成人骨髓间质干细胞基本生物学特性

【目的】研究成人骨髓间质干细胞 (MSC)基本生物学特性。【方法】采用Ficoll Paque淋巴细胞分离液分离成人MSC ,体外扩增 ,比较不同培养基和血清含量对MSC生长的影响 ,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达。【结果】成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得 (5～ 6 )× 10 5个细胞 ,15代可获得 (3～ 4 )× 10 12 个细胞 ,随着传代次数的增加 ,细胞的增殖能力下降。L DMEM培养基有利于细胞的培养扩增。细胞流式细胞仪检测结果显示CD2 9、CD4 4、CD5 9、CD10 5、CD16 6表达阳性 ,CD11a、CD14、CD33、CD34、CD4 5、CD38、CD80、CD86、CD117表达为阴性。【结论】MSC有很强的自我更新能力 ,在组织工程中具有广阔的应用前景     

培养基对兔骨髓间充质干细胞体外扩增的影响

目的考察含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基(DMEM HG, 10％FBS)、10％胎牛血清的低糖DMEM培养基(DMEM LG,10％FBS)、15％胎牛血清的低糖DMEM培养基(DMEM LG, 15％FBS)、20％胎牛血清的低糖DMEM培养基(DMEM LG, 20％FBS)对兔骨髓间充质干细胞体外贴壁、扩增的影响。方法① 选2月龄的新西兰大白兔,股骨转子间区抽取骨髓利用密度梯度离心贴壁法分离纯化细胞,体外培养。选取传代第一代骨髓间充质干细胞 (passenger one, P1)分别用以上4种细胞培养基培养,测细胞扩增倍数;② 选取传代第二代骨髓间充质干细胞(passenger two, P2)分别将以上4种细胞培养基混悬液接种于24孔板中,观察细胞生长状态并测生长曲线;③ 选取4种培养基中培养效果最好的一组细胞,以密度0.5×104/mL接种于24孔板中,成骨诱导,茜素红染色测其矿化能力。结果DMEM LG(15％FBS) 组中细胞扩增倍数为(16.20±1.60)倍,细胞集落形成数为6.11±1.17,与其它组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,并矿化能力最强。结论DMEM LG (15%FBS)培养基较其他3种培养基更符合兔骨髓间充质干细胞体外扩增培养的条件,且更好的保持了细胞的正常形态和生物活性。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养与扩增实验研究

目的探讨脐血来源的人间充质干细胞（HMSCs）在体外分离培养与扩增的可行性。方法在无菌条件下收集正常足月胎儿的脐带血,经复合枸橼酸钠抗凝,用相对密度为1．077g／L的Ficoll淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以30％胎牛血清进行培养和扩增,用流式细胞仪检测MSCs的表面标志。结果来源于人脐血的单个核细胞接种于特定培养基后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞,经传几代后,可得纯化扩增的人脐血MSCs。流式细胞仪检测结果显示,人脐血MSCs不表达GD14、CD19,强表达CD105、CD44。结论来源于人脐血的MSCs在体外可以分离培养、扩增,为MSCs的进一步研究奠定基础。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养

目的：建立分离纯化、快速扩增大鼠骨髓基质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的方法。方法：用全骨髓接种贴壁法,培养分离纯化大鼠BMSCs,传代扩增、测定生长曲线和贴壁率,形态学观察、免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原。结果：全骨髓贴壁法能有效分离纯化大鼠BMSCs,细胞在10%胎牛血清BMSCs培养基中生长状态稳定,第2代细胞生长曲线呈S型、第2、4、6代贴壁率基本相同,贴壁速度无显著性差别,p〉0.05。CD29、CD44和CD90免疫组化鉴定细胞均呈阳性。结论：全骨髓接种贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMSCs,在含10%胎牛血清的BMSCs培养液中,细胞稳定扩增,可能与细胞培养微环境良好有关。     

成人骨髓间充质干细胞体外培养扩增及其生物学特性研究

目的 建立成人骨髓间充质干细胞 (MSCs)体外培养和扩增的条件 ,探讨其生物学特性。方法 取正常成人骨髓用含10%胎牛血清的LG -DMEM培养液培养、扩增后 ,进行透射电镜观察 ,流式细胞仪行细胞表面抗原及细胞周期分析检测。结果 培养扩增获取的成人骨髓MSCs形态均一 ,增殖能力强 ,细胞扩增至第5代细胞数达 (2～3)×108。该类细胞CD29、CD44、CD166表达阳性 ,CD14、CD34、CD45、HLA -DR表达阴性。细胞周期以G0/G1 期为主。细胞胞浆具丰富粗面内质网。结论 所建立的分离和培养方法可获取骨髓粘附细胞中一组独特的细胞群 ,具有MSCs的生物学特性。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的改进

目的：对人骨髓间充质干细胞(Mesenchvmal stem cells，MSCs)的体外分离纯化、培养扩增方法的改进，为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础方法：抽取人骨髓细胞，采用密度梯度离心结合贴壁培养法进行分离纯化，并传代扩增，测定生长曲线和贴壁率，形态学观察，流式细胞仪检测其表面抗原表达。结果：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，MSCs在含胎牛血清的L—DMEM培养液中生长性状相对稳定，细胞基本呈成纤维细胞样生长，1、3、5代细胞生长曲线、贴壁率基本相同，贴壁存活率高，表达CD29、CD44、CD105、CD166。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，在含胎牛血清的L-DMFM培养液中，细胞稳定扩增。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学特性的研究

目的研究人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养条件,并探讨其生物学特性。方法取无恶性血液病的32~65岁的成人骨髓7例,经密度梯度离心得到单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,将细胞的密度调整到1×106个/mL,接种到12孔培养板中(1 mL/孔)进行培养,48 h后更换新鲜培养液,以后每3 d换液1次。当细胞铺满培养板底90%以上时,按常规方法进行细胞传代培养。用流式细胞术检测培养细胞的CD29、CD44、CD166、CD105、CD34、CD45、HLA-DR表达情况。并且使用脂肪细胞诱导培养液诱导培养MSCs,油红O染色检测其能否被诱导分化为脂肪细胞。结果成人骨髓接种后24 h内细胞开始聚集成细胞集落,并从集落中长出少许长梭形细胞,6~15 d细胞进入快速增殖期,一般培养20~25 d后细胞汇合成片铺满培养板底;而传代培养的细胞每代约需10~15 d即可铺满瓶底。流式细胞术检测结果显示,此次培养的骨髓来源细胞高表达CD29、CD44、CD166、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR,符合骨髓MSCs细胞的特性。油红O染色显示MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。结论用密度为1.077 g/mL淋巴细胞分离液作为分离液,密度梯度离心法分离培养的人骨髓MSCs增殖力强,操作简单,是一种较好的分离和培养MSCs的方法。MSCs可以被诱导分化为脂肪细胞。     

全骨髓贴壁改良法分离培养人骨髓间充质干细胞及标记鉴定

目的对比、探求分离培养人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）的方法,探讨hMSCs鉴定和标记的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法采集成人健康志愿者骨髓5mL,全骨髓贴壁法、全骨髓贴壁改良法、密度梯度离心法分离纯化、培养和扩增,获得hMSCs,对比三种方法。＂慢冻速融＂的原则进行细胞冻存、复苏。流式细胞术检测hMSCs的表面标志。hMSCs经5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）标记,免疫细胞化学法测定并评估。结果 hMSCs运用三种方法均可获得,比较全骨髓贴壁改良培养法最为方便高效分离获取hMSC、体外扩增迅速。流式细胞仪检测结果显示：CD44阳性及CD71弱阳性,表达率分别为95.05%,78.86%;CD34、CD45阴性,表达率分别为3.40%,2.88%。Brdu最佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72 h。结论 hMSCs采取全骨髓贴壁改良法进行较好的纯化和扩增,Brdu标记可用于hMSCs的生长和分化的动态示踪观察。有望建立hMSCs库,为组织工程、细胞移植研究打好基础。     

羟乙基呱嗪乙硫磺酸对人骨髓间充质干细胞纯化培养的影响

目的：探讨羟乙基呱嗪乙硫磺酸对人骨髓间充质干细胞(hMSC)纯化培养的影响。方法：采用全髓直接接种法分离培养13～18周胎龄水囊引产新鲜胎儿股骨骨髓，贴壁细胞达90％以上融合时消化传代。传代细胞分别接种于含100ml／L胎牛血清的L-DMEM培养基(常规培养基)和加入15mmol／L羟乙基呱嗪乙硫磺酸(Hepes)的常规培养基(改良培养基)中，观察细胞生长情况，用酸度计监测培养基pH值变化情况，流式细胞仪鉴定细胞纯度及CD抗原表达情况。并诱导改良培养基培养的hMSC向成骨细胞分化，酶细胞化学法和全自动生化仪检测碱性磷酸酶(ALP)活性，鉴定hMSC的成骨分化能力。结果：2种培养基培养的hMSC在细胞形态、生长特性、CD抗原表达等方面相似，但改良培养基由于pH值较恒定而能提高hMSC纯度及细胞增殖速度，且诱骨分化后可形成矿化结节，ALP染色阳性。结论：Hepes能提高全髓直接接种法培养的hMSC纯度及细胞增殖速度，简化骨髓细胞分离程序，减少细胞损伤及受污染机会，利于hMSC培养的推广应用。     

人脐血间充质干细胞的改良分离培养

目的探讨人间脐血来源的充质干细胞在体外分离培养与扩增的方法。方法用重力离心-密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离细胞,用含15%FBS的DMEM低糖培养基培养并传代,流式细胞仪检测P3代间充质干细胞的表面标志。结果脐血来源的单个核细胞24 h即开始贴壁,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞。经自然纯化法传代后,可得到形态单一的长梭形间充质干细胞。流式细胞仪检测结果显示该细胞表达CD44。结论脐血来源的MSCs可以在体外分离培养和扩增,细胞表面标记与骨髓来源间充质干细胞一致。