核转录因子NF—κB在血管内皮细胞组织因子表达中的作用

目的：探讨核转录因子NF－κ在肿瘤坏死因子α（TNF－α）,血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导血管内皮细胞组织因子（TF）表达中的作用。方法：用发色底物法测定血管内皮细胞表面TF活性。分别采用凝胶电泳迁移率改变法（EMSA）和Western 鲩迹法检测血管内皮细胞核转录因子NF－κB的DNA结合活性和含量。结果：100U／ml TNF-α,^-6mol/l Ang II作用下,内皮细胞表面TF活性明显增高。分别较对照增高1＝65倍和1．61倍,TNF－α,AngⅡ处理后细胞核内NF－κB含量明显增加,分别为正常对照组的1．77倍和1．52倍。结论：TNF－α,AngⅡ可增强内皮细胞TF活性,这可能与其促进内皮细胞核转录因子NF－κB的核转位和DNA结合活性有关,进一步证实NF－B在内皮细胞TF诱导表达中的重要作用。     

3-芳基香豆素衍生物抑制血管钙化的机制

为揭示3-芳基香豆素衍生物3-(4′-羟基苯基)-6-羟基香豆素（SJ-6）对抗血管钙化的作用机制,采用晚期糖基化终产物（AGEs）对人体主动脉血管平滑肌细胞（HCASMCs）进行钙化诱导并通过茜素红染色及定量进行钙化鉴定。分别检测了化合物SJ-6对碱性磷酸酶（ALP）活力、细胞增殖率、钙含量、总活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、AGEs、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素6(1L-6)、白细胞介素β（1L-β）、成骨相关转录因子2 m RNA(Runx2 m RNA)、晚期糖基化终产物受体（RAGE）、核因子κB(NF-κB)、NADPH氧化酶-1(NOX-1)、蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶B(AKT)、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、α-平滑肌肌动蛋白（SMA-α）蛋白表达的影响。根据研究结果发现化合物SJ-6可明显降低钙化细胞模型中AGEs含量、ALP活性、细胞内钙离子含量、ROS含量、Runx2 m RNA以及炎症因子TNF-α、1L-6和1L-β的含量（P <0.05）,并升高SOD的含量（P <0.01）,这些作用与阳性对照药氨...     

干扰 Krüppel 样因子 8表达对肝癌 SMMC7721细胞中血管生成相关因子的调控作用

目的：构建Krüppel样因子8（Krüppel-like factor 8,KLF8）的真核表达质粒及干扰质粒,考查KLF8对人肝癌SMMC7721 细胞中血管生成相关因子的调控作用。方法：构建KLF8的真核表达质粒pcDNA3.1-KLF8,测序确认。构建靶向不同KLF8干扰位点的干扰质粒pGPU6/GFP/Neo-KLF8,筛选出干扰效率最高的pGPU6/GFP/Neo-KLF8。将pcDNA3.1-KLF8、相应的对照质粒 pcDNA3.1,pGPU6/GFP/Neo-KLF8、相应的对照质粒pGPU6/GFP/Neo-ShNC 分别转染人肝癌SMMC7721细胞,共４组。实时荧光定量PCR及Western blot检测KLF8的表达,qPCR检测各组细胞中低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor,HIF）1-α、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、血管生成素（angiopoietin,Ang）1、Ang2、血管生成素受体Tie2及基质金属蛋白酶（matrix metallo-proteinase,MMP）2的mRNA表达。结果：pcDNA3.1-KLF8显著上调KLF8表达（相对表达量为68.8±6.5）,pGPU6/GFP/Neo-KLF8下调KLF8的表达（相对表达量 0.31±0.01）。转染pcDNA3.1-KLF8组与其对照组相比,VEGF、Ang2、HIF1-α及MMP2 mRNA表达增加（P<0.05）,血管生成素受体Tie2、Ang1的mRNA表达无差异（P ＞0.05）;转染pGPU6/GFP/Neo-KLF8组与其对照组相比,Ang2和HIF1-α表达降低（P<0.05）,VEGF、血管生成素受体Tie2、Ang1及MMP2的表达无差异（P ＞0.05）。结论：在肝癌中,KLF8可能通过调控VEGF、Ang2、HIF1-α及MMP2来调控血管生成。     

补阳还五汤激活PI3K-AKT通路促进氧糖剥夺再灌注损伤的脑微血管内皮细胞血管生成

目的：探讨补阳还五汤促进氧糖剥夺再灌注（OGD/R）损伤的大鼠脑微血管内皮细胞（RBMEC）血管生成的机制。方法：RBMEC经补阳还五汤含药血清孵育24?h后,构建OGD/R细胞损伤模型。将细胞随机分为正常对照组、模型对照组、补阳还五汤组（给予补阳还五汤含药血清）和LY294002组[给予补阳还五汤含药血清前使用磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂LY294002预处理1?h]。采用CCK-8法、细胞划痕实验和Transwell迁移实验、管腔形成实验分别检测细胞增殖、迁移和形成管腔能力。蛋白质印迹法检测PI3K、蛋白激酶B（AKT）、低氧诱导因子（HIF）-1α及血管内皮生长因子（VEGF）等蛋白的表达。结果：与模型对照组比较,补阳还五汤组RBMEC存活率、迁移能力及管腔形成能力显著增强（均P<0.01）,磷酸化PI3K、磷酸化AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达增加（均P<0.05）,而LY294002可阻断上述效应。结论：补阳还五汤含药血清可促进OGD/R损伤的RBMEC血管生成,其机制可能与其激活PI3K-AKT信号通路上调HIF-1α和VEGF表达有关。     

核因子-κB对TNF-α诱导的脂肪细胞葡萄糖转运蛋白4表达的影响

【目的】观察TNF-α对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）mRNA与蛋白表达的作用,并探讨核因子-κB（NF-κB）对上述作用的影响。【方法】成熟的3T3-L1脂肪细胞分成3组：A组正常对照组,B组肿瘤坏死因子α（TNF-α）组,C组吡咯烷二硫基甲酸酯（NF-κB活性抑制剂）＋TNF-α组。各组干预48h后检测phospho-NF-κBp65（Ser536）的蛋白水平、GLUT4mRNA及蛋白水平。蛋白检测采用Western法,mRNA检测采用RT-PCR法。【结果】B组phospho-NF-κBp65蛋白水平（71.1&#177;5.9）高于A组（41.3&#177;1.7,P〈0.001）和C组（25.4&#177;4.7,P〈0.001）。B组GLUT4的mRNA水平（0.86&#177;0.14,P〈0.001）与蛋白水平（31.6&#177;7.2,P〈0.001）低于A组（2.01&#177;0.65;60.7&#177;8.4）,C组mRNA水平（0.46&#177;0.12）与B组比较有下降趋势但无统计学意义（P=0.100）,C组蛋白水平（9.5&#177;3.0）低于B组（P=0.001）。【结论】TNF-α下调3T3-L1脂肪细胞的GLUT4表达,抑制NF-κB活性后GLUT4表达进一步下调。这提示了TNF-α可能不是通过激活NF-κB而使GLUT4的表达下调。     

子宫内膜异位症组织中HIF-1α及MIF的表达及意义

目的探讨巨噬细胞移动抑制因子（MIF）及缺氧诱导因子（HIF-1α）在血中的阳性表达与子宫内膜异位症发生的关系。方法对异位内膜组织（C组）、在位内膜组织（B组）及正常子宫内膜组织（A组）各40例进行血清HIF-1α及MIF测定,并比较三者表达的阳性率。结果 C组MIF阳性率高于在B组,B组阳性率高于A组,差异有统计学意义（P〈0.05）,C组HIF-1 a阳性率高于B组,B组阳性率高于A组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 HIF-1α及MIF通过促进血管的生成,在子宫内膜异位症发病中起着重要的作用。     

fractalkine影响动脉粥样硬化信号的转导机制及卡托普利的干预作用

目的:通过鸟苷酸结合蛋白（G-蛋白）对不规则趋化因子fractalkine（FKN）诱导单个核细 胞合成核因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响,探讨FKN及其受体CX3CR1 可能存在的信号转导机制及卡托普利的干预作用。方法：将抗凝血用Ficoll密度梯度离心 法分离外周血单个核细胞,随机分为空白对照组、FKN组、PTX组、RO31-8220组、PDTC组及 卡托普利组,应用免疫组化检测各组单个核细胞中NF-κB表达情况,应用酶联免疫法检测各 组培养液中TNF-α的表达水平。结果：FKN组与空白组比较NF-κB 、TNF-α表达明显增多( P<0.05);G-蛋白阻断剂PTX组与FKN组比较NF-κB 、TNF-α表达明显减少(P<0.05); PKC阻断剂RO31-8220组与FKN组比较NF-κB 、TNF-α表达减少(P<0.05);NF-κB抑制剂PDTC组TNF-α表达较FKN组明显减少(P<0.05);卡托普利组较FKN组NF-κB 、TNF-α表达部分减少(P<0.05)。结论：FKN/CX3CR1有增加单个核细胞表达NF-κB、 TNF-α的作用;而卡托普利可通过减弱FKN/CX3CR1诱导单个核细胞合成NF-κB、 TNF-α,抑制炎症反应和抗动脉粥样硬化;FKN/CX3CR1影响动脉粥样硬化的信号转导机制可能是通过以下级联反应实现的：FKN+CX3CR1→G蛋白→PKC→NF-κB→TNF-α。     

Gal-3通过ERK1/2通路诱导血管平滑肌细胞增殖促进大鼠动静脉内瘘狭窄发生的机制

探讨半乳糖凝集素-3（Gal-3）诱导血管平滑肌细胞增殖及促进大鼠动静脉内瘘（AVF）狭窄发生的作用,并探讨可能机制。方法 取30只AVF大鼠,随机数字法分为AVF组、柑橘果胶组、联合组,每组10只;另取10只大鼠行假手术,设为假手术组。联合组灌胃柑橘果胶生理盐水溶液（含柑橘果胶0.15 mg/kg）,尾静脉注射表皮生长因子［细胞外信号调节激酶（ERK）通路激动剂（EGF）］（10 μg/kg）;柑桔果胶组灌胃柑橘果胶生理盐水溶液（0.15 mg/kg）,尾静脉注射等体积PBS;假手术组、AVF组灌胃等量生理盐水,尾静脉注射等体积PBS。每日1次。干预4周。MTT法检测血管平滑肌细胞增殖能力;ELISA法检测血清炎症因子［肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）］水平;ELISA法检测血管组织转化生长因子-β1（TGF-β1）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）水平;Western blot法检测血管组织p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达量。结果 与AVF组比较,柑橘果胶组24、48、72 h吸光度值,血清TNF-α、IL-6水平,血管组织TGF-β1、VEGF水平,p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2降低（P＜0.05）;与柑橘果胶组比较,联合组24、48、72 h吸光度值,血清TNF-α、IL-6水平,血管组织TGF-β1、VEGF水平,p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高（P＜0.05）。结论 Gal-3抑制剂改良柑橘果胶可抑制血管平滑肌细胞增殖及炎症反应,缓解AVF狭窄,并抑制ERK信号通路活性     

TNF-α对肾血管收缩敏感性的影响

目的观察肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）对肾血管收缩敏感性的影响。方法 28只大鼠制备离体灌注肾模型,随机分为4组（n=7）。A1组：无钙Kreb’s液灌流组;A2组：无钙Kreb’s液＋TNF-α（100μg/L）灌流组;B1组：无钙Kreb’s液＋2-APB（30μmol/L）灌流组;B2组：无钙Kreb’s液＋TNF-α（100μg/L）＋2-APB（30μmol/L）灌流组,4组在刺激期均加内皮素（endothelin,ET）（1 nmol/L）刺激。灌流结束后,计算肾脏水肿率,HE染色观察肾小球及肾小管形态、结构。结果平衡期过后,各组基础灌注压比较无统计学差异（P〉0.05）。A1、A2组ET刺激后,肾灌注压较基础压均明显升高（P〈0.05）;A2组灌注压升高值显著高于A1组（P〈0.01）。B1、B2组ET刺激后,肾灌注压均略升高,但与基础灌注压比较无统计学差异（P〉0.05）;两组灌注压升高值比较无统计学差异（P〉0.05）。4组肾脏的水肿率均低于30%,灌流后肾脏标本切片均未发现明显的器质性损伤,与灌流前相符。结论 TNF-α可能通过上调1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R）进而增强ET引起的肾血管收缩。     

小鼠不同细胞间组蛋白修饰变化对MafA基因转录表达的影响

目的通过比较不同细胞类型之间MafA基因转录起始区的组蛋白修饰差异,探讨组蛋白修饰对MafA基因转录表达的作用。方法采用染色质免疫共沉淀-实时定量PCR法检测小鼠胰岛素瘤β细胞(NIT-1)、NIH小鼠成纤维细胞(NIH3T3)及小鼠胚胎干细胞(mES)三者中的MafA和MLH1基因转录起始区组蛋白修饰(H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化)的状况。同时采用实时定量RT-PCR检测上述三种细胞各基因mRNA表达水平。分析基因的H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化修饰与基因表达之间的相互关系。结果 (1)以mES细胞为参照,NIT-1细胞MafA基因的转录起始区的H3K4m3修饰水平明显增高(P<0.05),H3K9m3修饰水平明显降低(P<0.05);NIH 3T3细胞MafA基因的转录起始区的H3K9m3修饰水平明显增高(P<0.05),H3K4m3修饰水平明显降低(P<0.05);(2)MafA基因的仅在NIT-1细胞表达,其表达与H3K4m3修饰存在直线相关(相关系数0.995);与H3K9m3修饰存在直线负相关(相关系数-0.751);(3)管家基因MLH1的表达与所检测组蛋白修饰无相关性。结论 H3K9m3与H3K4m3修饰能相互协调,共同调控MafA基因的表达,对胚胎干细胞向β细胞分化具有重要的意义。     

人白介素-10在NIH3T3细胞中的表达及生物学效应的初步观察

目的观察IL-10的免疫抑制作用.方法将构建好的pLXHIL-10载体,经包装细胞PA317包装后感染小鼠成纤维细胞株NIH3T3,用ELISA和原位杂交的方法检测hIL-10的表达,并对其生物学活性进行初步观察.结果检测到感染细胞中有hIL-10 mRNA的表达,感染细胞培养上清中存在hIL-10,证实感染细胞培养上清对混合淋巴细胞培养反应有明显的抑制作用.结论hIL-10可抑制混合淋巴细胞反应.     

Foxp3、CD3在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

目的探讨Foxp3、CD3在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达及其与肺癌临床病理特征和预后的关系。方法选取62例NSCLC患者术后的肺癌组织标本（NSCLC组）及27例正常肺组织（距离肿块边缘5cm以上正常肺组织或另一叶肺组织）作为正常对照组。采用免疫组化方法分别检测两组组织中Foxp3、CD3表达的表达情况,并分析其与肺癌临床病理特征（年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小、分化程度、pTNM分期、淋巴结转移与否）的关系。结果NSCLC组Foxp3、CD3阳性细胞数均显著多于正常对照组（P〈0．01）。两者显著相关（P〈001）。Foxp3阳性表达仅在不同分化程度间存在明显差异,低分化者Foxp3阳性细胞浸润量高于高、中分化者（P〈0．05）;CD3阳性表达仅在不同术后pTNM分期间存在明显差异,ⅢB期、Ⅳ期NSCLC组织中CD3阳性细胞数明显减少（P〈0.05）。Foxp3表达与患者术后生存时间无关（P〉0.05）,CD3阳性细胞数与NSCLC患者术后生存时间呈线性正相关（P〈0．01）,Foxp3阳性细胞数与CD3阳性细胞数比值（Foxp3／CD3）与患者生存时间呈线性负相关（P〈0.05）。pTNM分期、CD3阳性细胞绝对数有统计学意义,可作为NSCLC患者的独立预后因素。结论NSCLC组织中CD3阳性细胞数低、Foxp3／CD3大者T细胞肿瘤免疫作用抑制,影响患者术后生存时间。联合检测术后肺癌组织中Foxp3、CD3,并结合患者术后病理分期可以更好地评估NSCLC患者手术预后。     

MRI高分辨率3D序列检测血管性神经压迫

目的探讨三维稳态进动快速成像序列（3D fast imaging employing steady state acquisation,3D-FIESTA）及三维动态增强序列（3D fat-suppressed spoiled qradient-echo,3D-FSPGR）序列在颅神经血管压迫综合征的影像诊断中的作用。方法利用GE Signa HD MR 1.5T超导磁共振机,采用3D-FIESTA及3D-FSPGR序列,对17例临床怀疑有血管性神经压迫的患者行桥小脑角区扫描,采用多平面重建（MPR）及最小密度投影行后处理。结果3D-FIESTA显示13例,3D-FSPGR序列显示15例血管神经关系密切,其中三叉神经5例,面神经7例,副神经3例;有11例行微血管减压术,经手术证实。结论3D-FIESTA序列结合增强扫描3D-FSPGR序列能很好的显示血管性神经压迫,有助于准确影像诊断。     

RNA干扰GPC3基因表达影响肝癌细胞Huh-7凋亡的机制研究

目的观察RNA干扰GPC3基因表达对人肝癌细胞Huh-7凋亡的影响,并探讨其初步机制。方法设计并合成靶向GPC3的特异性siRNA片段,通过脂质体转染法瞬时转染肝癌细胞Huh-7,48h后验证siRNA的干扰效率;Annexin V/PI染色法观察GPC3基因沉默对细胞凋亡的影响;通过Western blot和定量PCR来检测caspase3的蛋白水平和核酸水平表达。结果设计合成的GPC3siRNA转染后,能够有效抑制Huh-7细胞中GPC3的表达;流式细胞仪检测结果显示,GPC3干扰组细胞在转染后48、72h的凋亡率显著高于空白对照组(P<0.01),96h后两组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。GPC3干扰组的caspase3在转染后48、72h的表达高于未转染组,96h后两组间caspase3水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 siRNA静默GPC3基因能促进肝癌细胞凋亡,其机理可能与上调caspase3有关。进而推测,GPC3基因可能成为肝癌靶向治疗的一个新靶点。     

RNAi沉默STAT3基因对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的：研究pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,阐明RNA干涉技术在卵巢癌生物治疗领域中的作用。方法：应用人卵巢癌细胞系SKOV3对15例裸鼠建立人卵巢癌皮下移植瘤模型,随机分为3组：对照组（生理盐水）、空质粒对照组及重组质粒组（pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3）。应用电子穿孔仪将质粒转入裸鼠移植瘤内,观察重组质粒注射后第7、14、21和28天各组裸鼠皮下移植瘤体积变化。利用Western blotting检测重组质粒对STAT3蛋白表达的影响,采用HE及TUNEL染色方法观察肿瘤组织形态变化及细胞凋亡情况。结果：重组质粒瘤内注射对SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长有明显的抑制作用,与2个对照组比较,重组质粒组裸鼠移植瘤生长速度明显减慢（P<0.01）。重组质粒组瘤体内STAT3及CyclinD1、VEGF、survivin、c-myc蛋白表达明显低于2个对照组（P<0.01）。HE染色显示,重组质粒组肿瘤细胞出现大片细胞坏死,2个对照组肿瘤细胞以正常形态居多。TUNEL染色显示,重组质粒组癌组织有大量细胞凋亡,2个对照组几乎均为TUNEL阴性反应细胞。结论：pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒能明显抑制人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长。     

硫化氢对脂肪细胞前体增殖的影响

目的：探讨硫化氢对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响。方法：培养3T3-L1前脂肪细胞,分为对照组、低剂量组和高剂量组（硫化氢浓度分别为0、10、25、50和100μmol/L）,采用四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测硫化氢对3T3-L1前脂肪细胞活性的影响;用BRDU法检测细胞的增殖;结果：与对照组相比,H2S在较高浓度时,对细胞有一定的毒性作用（P〈0.05）。结论：硫化氢抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖。     

梓醇与小檗碱及其配伍对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的影响

目的观察梓醇与小檗碱及其配伍对地塞米松诱导的胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗、转运及这一过程中过氧化物体增殖物激活受体(PPAR-γ)mRNA表达的影响。方法采用地塞米松诱导胰岛素抵抗细胞模型,分别给予罗格列酮、小檗碱、梓醇、梓醇 小檗碱进行干预,以葡萄糖氧化酶法检测培养液中葡萄糖消耗量,以2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖摄入法观察葡萄糖的转运率,以RT-PCR检测PPAR-γmRNA的表达。结果含或不含10nmol/L胰岛素的条件下,梓醇、小檗碱及其配伍组胰岛素抵抗脂肪细胞的葡萄糖消耗量和转运率较模型组明显改善(P<0.05、0.01),配伍组效应优于梓醇、小檗碱单药组(P<0.05、0.01);且小檗碱组及配伍组PPAR-γmR-NA的表达降低(P<0.05、0.01)。结论梓醇、小檗碱均能增加葡萄糖消耗和转运,改善胰岛素抵抗,其作用不依赖胰岛素的存在,且小檗碱及两药配伍还能下调脂肪细胞PPAR-γmRNA的表达水平,提示梓醇、小檗碱改善胰岛素抵抗的作用机制可能与罗格列酮不同。     

硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响

目的:研究硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响。方法:培养3T3-L1前脂肪细胞,分为对照组、低硒组、中硒组和高硒组(亚硒酸钠浓度分别为0、0.01、0.1和1μmol/L),采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响,利用油红O染色法测定硒对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。结果:在增殖实验中,与对照组相比,各处理组的OD值降低,并具有剂量依赖性(P<0.05);在分化实验中,各处理组的OD值与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:硒能抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖,而对其分化无影响。     

不同葡萄糖浓度对3T3-L1细胞脂联素mRNA表达的影响

目的探讨不同葡萄糖浓度对3T3-L1细胞脂联素mRNA表达的影响.方法以β-actin为内对照,用半定量RT-PCR法检测不同浓度葡萄糖培养下3T3-L1细胞脂联素mRNA表达.结果培养液中的葡萄糖浓度在5.5～25.0mmol/L范围中,脂联素mRNA表达改变均无统计学意义(均P＞0.05).结论培养液中的短时间葡萄糖浓度变化不是影响3T3-L1细胞脂联素mRNA表达的主要因素.