丙型肝炎病毒核心蛋白基因的表达载体构建及在酵母中的表达

目的：为探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心（core）蛋白的功能，在真核生物酵母细胞中表达HCV核心蛋白基因。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV为膜板扩增HCV核心蛋白基因，克隆到pGEM－T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCV核心蛋白基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示了HCV核心蛋白在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在，分子量22000ku左右。结论：HCV核心蛋白在酵母中表达成功。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建及其在HL-7702细胞中的高效表达

目的：构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A基因的真核表达载体，并在正常人肝细胞株(HL-7702细胞)中进行表达，为今后研究HCV NS5A蛋白功能奠定基础。方法：从含HCV NS345序列的重组质粒pCDNA3.1（+）/ NS345中扩增出HCV NS5A基因片段，构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒。用脂质体将其转染HL-7702细胞，通过Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白。结果：用PCR方法扩增的HCV NS5A基因全长1 344 bp,与PGEM-T重组，测序证实所克隆的NS5A基因片段大小正确；成功地构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒，瞬时转染HL-7702细胞表达NS5A蛋白，Western blotting印迹法显示其相对分子质量约为56 000。结论：HCV NS5A的真核表达载体pCI-neo/ NS5A在HL-7702细胞中能有效表达NS5A蛋白，NS5A蛋白可导致病毒复制、肝细胞癌发生，且NS5A区为IFN敏感性决定区。     

稳定表达丙肝病毒EGFP-CORE融合蛋白细胞系的建立

目的：构建可表达丙型肝炎病毒（HCV）EGFP-CORE融合蛋白的真核表达载体，获得重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系。方法：克隆HCV核心抗原基因于真核表达载体pEGFP-C1中，脂质体法转染QSG7701细胞后，荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测EGFP-CORE融合蛋白的表达。再经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系。最后用Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果：成功构建真核表达载体pEGFP-C1／CORE；建立了重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系。结论：重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系可表达EGFP-CORE，为以CORE基因作为靶位的抗HCV感染研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒ns5b基因的克隆、表达及鉴定

目的：构建HCV ns5b基因的重组原核表达质粒，并获得NS5B蛋白的高效表达，为制备抗NS5B抗体及以其为靶位的抗HCV感染研究创造条件。方法：利用PCR技术扩增HCV ns5b基因，Xho I和Kpn I双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pRSETA上，转化大肠杆菌JM109菌株，获得阳性重组质粒pRSETA-ns5b，阳性质粒转化BL21(DE3)，IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Western Blot电泳进行鉴定，并以薄层扫描分析对其定量。结果：成功构建了HCV NS5B蛋白表达载体pRSETA-ns5b，经诱导明显表达出6His-NS5B融合蛋白，表达产物主要以包涵体形式存在，表达量占菌体蛋白25％，Western—Blot结果显示表达蛋白保持活性。结论：HCV NS5B蛋白在体外得到了有效表达。     

食管癌相关基因2原核表达质粒的构建与诱导表达

目的：构建食管癌相关基因2（ECRG2）原核表达质粒，在大肠杆菌（E．coli）中诱导表达重组蛋白。方法：用聚合酶链反应法扩增ECRG2基因开放阅读框（ORF），构建表达载体pGDX-4T-1-ECRG2，测序鉴定后转化E．coli（BL21）进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，目的蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、Western免疫印迹鉴定。结果：SDS-PAGE测定GSr／ECRG2蛋白分子质量约34ku，Western blot验证出目的蛋白特异表达。结论：ECRG2ORF插入pGEX-4T-1质粒并在E．coli中成功表达。     

Sjcb2基因原核表达载体的构建及表达

目的 探讨日本血吸虫（Schistosoma japonicum，Sj）中国大陆株（Chinese strain）组织蛋白酶B肽链内切酶基因（Cathepsin B endopeptidase）的原核表达载体pWR450-1的构建及表达情况。方法根据Genbank中Cathepsin B endopeptidase全序列（Genbank登录号为AY226984）设计特异性引物应用聚合酶链反应技术扩增基因全长，克隆入pUCm—T载体，酶切后亚克隆入原核表达载体pWR450-1并进行表达；利用SDS—PAGE及Western blotting观察日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶表达情况。结果成功构建了Sjcb2／pWR450-1原核表达重组质粒，该重组质粒在大肠杆菌中可经IPTG诱导表达分子量约为86kD的融合蛋白，Western blotting分析表明，该融合蛋白能被兔阳性血清所识别。结论 日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶可在原核表达载体pWR450-1中表达，为研究其功能打下了必要的基础。     

丙型肝炎病毒NS3基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的真核表达载体,并分析其在HeLa细胞中的表达。方法:以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因,将其插入克隆载体pMD18-T中,鉴定后与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,用脂质体介导法转染HeLa细胞,间接免疫荧光法及Western blot鉴定转染后HCVNS3蛋白的表达。结果:PCR扩增的NS3序列正确,构建的真核表达载体成功转染HeLa细胞,表达的NS3蛋白相对分子量为70kD。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/NS3,并在HeLa细胞中获得表达。     

在酿酒酵母中表达人血清白蛋白

目的：利用酵母表达系统表达人血清白蛋白（HSA）。方法：用PCR方法扩增HSAcDNA,利用限制性内切酶将含HSA片段定向插入酵母表达质粒pYET中构建分泌型重组表达载体pYET-HSA,通过DNA测序确定构建的融合蛋白基因序列的正确性。用重组质粒转化酿酒酵母感受态细胞,在亮氨酸营养缺陷型培养基上筛选含重组质粒的酵母转化子菌落。培养转化子酵母,表达HSA,经十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶（SDS．PAGE）和Westernblot检测表达情况。结果：DNA序列分析显示,编码外分泌型HSA的基因构建成功。免疫印迹和SDS．PAGE检测结果显示,pYET-HSA酵母转化子可在非诱导条件下表达分泌型可溶性HSA。结论：在酿酒酵母中成功表达HSA。     

桥粒芯胶蛋白3前导肽基因的克隆和原核表达

目的：克隆人桥粒芯胶蛋白3前导肽(Dc3p)基因，并进行表达、纯化和鉴定。方法：用PCR法从桥粒芯胶蛋白(Dc)cDNA文库中扩增出Dc3p基因，与pGEX-4T-2载体连接成重组表达质粒pGEX-4T-2／Dc3p；重组质粒转入B121大肠杆菌：经诱导表达谷胱甘肽S-转移酶-Dc3p(GST-De3p)融合蛋白，该蛋白经Glutathione Sepharose4B亲和层析柱纯化，SDS-PAGE和免疫印迹法检测鉴定。结果：经酶切及序列分析鉴定，重组质粒pGEX-4T-2／De3p成功构建，诱导后高表达GST-De3p融合蛋白并得到纯化，免疫印迹法证实表达蛋白为Gsr-Dc3p。结论：获得高表达、高纯度的GST-Dc3p融合蛋白，为De3p的功能及免疫学分析打下基础。     

HCV NS4B表达载体的构建及其对细胞凋亡的影响

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）2a 型非结构蛋白4B（NS4B）的真核表达载体，并观察其对骨肉瘤细胞U2OS凋亡的影响。方法以质粒PJFH1为模板，通过PCR反应扩增4 目的基因片段，采用同源重组法与PCMV-tag2b 载体相连，转化大肠杆菌感受态DH5α，筛选正确的克隆。以脂质体为介导转染U2OS 细胞，通过Western blot 检测NS4B蛋白的表达，免疫荧光检测细胞的凋亡。结果构建pCMV-tag2b-NS4B 重组质粒，经测序其与NCBI 公布的序列完全一致，并可在U2OS 细胞中表达，DAPI 检测显示细胞凋亡率为（17.25±2.5）%，对照组凋亡率为（6.53±2.36）%。结论成功构建NS4B 的真核表达载体，并可在U2OS 细胞中表达，诱导细胞凋亡。     

人卵巢 cDNA 文库中与蛋白激酶 Wee1B 相互作用的候选分子的筛选及其调控作用

目的：利用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Wee1B相互作用的新候选分子,并用生物信息学方法分析其与Wee1B相互作用是否能调控小鼠受精卵早期发育。方法：以pcDNA3.1/V5 His TOPO Wee1B WT质粒为模板构建pGBKT7 Wee1B诱饵质粒;制备酵母感受态细胞,将诱饵质粒pGBKT7 Wee1B转化酵母感受态细胞后分别接种SD/Trp（SDO）、SD/Trp/X α Gal（SDO/X）和SD/Trp/X α Gal/AbA plates（SDO/X/A）培养板检测其对酵母的毒性和自身激活能力,利用Western blotting法检测pGBKT7 Wee1B在酵母中的表达情况;将含有pGBKT7 Wee1B的酵母感受态细胞与人卵巢cDNA文库相融合,利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆,提取阳性克隆的酵母质粒转化大肠杆菌后进行测序鉴定,最终再经酵母重新转化验证。在GenBank中对其进行BLAST分析,根据基因注释推断其在小鼠受精卵发育过程中可能发挥的作用。结果：双酶切鉴定和测序分析,pGBKT7 Wee1B诱饵质粒构建成功。将该质粒转入酵母感受态细胞后在SDO/X/A平皿上无克隆。将pGBKT7 Wee1B和pGBKT7空载体转入酵母感受态细胞中,菌液接种于SDO平皿,2个SDO平皿上克隆都均匀生长。从工作板SDO和阳性对照板上挑取阳性克隆扩大培养,裂解细胞提取蛋白,Western blotting法检测示pGBKT7 Wee1B对应位置出现条带。含诱饵质粒的酵母菌与人卵巢cDNA文库融合,PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。将质粒测序并经BLAST分析筛选出9个与Wee1B蛋白激酶存在相互作用的蛋白,生物信息学分析可能与小鼠卵母细胞发育和受精卵发育密切相关的蛋白。结论：利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选出9个与Wee1B蛋白激酶相互作用的蛋白,这些筛选蛋白可能通过与Wee1B相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。     

酵母双杂交诱饵蛋白RGS4融合表达质粒的构建及鉴定

目的研究糖皮质激素受体各个结构域与G蛋白信号转导负调节因子4（RGS4）之间是否存在相互作用，构建酵母双杂交系统诱饵蛋白融合质粒。方法采用RT-PCR方法扩增RGS4片断全长，酶切回收，将其连接至酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7，构建重组质粒pGBKT7-RGS4，并经酶切和测序等方法鉴定后，使用Y187酵母菌检测重组质粒的自激活现象及毒性。然后，提取酵母总蛋白，采用Western blot方法检测重组质粒在Y187内的表达情况，以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性。结果RT-PCR扩增的RGS4基因片断电泳后，大小正确，重组质粒，pGBKT7-RGS4测序结果与GenBank中RGS4基因序列比对完全正确。重组质粒pGBKT7-RGS4双酶切鉴定、体外转录翻译实验，Western blot等方法均证实重组质粒中的RGS4基因能够正确合成RGS4蛋白。转化酵母后排除重组质粒的自激活作用。结论构建重组质粒pGBKT7-RGS4，能够在Y187内正确表达，可作为酵母双杂交系统诱饵蛋白使用。     

糖皮质激素受体结合域诱饵表达载体的构建及鉴定

目的构建糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）结合域的诱饵表达载体。方法RT—PCR扩增GR结合域，克隆入pMDl8-T，测序正确后，再亚克隆入诱饵载体pGBKT7中，再把构建好的诱饵载体pGBKT7．GR转化到酵母AHl09细胞中，并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况，同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用。结果成功扩增了GR结合域，并分别成功克隆到pMDl8-T和pGBKT7中，测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母AHl09细胞中，无毒性和自激活作用，Western blot分析结果也证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白。结论成功构建了GR结合域的酵母诱饵表达载体。     

乙型肝炎病毒全-X基因的克隆及原核表达

目的:构建乙型肝炎病毒全-X基因原核表达载体并在细菌中表达、纯化. 方法:利用基因重组技术,将全-X基因定向克隆于原核表达载体pET-32a( )多克隆位点中,限制性酶切和测序鉴定. 细菌表达产物及纯化后的产物经SDS-PAGE和Western免疫印迹分析. 结果:经限制性酶切分析及测序鉴定,证实成功构建全-X原核表达质粒. SDS-PAGE和Western免疫印迹分析表明重组质粒在大肠杆菌中表达. 结论:本研究将全-X基因定向克隆于原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达、纯化. 为进一步研究全-X的功能及制备相应抗体奠定了基础.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法：扩增HCV NS5A基因，构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3．1(-)—NS5A；并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3--promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：质粒pcDNA3．1(-)—NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白，共转染实验中pcDNA3．1(-)—NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的3．8倍。结论：构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因，深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据。     

丙型肝炎病毒1bDY株ns5a基因的克隆及其所表达融合蛋白的免疫原性分析

目的:克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因,为进一步研究和应用该基因及其表达产物奠定基础。方法:采用基因重组技术完成实验。设计特异的引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出目的片段,约480bp;将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,再与原核表达载体pET-28a重组;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白表达水平。结果:含有HCV 1b DY株ns5a基因的重组体构建成功,并得以表达蛋白,并且NS5A蛋白具有与HCV患者阳性血清中的多克隆的结合活性,具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV 1b DY株ns5a基因,为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造条件。     

丙型肝炎病毒NS4B对YAP转录、表达、磷酸化及细胞内分布的影响

目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)细胞内荧光表达质粒,检测NS4B对Yes相关蛋白(YAP)转录、表达、磷酸化及细胞内分布影响。 方法根据现有含有HCV 1b型病毒NS4B完整基因的质粒设计NS4B的特异性扩增引物,扩增NS4B完整序列并构建NS4B荧光质粒,质粒转染进入HEPG2和293T细胞,通过Real-time PCR检测YAP基因转录水平;通过Western blotting检测YAP蛋白表达及磷酸化水平;通过激光共聚焦和核质分离实验检测YAP细胞内分布。 结果成功扩增出NS4B完整序列并构建其荧光质粒;Real-time PCR和Western blotting结果显示,NS4B并不影响YAP的转录和表达水平,但是能够调节其磷酸化水平;激光共聚焦和核质分离试验结果提示NS4B能够调节YAP在细胞质和细胞核内的比例。 结论HCV NS4B可能通过对YAP的影响发挥生物学功能。