血管紧张素Ⅱ受体基因敲除对跨膜钙内流的作用

目的　观察血管紧张素Ⅱ受体亚型 (AT1a)基因敲除对跨膜钙内流的影响。方法　培养AT1a基因敲除及其野生型对照小鼠的主动脉血管平滑肌细胞 (VSMC)和应用荧光倒置显微镜及钙荧光指示剂Fura 2 /AM动态观测VSMC的钙离子 [Ca2 ]i变化。结果　在血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )刺激下钙内流显著增加 ,AT1a 敲除组VSMC钙净增值为 ( 2 0 4± 2 2 )nmol/L、基础 [Ca2 ]i为 ( 10 8± 9)nmol/L野生型对照VSMC钙净增值为 [( 194± 19)nmol/L ,基础 [Ca2 ]i为 ( 110± 7)nmol/L](P <0 0 1) ,应用钙通道阻滞剂硝苯啶和三磷酸鸟苷 γs能明显抑制AngⅡ介导的细胞钙增加 ,但G抑制蛋白的阻断剂百日咳毒素却能明显增强AngⅡ介导的细胞钙增加。结论　AT1a基因敲除后 ,AngⅡ介导的钙内流主要通过L 型钙通道 ,并受百日咳毒素的调节。     

犬骨髓间充质干细胞体外诱导分化的平滑肌细胞的组织培养及鉴定

目的：应用条件培养基体外诱导成年犬骨髓间充质干细胞分化为平滑肌细胞,探讨其作为构建组织工程血管种子细胞的可行性。方法：应用DMEM添加PDGF-BB和维生素C(VIT-C)体外培养通过密度梯度离心法得到的骨髓单核细胞,通过形态学观察鉴定培养的细胞,采用免疫荧光法检测4～6代细胞中平滑肌细胞特异性标记α-肌动蛋白（α-SMA）和肌球蛋白重链SMMHC,应用流式细胞术检测第5、6代细胞中平滑肌细胞的阳性率。结果：犬骨髓间充质干细胞在条件培养基的诱导下稳定传代至第6代后达到种子细胞的种植数量10⁷～10⁸,单独DMEM培养需要42　d,添加PDGF-BB/VIT-C后时间减少为33　d。细胞免疫荧光结果提示,大部分细胞α-SMA阳性、SMMHC阴性;流式细胞术结果显示,第5、6代细胞的α-SMA阳性率分别为57.8%和66.8%。结论：体外条件培养基能诱导犬骨髓间充质干细胞增殖分化为平滑肌细胞,并可作为组织工程血管构建的种子细胞。     

舒缩血管物质对肺动脉平滑肌细胞膜电位、胞浆及线体Ca2+的作用效应

目的:观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和一氧化氮(NO)对肺动脉平滑肌细胞膜电位、胞浆钙离子浓度([Ca2+]i)和线粒体钙离子浓度([Ca2+] mit)的影响.方法:肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterysmooth muscle cells,PASMCs)分别负载相应的荧光探针:胞浆钙荧光指示剂(Fluo - 4/AM)、细胞膜荧光指示剂(Di -8 - ANEPPS)、细胞线粒体钙荧光指示剂(Rhod -5F),然后给予一定浓度的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和一氧化氮(NO),在激光共聚焦扫描显微镜下,测定[Ca2+]i荧光、细胞膜电位、[Ca2+] mit荧光.结果:AngⅡ基本不影响细胞膜电位,但可一过性引起[Ca2+]i升高,这种[Ca2+]i的升高可导致[Ca2+]mit小幅升高,进而启动线粒体钙离子的释放和[Ca2+] mit的大幅度降低;NO可迅速减弱PASMCs膜电位荧光强度,使细胞处于明显的超极化状态,同时,[Ca2+]i迅速下降,300s时达到最低,并维持在这一水平,[Ca2+]mit也迅速降低,形成低谷平台后迅速回升,并基本稳定于、稍低于初始值的水平.结论:AngⅡ收缩血管可能与线粒体钙释放和[Ca2+] mit的大幅降低有关;NO舒张血管可能与细胞超极化、[Ca2+]i、[Ca2+] mit降低有关.     

脉平对血管紧张素II所致平滑肌细胞基质金属蛋白酶变化的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ在不同浓度和不同作用时间下对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶（MMPs）变化的作用及药物对其影响。方法采用RT-PCR方法检测在血管紧张素Ⅱ不同浓度和不同作用时间下血管平滑肌细胞MMPs的变化和卡托普利、氯沙坦及脉平对其影响。结果血管紧张素Ⅱ可诱导血管平滑肌细胞MMPs的表达,MMP-9表达较MMP-1和MMP-2出现早;应用药物后对血管紧张素Ⅱ的作用有明显的抑制作用。结论血管紧张素Ⅱ具有一定促进血管平滑肌细胞MMPs表达作用,尤其在大剂量作用较明显;脉平可明显抑制血管紧张素Ⅱ的作用。     

骨髓间质干细胞体外增殖及诱导分化成肌样细胞实验研究

目的比较SD大鼠、Wistar大鼠和C57BL/6J小鼠骨髓间质干细胞在体外的增殖及在体外将骨髓间质干细胞诱导分化成肌样细胞的情况。方法体外分离成年SD大鼠、Wistar大鼠和C57BL/6J小鼠的骨髓干细胞,培养增殖,用5-氮杂胞苷诱导分化,使其向肌细胞定向分化。结果SD大鼠和Wistar大鼠的原代骨髓间质干细胞约10 d可达90%以上融合,平均3 d左右传代,C57BL/6J小鼠的骨髓间质干细胞在1周内可迅速增殖,1周后基本处于停滞状态,且细胞集落很少,难传代。SD大鼠的骨髓间质干细胞在含5-氮杂胞苷、两性霉素B和5%马血清的分化培养基作用下,可以分化为肌肉特异性抗原desmin和-αsarcomeric actin染色阳性反应的肌样细胞。结论不同种系的骨髓干细胞在体外用相同的培养基培养,可以具有截然不同的增殖能力;5-氮杂胞苷可以促使骨髓干细胞定向分化为肌样细胞。     

氧化型低密度脂蛋白对骨髓源性平滑肌样 细胞粘附和迁移的影响

 【目的】 建立体外诱导骨髓间质干细胞分化的平滑肌细胞模型,探索骨髓间质干细胞分化的平滑肌细胞在动脉粥样硬化发生发展过程中的作用&#65377;【方法】采用贴壁法从SD大鼠骨髓中分离骨髓间质干细胞(BMSC),运用条件培养基诱导BMSC分化成平滑肌细胞(SMC),采用免疫荧光法分析骨髓间质干细胞及其分化后的细胞特异性标志物&#65377;羟脯氨酸测定法检测两种细胞合成细胞外基质能力,粘附和迁移实验检测两种细胞的粘附和迁移能力&#65377;【结果】 ①分离的BMSC呈长梭形,呈骨髓间质干细胞表型&#65377;经条件培养基诱导分化15 d后,诱导分化的细胞形态呈梭形平滑肌样&#65377;表达平滑肌细胞特异性蛋白标志物α-肌动蛋白(α-SMC)和平滑肌肌球蛋白重链1(SM-MHC1),呈平滑肌细胞表型,命名为骨髓间质干细胞分化的平滑肌细胞(BMSC-SMC)&#65377;②羟脯氨酸测定结果显示,未处理BMSC-SMC合成较高量的胶原,其合成量低于VSMC的合成量,经80 mg/L ox-LDL处理72 h后,BMSC-SMC合成胶原的能力显著降低(P < 0.01)&#65377;③细胞粘附实验结果发现,未处理BMSC-SMC有中等数量的细胞发生粘附,经80 mg/L ox-LDL处理1 h后,BMSC-SMC细胞粘附的数目少量增加,但两者比较差异无统计学意义(P > 0.05);经80 mg/L ox-LDL处理24 h后,BMSC-SMC细胞迁移的数目显著增多,与未处理BMSC-SMC比较,差异具有统计学意义(P < 0.01)&#65377;【结论】 ①经条件培养基诱导培养后,骨髓干细胞表达平滑肌特异性标志物,SMα-SMC和SM-MHC1,提示骨髓干细胞能成功分化成平滑肌细胞&#65377;②骨髓干细胞诱导成平滑肌细胞后,具有血管平滑肌细胞的一些生物学特征,如增殖能力和分泌胞外基质能力,同时保留了骨髓干细胞的一些生物学特征,如高迁移能力,为其在促动脉粥样硬化因素作用下,跨内皮细胞层和增殖的平滑肌细胞层迁移创造了有利的条件&#65377;     

氧化型低密度脂蛋白对骨髓源性平滑肌样细胞增殖的影响

目的 建立体外诱导骨髓间质干细胞(BMSC)分化的平滑肌细胞模型,探索BMSC分化的平滑肌细胞在动脉粥样硬化发生发展过程中的作用.方法 采用贴壁法从SD大鼠骨髓中分离BMSC,运用条件培养基诱导BMSC分化成SMC.采用免疫荧光法分析BMSC及其分化后的细胞特异性标志物.同时从胸主动脉分离血管平滑肌细胞(VSMC)作为对照.80mg/Lox-LDL分别处理两种细胞72h,细胞计数法观察这两种细胞的生长特征,流式细胞术分析细胞生长周期特征.结果 BMSC-SMC能大量蓄积胆固醇酯,形成泡沫细胞,这一表现较主动脉中膜分离而来VSMC更为明显.同时,BMSC-SMC和VSMC细胞的生长曲线大致呈S型,两种细胞的倍增时间分别约为20h和32h.经80mg/Lox-LDL处理后,BMSC-SMC和VSMC细胞的倍增时间分别约为15 h和28 h.结论 在ox-LDL作用下,骨髓干细胞来源的平滑肌细胞增殖明显加快,并形成平滑肌源性泡沫细胞,提示BMSC-SMC可能参与脂质核心的形成,促进动脉粥样硬化的形成.     

血管紧张素Ⅱ对体外人胰岛细胞GLUT-2mRNA表达的影响

目的：探讨血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）对体外人胰岛细胞内葡萄糖转运蛋白2（GLUT-2）mRNA的影响,通过体外实验了解血管紧张素Ⅱ影响胰岛细胞分泌功能的相关分子机制。方法：人胰岛细胞被分成空白对照组,AngⅡ组（100 nmol/L）和氯沙坦组（1μmol/L）,以半定量RT-PCR检测细胞内GLUT-2mRNA的表达情况。结果：在100nmol/L AngⅡ作用下,人胰岛细胞GLUT-2 mRNA的表达显著低下（P〈0.05）;AngⅡ的这种作用,可被氯沙坦部分逆转。结论：AngⅡ可能通过抑制GLUT-2的表达而影响胰岛β细胞胰岛素的分泌。     

大鼠骨髓间充质干细胞向软骨、脂肪和神经元样细胞分化的研究

目的：探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）多向分化潜能。 方法：从大鼠骨髓中获得间充质干细胞,体外培养传代。通过地塞米松、TGF-β1和维生素C诱导rMSCs向软骨细胞分化,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原进行鉴定。通过地塞米松和胰岛素诱导rMSCs向脂肪细胞分化,采用苏丹Ⅳ染色鉴定。在含IBMX、GDNF和IL-1β的培养基中诱导rMSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学方法检测神经细胞特异标志NSE和MAP-2a,b。 结果：rMSCs被诱导7 d后,分化成软骨细胞,甲苯胺蓝异染阳性、Ⅱ型胶原阳性。被诱导10 d后,分化成脂肪细胞,苏丹Ⅳ染色阳性。被诱导7 d和15 d后,分化成神经元样细胞,表达NSE和MAP-2a,b,15 d后NSE阳性率是(20.060±0.790)%,MAP-2a,b阳性率是(17.364±5.738)%。 结论：体外rMSCs被诱导分化成软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞,证明其具有多向分化潜能, 是组织工程研究中最有前途的种子细胞之一。     

间充质干细胞定向诱导为内皮细胞的体外研究

目的:为寻找心血管组织工程新的种子细胞来源,探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力.方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,并体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)的诱导分化培养液定向诱导传代使其向血管内皮细胞方向分化,观察细胞形态的变化,检测内皮细胞特异性标志物的表达.结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后细胞具有内皮细胞的形态学特征,并表达内皮细胞特异性标志物CD31.结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化.     

骨髓问充质干细胞体外培养表达平滑肌肌动蛋白的实验研究

目的观察骨髓间充质干细胞在无诱导因素干预下,自身表达平滑肌肌动蛋白（smooth muscle alpha-actin,α-actinSM）情况。方法采用直接贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,传代培养至第4代时,对间充质干细胞进行鉴定。利用抗α-actin SM荧光抗体,检测间充质干细胞胞质内α-actin SM表达,计算其阳性率。结果骨髓间充质干细胞在无诱导因素干预下,其自身即可表达平滑肌早期特异性标志α-actin SM,阳性率高达44.1%。结论骨髓间充质干细胞体外培养时,无需诱导因素干预,能够自发向平滑肌细胞方向分化。     

人骨髓间充质干细胞的分化与端粒酶活性

目的　研究人骨瞩间充质干细胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ）的分化特性及其端粒酶活性。方法　取人胚胎股　　　　骨骨瞩,分离、培养、扩增ＭＳＣｓ,原位杂交法检测ＭＳＣｓ的端粒酶活性。将ＭＳＣｓ种植于裸鼠皮下,４周后观察ＭＳＣｓ的　　　　分化情况。结果人　ＭＳＣｓ呈端粒酶反应阳性。植入裸鼠体内后可分化成骨、软骨、脂肪、骨骼肌、肌腱样组织和无髓神经　　　　纤维束样结构。结论人ＭＳＣｓ是一种具有多向分化能力的干细胞,具有较高的端粒酶活性。     

兔骨髓间充质干细胞的筛选与体外培养

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)体外分离筛选及扩增的条件 ,同时观察骨髓细胞体外培养的生物学特性。方法 :无菌条件下采集兔骨髓 ,肝素抗凝 ,经淋巴细胞分层液 (相对密度为 1 .0 77)密度梯度离心分离骨髓单个核细胞 ,进而贴壁培养 ,获得MSCs。采用常用细胞培养技术和细胞培养的研究方法 ,观察不同贴壁时间、不同种植密度、有无包被成分及不同蛋白包被培养板对MSCs生长增殖的影响。结果 :预先蛋白包被培养板有利于MSCs贴壁。在细胞生长和增殖方面 ,纤粘连蛋白优于明胶和Ⅰ型胶原 ,以贴壁 48～ 72h ,种植密度 (3～ 9)× 1 0 4 /ml为最适条件 ,有利于梭形细胞形态和快速增殖能力的维持 ,保持成体干细胞的多向分化性。结论 :建立了MSCs体外分离和培养的最适条件 ,为进一步研究MSCs的诱导分化和应用提供了保证     

QY1骨髓多能间质干细胞系向心肌细胞和血管内皮细胞分化

目的:探索QY1骨髓多能间质干细胞系在体外向心肌细胞、血管内皮细胞分化的能力;优化骨髓多能间质干细胞向心肌细胞分化的体外适宜诱导条件;并初步探讨骨髓间质干细胞向成心肌成血管细胞分化的能力.方法:分别用5-氮胞苷、血管内皮生长因子对QY1骨髓多能间质干细胞进行定向诱导分化.利用免疫组化、RT-PCR鉴定分化后的细胞.结果:在传代培养至72 h时,加入10 μmol/L5-氮胞苷诱导24 h后换液培养,以后每7 d换液1次,培养14 d进行再次诱导的条件下,细胞能出现自发性搏动的心肌细胞和肌管样结构,诱导率达(39.47±0.56)%.心肌特异性的表面抗体α-横纹肌肌动蛋白、心肌连接蛋白-43表达阳性,RT-PCR检测有心肌特异性因子α-肌球蛋白重链表达.在用血管内皮生长因子诱导48 h后,出现呈直线排列的血管内皮细胞;7 d后,有部分区域细胞相互连接呈血管内皮细胞网状;14 d时免疫组化检测,发现诱导后的细胞血管内皮特异性表面抗体CD31和Ⅷ因子表达阳性.结论:QY1骨髓多能间质干细胞系细胞在体外特定条件下具有分化为心肌细胞和血管内皮细胞的能力.     

兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究

目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。     

骨髓间充质干细胞的分离鉴定及向血管内皮细胞诱导分化过程中microRNA126 的表达

目的 建立分离大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)及将其定向诱导分化为血管内皮细胞(endothelial cells,EDCs )的方法,并通过观察microRNA126的表达规律初步探索其在定向分化中的调控作用。方法 通过反复贴壁及人工分选方法进行大鼠骨髓MSCs的体外分离纯化及扩增,运用免疫荧光法检测MSCs中CD34、CD105和CD73 的表达。应用MEF诱导分化培养液将MSCs定向诱导分化为EDCs,采用qRT-PCR法检测细胞诱导分化过程不同时间点EDCs特征基因CD34、血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)及调控小RNA分子microRNA126的表达。结果 经分离纯化的骨髓MSCs CD34呈阴性表达,CD105呈强阳性表达,CD73呈阳性表达,证实骨髓MSCs分离成功,且细胞均一性较好,占细胞总数的90%以上。MSCs定向诱导为EDCs早期分化过程中,在诱导前期第1～4天,VE-cadherin和CD34基因呈阴性表达;第5～6天 VE-cadherin和CD34表达显著;第7～9天,VE-cadherin呈持续阳性表达,而CD34于第7天下降,第8～9天又呈阳性表达。microRNA126在分化过程中的表达趋势与CD34一致。结论 成功建立了骨髓MSCs的分离方法及定向诱导分化为EDCs的方法;microRNA126在MSCs向EDCs的定向分化过程中可能起一定的调控作用。     

人胚胎关节软骨来源的间充质干细胞

目的: 研究从人胚胎关节软骨中分离的细胞的特性、对其表面标志进行鉴定,探讨其多向分化潜能.方法: 从12～20周人胚胎关节软骨中分离细胞,观察细胞的形态、生长状态,采用流式分析的方法对其表面标志进行鉴定并探讨其成骨、成脂、成软骨以及成神经元样细胞的多向分化的潜能.结果:(1)从人胚胎关节软骨中分离的细胞,细胞形态均一,以梭形为主,生长旺盛,可传20代.(2)对不同代的细胞进行流式鉴定,发现其表面标志CD 44、CD 147、CD 90为阳性,CD 34、CD 45、HLA-DR为阴性,与骨髓来源的间充质干细胞的表面标志相似.(3)对其进行成骨、成脂、成软骨、成神经元样细胞的诱导,发现软骨来源的细胞具有多向分化的能力.结论: 从人胚胎关节软骨中可获得间充质干细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究

 目的 分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）,并行多向分化潜能的鉴定。方法 经Percoll梯度分离法获得大鼠骨髓单个核细胞。贴壁培养后,通过倒置显微镜进行细胞形态学观察,并采用流式细胞术进行分析。传至第3代后,分别进行成脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞的诱导,并行免疫组织化学鉴定。结果 骨髓间充质干细胞大小较为均匀,基本上呈梭形或星形的上皮样细胞,传代培养后的细胞体积增大,成纤维样细胞逐渐增多。经反复传代纯化的MSCs检测CD71、CD29呈阳性表达并证实骨髓间充质干细胞经诱导后分化为脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞。结论 在体外,大鼠骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

相互间非接触性共培养对神经干细胞和骨髓基质细胞的影响

目的 观察在神经干细胞培养液下非接触性共培养对骨髓基质细胞和神经干细胞的影响.方法 采用Transwell构建共培养体系非接触性共培养方式培养细胞,进行形态学和免疫化学染色方法观察.结果 共培养组:神经干细胞贴壁、伸出长突起,随培养时间延长,彼此交织成网;免疫组化显示细胞分化为神经元、胶质细胞、少突胶质细胞.骨髓基质细胞则大部分悬浮生长形成大的球状,此球状细胞分化的细胞表达神经元、胶质细胞、少突胶质细胞标志性蛋白.对照组:神经干细胞组细胞仍呈悬浮球状生长;骨髓基质细胞组细胞则部分悬浮生长形成小的球状,部分贴壁生长.结论 在神经干细胞培养液下非接触性共培养,骨髓基质细胞和神经干细胞能相互促进向神经细胞的分化,表明骨髓基质细胞和神经干细胞均可能分泌一些营养因子,为彼此提供一种生存分化的微环境.     

小鼠骨髓源性内皮祖细胞的体外培养及标志物鉴定

［摘要］目的: 探讨小鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）的体外培养、诱导分化及表面标志物的鉴别。方法： 收集ICR小鼠骨髓EPCs,Ficoll分离单核细胞,使用含有血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基培养。分别在细胞培养5,10,15及20 d后检测细胞表面的内皮细胞标志物。结果： 培养5 d后细胞开始出现上皮细胞的形态,有伪足出现;培养10 d,细胞开始增殖,成圆形,出现梭形细胞;培养15 d,细胞出现较为典型的内皮细胞形态,铺路石状;培养20 d,细胞出现长梭形拉网状,即类似成熟内皮细胞形态。免疫荧光染色及流式定量检测结果显示,CD34在EPCs中的表达随培养时间延长有渐变减弱的趋势;血管内皮生长因子受体 2（VEGFR-2）在EPCs的表达随培养时间延长有渐变增强的趋势。结论： 骨髓EPCs在特定诱导条件下可分化出典型的成熟内皮细胞,取材方便,扩增能力较强。