制率达100%。结论：①血小板型PLA2的正电荷性在其杀菌作用中是关键因素;②肝素是血小板型PLA2一种有效的抑制剂。     

Study on Bactericidal Activity of the Polypeptide Derived From N-terminal 11 Amimo Acid Residues of Human Group ⅡA Phospholipase A2

目的 观察衍生自人ⅡA型磷脂酶A2(PLA2)N-端的多肽hPLA2N1-11对不同细菌在体外的杀菌效应.方法 根据人ⅡA型PLA2 N-端11个氨基酸残基的顺序,合成hPLA2N1-11.将不同浓度的多肽分别与革兰阳性菌和革兰阴性菌在温度为37℃中水浴2 h,取出铺板,置于37℃培养18～24 h,取出并记录每块琼脂板的菌落生成数(CFU),计算杀菌率.结果 hPLA2N1-11对同属革兰阳性(G+)菌的金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌的杀菌作用较强;对同属革兰阴性(G-)菌的大肠杆菌、变形杆菌和绿脓杆菌的杀菌作用较弱,人ⅡA型PLA2衍生肽虽然只有原分子1/10的大小,但仍具有与ⅡA型PLA2类似的杀菌效应.结论 多肽hPLA2N1-11对革兰阳性菌杀菌作用强,对革兰阴性菌杀菌作用弱,可能具有与ⅡA型PLA2类似的杀菌机制.     

广西眼镜王蛇毒一种碱性蛋白的分离纯化及性质研究

目的:广西眼镜王蛇毒一种碱性蛋白的分离纯化和性质研究.方法:分离纯化采用DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析,Sephadex G-75凝胶过滤和CM-Sepharose CL-6B离子交换柱层析;通过电泳,磷脂酶A2(PLA2)酶活力测定,氨基酸组成分析,N端序列测定及药理实验进行性质研究.结果:从广西眼镜王蛇毒中分离到一种电泳纯的碱性蛋白(命名为CM-IV),相对分子质量约为14 000,等电点约为8.65;PLA2的比活力为23 μmol·mg-1/min.氨基酸组成分析表明,其分子中Cys的含量占6.85%;利用蛋白质直接测序N端序列为TKCYVTPDVK.药理实验表明它对实验用小白鼠有致死性(LD50约为0.2 mg/kg),并具有心脏毒性,但无血小板抑制活性.根据Genebank Blast 分析软件,它的N端序列与神经毒素具有高度的同源性.结论:这种碱性蛋白可能为神经毒素,但却拥有PLA2的活力.     

灵长生物抗菌蛋白ⅡA型磷脂酶A2氨基酸取代与分子进化的关系

目的:了解灵长生物的抗菌蛋白ⅡA型磷脂酶A2氨基酸取代的特点及其与分子进化的关系.方法:对人、猩猩和猴3种哺乳类灵长生物的抗菌蛋白ⅡA型磷脂酶A2的氨基酸顺序进行两两比较,分析它们之间相互取代的位点、频率和性质.结果:①人和猩猩、人和猴、猩猩和猴之间分别有4,12,12个氨基酸残基发生取代,且主要发生在带电荷的氨基酸;...     

重组人血小板型磷脂酶A2杀菌作用及其抗生素后效应的研究

目的:探讨利用基因工程制备重组人血小板型磷脂酶A2(PLA2)对革兰阳性(G+)菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)体外的杀菌作用,并观察其抗生素后效应(PAE),探讨血小板型PLA2的杀菌机制.方法:采用微量稀释法测定重组人血小板型PLA2对细菌的最低抑菌浓度(MIC),以菌落平板计数法检测最低杀菌浓度(MBC)和PAE.结果:血小板型PLA2对4种细菌MIC值在0.05～0.2μg/ml之间,MBC值在0.1～0.4 μg/ml之间.血小板型PLA2对4种细菌PAE为1.6～24 h.结论:重组人血小板型PLA2对G+菌有较强的杀菌作用,血小板型PLA2对G+菌有明显的PAE,具有发展为新型抗菌药物的巨大潜力.     

蛇毒Ⅱ类磷脂酶A2功能分化的分析研究

目的：研究蛇毒Ⅱ类磷脂酶A2(PLA2)中D49 PLA2和K49 PLA2的功能分化及其功能分化决定位点的鉴定。方法：运用序列比较分析，进化树构建和DIVERGE v1．04软件计算研究D49 PLA2和K49 PLA2的功能分化情况及其分化位点。结果：序列比较分析，进化树构建和DIVERGE v1．04软件计算结果表明蛇毒Ⅱ类PLA2中D49 PLA2和K49 PLA2的确发生了功能分化，对于K49 PLA2来说，1S，7K，11Q，E12，R34，T56，N88，L92，E108，K116，K128可能为功能分化决定位点。对于D49 PLA2，L2，G33，G35，F46和Y118可能为功能分化决定位点。结论：我们首次通过序列比较分析，进化树构建和DIVERGE v1．04软件计算鉴定出蛇毒Ⅱ类PLA2中D49 PLA2和K49 PLA2可能的功能分化位点，为今后通过基因重组和定点突变方法研究蛇毒Ⅱ类PLA2结构功能关系提供了线索。     

一种新的五步蛇蛇毒类凝血酶Cdna的克隆和序列分析

目的：克隆出五步蛇的类凝血酶cDNA，为研究其结构和功能的关系。并为下一步基因表达开发抗血栓药物提供依据和基础。方法：从五步蛇蛇腺中提取了总RNA，通过反转录合成第一链cDNA，经PCR扩增出五步蛇毒腺中类凝血酶TLE1的cDNA片段，并将其连接到质粒载体扩增，然后进行DNA测序。结果：成功克隆出一种新的五步蛇类凝血酶的cDNA片段。此片段全长794bp，包括编码部分的全长为777bp。推导其编码的蛋白质序列为258个氨基酸，其中包括18个氨基酸的信号肽，6个氨基权的前肽和234个氨基酸的成熟氨基酸顺序。TLE1成熟肽与其它蛇毒类凝血酶相比，蛋白质一级结构具有较高的同源性。结论：从五步蛇中成功克隆出一 种新的类凝血酶cDNA，并确定了它的DNA顺序。     

哺乳生物血小板型磷脂酶A2分子的进化

目的：了解具杀菌活性的哺乳生物血小板型磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２）分子进化的特点。方法：将所有已知哺乳生物的血小板型和胰腺型ＰＬＡ２的ｃＤＮＡ和基因资料进行收集并加以统计和分析。结果：哺乳生物血小板型ＰＬＡ２基因突变的频率较胰腺型ＰＬＡ２高，碱基取代中非同义取代数高于同义取代数。血小板型ＰＬＡ２的蛋白质结构中可形成对酸不稳定的肽键的氨基酸明显较少，而易被发酵产物乙酰基不可逆化修饰的精氨酸明显高于胰腺型。     

DEFENSE MECHANISMS OF URINARY BLADDER:STUDIES ON ANTIMICROBIAL POLYPEPTIDES FROM BLADDER MUCOSA

The acid-soluble extract of the bladder mucosal surface was obtained by washing out the bladder with dilute acetic acid in the presence of protease inhLbitors. The wash-out materials from rats, rabbits, pigs,and humans manifested strong bactericidal activity agaLnst E. co/i in vitro. The uhrafLltrate of the human material, which comtained two major peptides with apparent molecular masses of 6. 7 kD and 8. 5 kD, respectively, showed potent bacteticidal activity against E. colt, Psetzdomonas aeruginosa, Staphylococcus aureua, and Streptococcus sanguis. Three antibacterial polypeptides (PiBPs) were purified from the porcine material. The molecular masses of PiBP 5. PiBP 11 and PLBP-25 were 5773.3 Da, 11127.8 Da and 25073 Da, respectively. PLBP-5 was unusually rich in glycine, serine and threonine residues(20. 0, 16. 3 and 10. 4 mol%, respectively), and N-terminal amino acid sequencLng revealed that PiBP-5 was homologous (83. 3% identity in an 18 residue overlay) to the “tail“ of human cytokeratin-7. Although the amino acid compositions of PiBP-11 and PiBP-25 were established, both had blocked N termini and primary sequence data were not obtained. These results provided evidence indicating that the presence of peptides !n the bladder mucosa could enable it to kill adherent bacteria.     

树Qu胆固醇酯转运蛋白的cDNA和蛋白质结构分析

目的 获得不易感动脉粥样硬化动物树Qu胆固醇酯转运蛋白（CETP）的cDNA和蛋白质序列,分析其结构特点,寻找其可能的抗动脉粥样硬化分子机制。方法 以从树Qu肝脏mRNA反转录获得的cDNA一链为模板,应用SMART－RACE技术,获得了树QuCETP的cDNA序列,并推导出其蛋白质氨基酸序列,应用分子生物学软件对该蛋白的一级、二级结构进行分析和比较。结果 获得的树QuCETP cDNA（在GenBank中的注册号为AF334033）长1636bp,编码485个氨基酸,其成熟蛋白由477个氨基酸组成,比人多一个氨基酸（Gly318),该蛋白与人、家兔的同源性分别为88％和82％。序列中与CETP结合和转运中性脂质功能相关的区域均非常保守,但在Asm342位的N－糖基化位点缺失,可能使其转运胆固醇酯的活性增加,利于外周组织和血浆中的胆固醇及其酯的清除。通过对不同种属蛋白序列的比较,初步分析了树QuCETP蛋白与功能相关的结构特点。结论 树QuCETP糖基化的特点有可能是该动物对动脉粥样硬化具有不易感性的分子机理之一。     

眼镜蛇血清解毒蛋白基因的分子克隆和序列分析

既往研究中作者发现，眼镜蛇血清解毒蛋白（ＣＳＡＰ）经胰蛋白酶水解后纯化所得的几个肽段中，至少在一３９肽显示其序列与大鼠血清白蛋白相关。为进一步弄清ＣＳＡＰ的毒素结合活性与其相应的分子结构关系，以眼镜蛇肝细胞建立了ｃＤＮＡ文库，借已知的胰蛋白酶水解ＣＳＡＰ所得的肽段氨基酸序列设计了一组ＰＣＲ引物。采用ＰＣＲ扩增方法从文库中筛选得ＣＳＡＰ特异性克隆，测定了ＣＳＡＰ全ｃＤＮＡ序列，然后推导出ＣＳＡＰ氨基酸序列。并得知ＣＳＡＰ为一由６１４个氨基酸残基组成的单一多肽链，分子量６９８００。根据其全序列的结构特征，尤其是其信号肽与已知的几种哺乳动物白蛋白的信号肽序列非常一致，其中半胱氨酸残基的分布规律也与其他血清白蛋白非常相似，可确认ＣＳＡＰ即为眼镜蛇血清白蛋白（ＣＳＡ）。     

Molecular Cloning of a Novel cDNA From Mus Muscular BALB/c Mice Encoding Glycosyl Hydrolase Family 1： A Homolog of Human Lactase-Phlorizin Hydrolase

Objective To study the mechanism of lactose intolerance （LI） by cloning the mouse lactase cDNA and recombining a vector. Methods Total murine RNA was isolated from the small intestine of a 4-week-old BALB/c mouse （δ）. Crene-specific primers were designed and synthesized according to the cDNA sequences of lactase-phlorizin hydrolase （LPH） in human, rat, and rabbit. A coding sequence （CDS） fragment was obtained using RT-PCR, and inserted into a clone vector pNEB-193, then the cDNA was sequenced and analyzed using bioinformatics. Results The cDNA from the BALB/c mouse with 912 bp encoding 303 amino acid residues. Analysis of the deduced amino acid sequence using bioinforrnatics revealed that this cDNA shared extensive sequence homology with human LPH containing a conserved glycosyl hydrolase family 1 motif important for regulating lactase intolerance. Conclusion BALB/c mouse LPH cDNA （GenBank accession No： AY751548） provides a necessary foundation for study of the biological function and regulatory mechanism of the lactose intolerance in mice.     

COLNING AND ANALYSIS OF THE GENOMIC DNA SEQUENCE OF AUGMENTER OF LIVER REGENNERATION FROM RAT

Objiect:To search for genomic DNA sequence of the augmenter of liver regeneration(ALR) of rat.Methods:Polymerase chain reaction(PCR)with sepcific primers was used to amplify the sequence from the rat genome.Results:A piece of genomic DNA sequence and a piece of pseudogene of rat ALR were identified.The lengths of the gene and pseudogene are 1508 bp and 442 bp,respectivel.The ALR gene of rat includes 3 exons and 2 introns.The 442 bp DNA sequence may represent a pseudogene or a ALR-related petide.Predicted amino acid sequence analysis showed that threre were 14 different amino acid residues between the gene and pseudogene.ALR-related petide is 84 amino acid residues in length and relates closely to ALR protein.Conclusion:There might be a multigene family of ALR in rat.