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相似文献
 共查询到17条相似文献,搜索用时 133 毫秒
1.
目的 构建针对人caspase-8 基因mRNA的siRNA表达载体,并观察其对转染细胞中caspase8的抑制作用.方法 化学合成针对caspase-8发夹状的RNA寡核苷酸,将其退火形成双链,连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,RT-PCR测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果 成功地构建了针对人caspase-8基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-C1和pSUPER-C2,并在人HeLa细胞中有效发挥了对caspase8基因的干涉作用,而且pSUPER-C1对于caspase-8基因的抑制作用要优于pSUPER-C2.结论 成功地构建了针对人caspase-8基因的siRNA载体,转染HeLa细胞后可抑制caspase-8基因的表达.  相似文献   

2.
目的 构建自噬基因Beclin 1小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,探讨Beclin 1抑制后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用.方法 根据人Beclin 1 mRNA编码序列,设计RNA干扰靶点,构建Beclin 1 shRNA表达质粒,脂质体法转染人宫颈癌HeLa细胞,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测其对HeLa细胞自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达的影响.MTT法分析其对细胞增殖、流式细胞仪检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响.结果 构建的shRNA表达载体可以使HeLa细胞中自噬基因Beclin 1的mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度加快,凋亡率降低.结论 成功构建了针对自噬基因Beclin 1的shRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中Beclin 1的表达,并促进细胞生长,抑制凋亡.  相似文献   

3.
siRNA表达载体对hTERT基因的效应评价   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰表达载体,探讨其对人乳腺癌MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达的影响。方法:设计针对hTERT基因的干扰靶序列并构建重组siRNA表达载体pGenesil-hTERT。酶切测序鉴定后,脂质体转染MCF-7细胞,应用RT-PCR和Weston Blot法检测hTERT基因的表达情况,应用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功,且转染MCF-7细胞后,hTERT mRNA和蛋白质表达水平显著抑制,细胞凋亡率较对照组明显升高(P<0.01)。结论:以DNA质粒为载体的siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞生长、促进细胞凋亡。  相似文献   

4.
目的应用载体介导的RNA干扰(RNA i)技术特异性地抑制甲状腺癌细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达。方法构建利用U6启动子转录功能性小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后,转染人甲状腺癌FRO细胞,利用RT-PCR和W eston blot法检测hTERT基因的表达情况。结果构建的表达质粒转染FRO细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平明显降低,抑制率分别为76%和81%。结论siRNA的表达质粒能成功抑制甲状腺癌细胞hTERT基因的表达,为RNA i技术应用于甲状腺癌的基因治疗提供了实验基础。  相似文献   

5.
王燕  吴冰  苏海川  刘丽  林芳  张惠中 《医学争鸣》2005,26(24):2223-2225
目的:构建人stathmin基困的siRNA真核表达载体,探讨其对HeLa细胞中stathmin基因表达的干涉作用.方法:将合成的siRNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体,酶切及测序鉴定.脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选后RT—PCR检测其对stathmin基因mRNA的干涉效果.结果:经酶切及测序鉴定,成功构建siRNA真核表达载体+经脂质体转染HeLa细胞后,RT—PCR显示所构建的干涉stathmin基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表达,HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平明显降低.结论:成功构建了人stathmin基因的RNA干涉真核表达载体pSilencer—S1和pSilencer—S2,并在HeLa细胞中有效地发挥了对stathmin基因表达的干涉作用.  相似文献   

6.
目的:探讨DNA载体途径的RNA干扰技术抑制肿瘤细胞的作用和机制。方法:设计和构建由U6启动子驱动产生hTERT的siRNA表达质粒,转染至ALVA-41前列腺肿瘤细胞,以TRAP-ELISA方法观察细胞端粒酶活性,W estern-b lot检测端粒酶蛋白的表达,细胞记数法检测对细胞生长的影响。结果:构建的针对hTERT基因的U6表达质粒具有明显的干扰效果,受到特异hTERT-siRNA干扰的ALVA-41肿瘤细胞端粒酶表达下调,细胞生长受抑。结论:应用RNA干扰技术可阻止hTERT基因的表达,抑制肿瘤细胞的增殖。  相似文献   

7.
目的 构建、纯化并鉴定Rac1特异性siRNA的真核表达载体,并在HeLa细胞中初步检测其转染率及对Rac1基因的抑制率.方法 体外合成含针对人、鼠的Rac1特异基因序列的siRNA链,定向克隆至pSUPER质粒中, 对重组质粒进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.将抽提的质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜观察转染效率,荧光定量RT-PCR法鉴定其抑制Rac1基因表达的效果.结果 利用RNAi技术成功构建抑制 Rac1 表达的小干扰 RNA 重组载体,并成功转染到HeLa细胞中(载体转染率达到70%以上).在mRNA水平对Rac1基因的表达产生明显抑制作用(抑制率为87%以上).结论 成功构建了针对Rac1的siRNA真核表达载体,为进一步研究Rac1的功能奠定了基础.  相似文献   

8.
刘学武  沈岚  张健  刘新平 《医学争鸣》2008,29(3):193-196
目的:构建针对转录因子miz1基因的siRNA表达载体,观察其影响HeLa细胞对阿霉素的敏感性.方法:设计并合成针对miz1基因的siRNA寡核苷酸,克隆入siRNA表达载体,脂质体瞬时转染入HeLa细胞中,用RT-PCR检测miz1基因的mRNA表达水平,用 Western Blot检测Miz1蛋白表达水平,用MTT法检测HeLa细胞活力.结果:DNA测序和酶切鉴定证明针对miz1基因的siRNA表达载体构建成功,RT-PCR和Western Blot表明其能降低miz1基因的mRNA表达和蛋白表达. 与对照组相比,转染上述干扰载体后的HeLa细胞,在加入阿霉素12 h后,细胞活力明显降低(P<0.05),并且干扰质粒与阿霉素存在交互作用(P<0.05),以加入阿霉素12 h和24 h后最明显.结论:针对miz1基因的siRNA能够抑制人宫颈癌细胞系HeLa中miz1基因的表达并能增强HeLa细胞对阿霉素的敏感性.  相似文献   

9.
崔飞伦  邱镇  陆洪兵  姚震  林大春 《医学争鸣》2008,29(12):1125-1127
目的:探讨针对转化生长因子β1(TGF-β1)的小干扰RNA(siRNA)对大鼠肾间质细胞系(NEK293)TGF-β1的表达、细胞周期的抑制及细胞凋亡的诱导作用.方法: 利用RNA干扰(RNAi)效应设计针对TGF-β1的不同siRNA,构建表达载体质粒并转染NEK293细胞系.RT-PCR和WesternBlot分别检测TGF-β1 mRNA及蛋白的表达,细胞生长试验和流式细胞观察转染前后细胞周期及细胞凋亡的变化.另设一无意义RNA载体质粒为阴性对照.结果: siRNA转染效率70%,特异性siRNA对TGF-β1 mRNA及蛋白的表达具有抑制作用(P>0.05),实验组细胞生长受到抑制、凋亡增加(P>0.05).结论: 应用RNAi技术可明显抑制TGF-β1的表达,并高效的抑制NEK293的生长、诱导其凋亡.  相似文献   

10.
目的:探讨针对雌激素受体(ERα)分子的RNA干涉对肿瘤细胞生长的影响.方法:人工合成编码siRNA的脱氧寡核苷酸链,经磷酸化后退火连接进pSUPER载体.挑取和扩增序列正确的重组载体,稳定转染Bcap-37细胞后分别以RT-PCR和间接免疫荧光检测mRNA及蛋白质的表达情况, MTT法检测RNAi对细胞生长的影响.结果: siRNA表达载体转染后ERα表达水平明显降低,细胞增殖减慢.结论:针对ERα的RNA干涉可在体外抑制Bcap-37细胞生长.  相似文献   

11.
目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用。方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响。结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长。结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础。  相似文献   

12.
SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
周唏  张鹏辉 《医学争鸣》2005,26(24):2233-2236
目的:利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达,探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时-效关系.方法:设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil—shRNA—hTERT并导入肝癌SMMC-7721细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA—hTERT的细胞株.采用real—time RT—PCR、MTF和PCR—TRAP法同时检测pGenesil—shRNA-hTERT稳定抑制组和未处理SMMC-7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化.结果:在稳定表达pGenesil—shRNA—hTERT的SMMC-7721细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,hTERTmRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制.结论:RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是有潜力的基因治疗肿瘤新方法.  相似文献   

13.
蒋明东  李少林  鄢勇  王正洪  方亮  黄小波  赵渝 《重庆医学》2007,36(20):2052-2054,F0004
目的 利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达,探讨靶向hTERT基因RNAi对肝癌细胞增殖的抑制效应.方法 设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil-shRNA-hTERT并导入人肝癌细胞系QGY细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA-hTERT的细胞株.采用real time RT-PCR、MTT和PCR-TRAP法同时检测pGenesil-shRNA-hTERT稳定抑制组和未处理QGY细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化.结果 在稳定表达pGenesil-shRNA-hTERT的QGY细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,hTERT的mRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制.结论 RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT的mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是潜在的肿瘤基因治疗新方法.  相似文献   

14.
Lu XD  Qin WX  Pan DN  Li JJ  Wan DF  Wen CJ  Li CJ  Gu JR  Yang SL 《中华医学杂志》2004,84(16):1381-1385
目的探讨DNA载体途径的RNA干扰技术抑制肿瘤细胞的作用及机理。方法构建针对人端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)的mRNA干扰质粒PSG-AS及对照质粒PSG-CTR,并将其分别转染HCCLM3肝癌细胞。Western印迹测定hTERT的表达量;末端重复片断扩增-酶联免疫吸附(TRAP-ELISA)方法测定细胞端粒酶活性;流式细胞仪测定细胞凋亡率,MTS法测定细胞生长曲线以观察PSG-AS对细胞的生长抑制作用。结果 转染PSG-AS的HCCLM3细胞hTERT表达量减低,端粒酶活性抑制率为76%;PSG-AS转染细胞后凋亡率较PSG-CTR组明显升高(t=11.47,P<0.01),细胞生长受抑。结论PSG-AS作用HCCIJM3肝癌细胞后,通过对hTERT表达量和端粒酶活性的抑制,促进细胞凋亡和抑制细胞的增殖,此法可能成为抑制肿瘤细胞的新途径。  相似文献   

15.
16.
应用载体介导的RNAi技术抑制Bcl-2的表达   总被引:8,自引:0,他引:8  
目的 应用载体介导的RNAi技术特异地干扰抗凋亡基因bcl 2在HeLa细胞中的表达。方法 构建利用H1启动子转录功能性siRNA的载体 ;在H1启动子下游分别插入含不同bcl 2基因特异性序列的 64nt寡核苷酸片段 ;将构建的质粒转染HeLa细胞 ,以间接免疫荧光和免疫印迹检测转染后细胞中Bcl 2的表达水平。结果  3种含不同bcl 2特异性序列的质粒转染后均能干扰该基因在细胞中的表达 ,但干扰的效果存在差异 ,从 45 %~ 83 5 %。结论 本研究建立的载体介导的RNAi技术可成功地用于干扰Bcl 2在HeLa细胞中的表达  相似文献   

17.
目的 探讨采用体外化学合成的小干扰RNA(siRNA)结合阳离子脂质体是否能有效在体转染乳腺癌细胞,以期为RNAi的在体实验研究提供实验数据和理论依据.方法 (1)建立裸鼠肿瘤动物模型,计算成瘤率.(2)体外转染乳腺癌细胞,常规动物接种,测量肿瘤体积和动物重量,计算肿瘤抑制率.(3)采用免疫组化和Western blotting技术测定肿瘤组织的表皮生长因子受体蛋白水平,采用Real-time PCR检测表皮生长因子受体基因水平,采用ELISA检测动物血清及肿瘤抽提蛋白中EGF含量.结果 MDA-MB-231、ZR-75细胞成瘤率依次为30.00%、88.89%,MDA-MB-231细胞的成瘤能力明显弱于ZR-75细胞.ELISA检测结果证实dsRNA-表皮生长因子受体可将血清及肿瘤组织抽提蛋白中的EGF含量分别降低16.77%、12.59%.Real-time PCR结果表明dsRNA-表皮生长因子受体可将表皮生长因子受体基因表达下调21.05%.结论 (1)采用体外化学合成的siRNA结合阳离子脂质体可有效在体转染乳腺癌细胞.(2)在体实验中RNAi效应持续的时间明显长于体外实验.(3)针对表皮生长因子受体基因序列设计的siRNA可作为极具开发前途的抗肿瘤新药,其在体实验中触发RNAi可能的作用机制尚需进一步深入探讨.  相似文献   

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