线粒体DNA D-loop区多态性与肝癌预后的研究

目的通过对线粒体DNA D-loop区的碱基测序,了解其多态性及突变情况,并探讨其与肝癌发病机率及预后的关系。方法提取49个乙型肝炎后肝癌病人的肝癌组织,癌旁组织和血液中的线粒体DNA,用测序法测定线粒体DNA D-loop区的碱基序列,了解其单核苷酸多态性和变异情况,并分析其与肝癌发病率及2年生存率的关系。结果通过观察发现,肝癌病mt DNA突变情况与肝癌预后无明确相关,而1个SNP位点(核苷酸150C/T)与肝癌的生存期之间存在统计学上的显著差异。经COX回归分析,发现150位点为肝癌预后的独立危险因素;150C的患者生存期显著短于150T的生存期(相对危险度,0.246;95%CI,0.070-0.861;P=0.028)。结论通过分析在线粒体DNAD-loop区的多态性,可以帮助筛别预后不良的肝癌患者。     

胃癌线粒体DNA D-loop区碱基突变的检测分析

目的 研究胃癌患者的癌组织线粒体DNA （mtDNA）D-loop区碱基突变情况,以探讨mtDNA D-loop区碱基突变与胃癌发生发展的相关性.方法 采用聚合酶链反应和DNA测序相结合的方法,对75例胃癌患者癌组织线粒体D-loop 区进行扩增并测序分析.结果 在75例胃癌组织中共有130个位点发生了变化,其中属于基因多态性有101个,基因突变有29个.75例胃癌组织中39例mtDNA D-loop区存在突变,突变率为52%.结论 mtDNA D-loop 区碱基突变可能在胃癌发生发展中发挥重要作用.     

中国保安族线粒体DNA D-环区遗传多态性的研究

目的：以遗传群体为对象，观察线粒体DNA的群体遗传特点，为研究西北少数民族的起源提供科学依据，并为法医学鉴定提供线粒体DNA序列多态性的基础数据。方法：应用PCR扩增产物直接测序法，对98例保安族无关个体线粒体DNA D-环区HVSⅠ进行测序分析。结果：在mtDNA高变区Ⅰ(HVSⅠ)16091～16418之间与Anderson序列比较共发现有66处碱基突变，62个单倍型，碱基突变的主要形式为碱基替代，其中转换87％，颠换11％，碱基插入1％，碱基缺失0．5％．保安族线粒体DNA HVS Ⅰ区基因差异度为0．9862，偶合概率为0.0237。结论：保安族与其他群体比较有其独特的线粒体DNA序列遗传特点，与亚洲其他人种及高加索人种有明显差异。保安族线粒体DNA序列多态性不仅有别于西方人种，也与其他东亚人种不同，线粒体DNA控制区HVS Ⅰ序列多态性可用于法医学个体识别及亲权鉴定。     

乳腺癌中线粒体基因组D环区基因突变的研究

目的 通过检测乳腺癌基因组D环区体细胞突变和种系性变异,探讨其与乳腺癌发生的关系.方法 提取24例乳腺癌患者癌、癌旁组织及外周血细胞总DNA,PCR扩增各组织线粒体DNA(mitoohondrial DNA,mtDNA)基因组D环(D-loop),基因测序后与线粒体文库中的剑桥序列比对,分析突变类型.结果 在24例乳腺癌组织中,共发现91个种系性变异,11例(45.8%)肿瘤发现体细胞突变共19例次,36.8%位于第一高变区,52.6%位于第二高变区.结论 乳腺癌mtDNA D环区具有高度多态性和高度突变率,该区的碱基改变在乳腺癌的形成中可能起重要作用.     

骨髓增生异常综合征患者线粒体DNA D-loop区突变研究

目的检测骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome, MDS）患者线粒体DNA D-loop区的突变。方法提取42例MDS患者骨髓以及口腔上皮组织的线粒体DNA，对线粒体DNA D-loop区两个高变区（HV1和HV2）进行PCR扩增，通过直接测序的方法对PCR产物的基因序列进行检测。结果在42例MDS患者中有6例患者出现突变，突变率为14.29%。突变位点19个，10个位于HV1区，9个在HV2区，其中包括5个微卫星不稳定，其余为A、G或者C、T之间的碱基置换。结论MDS存在线粒体DNA D-loop区的突变，可能在疾病的发生发展中起重要作用。     

犬线粒体DNA高变区Ⅰ(HVRⅠ)的遗传多态性研究

目的为犬线粒体DNA应用于系统进化和法医学物证鉴定提供基础。方法对106只无亲缘关系的犬线粒体DNA高变区Ⅰ（1041—1318）进行测序。结果测序得到了23个单倍型，它们的差异由24个突变点产生，其中包括碱基转换、颠换及插入。大多数突变点是碱基替代，转换为79．2％，颠换为16．7％，碱基插入为4．1％。结论犬线粒体DNA高变区Ⅰ序列，遗传差异度（相当于杂合度）为0．89，两个无关个体的偶合概率为0．1213，具有高度序列多态性。     

胃癌组织线粒体DNA D-loop区的突变及其意义

目的研究胃癌组织中线粒体DNA(mtDNA)D-loop区突变情况及其在肿瘤发生和发展中的作用。方法选择17例胃癌及相应正常胃黏膜组织,应用聚合酶链反应(PCR)对其mtDNA D-loop区进行扩增并测序,将测序结果与线粒体文库中的Revised Cambridge Reference Sequence(rCRS)进行对比分析。结果 17例胃癌组织中共发现mtDNA D-loop区存在175个多态性变异,其中8个(4.6%)为新发现的变异。8例(47.1%)胃癌组织中共发现13次突变;突变热点集中在HV1(23.1%)和HV2(53.9%),并且HV2较HV1更易突变。mtDNA D-loop区突变率与胃癌分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移、病人性别和年龄无关(P>0.05)。结论 mtDNA D-loop区尤其是其中的HV1及HV2是一个具有高度多态性和突变性的区域,在胃癌中突变率较高。     

淋巴瘤组织中线粒体DNA突变的研究

目的 通过检测恶性淋巴瘤组织中线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的突变,以探讨mtDNA突变在恶性淋巴瘤发生中的作用.方法 提取38例恶性淋巴瘤组织及其对应患者外周血白细胞的DNA,经PCR扩增部分mtDNA片段,PCR产物直接测序法测定mtDNA序列.以外周血淋巴细胞测序结果作为对照,确定肿瘤组织mtDNA的突变.结果 18例(47.4%)恶性淋巴瘤组织中发现25个突变,25个突变发生在15个核苷酸位点,其中21个突变位于mtDNA的D-Loop区,4个突变位于mtDNA的编码区,D-Loop发生变异的频率是编码区的4.26倍.13个(13/25,52%)突变位于mtDNA多态性位点.结论 恶性淋巴瘤组织中存在mtDNA的突变,mtDNA突变可能与淋巴瘤的发生、进展有一定关系.     

肝细胞性肝癌线粒体DNA D-loop区基因突变的研究

目的 研究肝细胞性肝癌组织线粒体DNA D-loop区基因的突变情况.方法 选择40例肝细胞性肝癌组织和其相应癌旁组织,取对应患者外周静脉血,提取线粒体DNA后进行PCR扩增和测序.结果 40例肝细胞性肝癌组织线粒体DNA D-loop区中,发生突变16例(40.0%),共发现突变位点34个,其中16个位点为点突变,5个位点发生插入,13个位点发生缺失;另外新发现2个多态性位点.结论 线粒体DNA D-loop区是一个具有高度多态性和突变性的区域,在肝细胞性肝癌组织中突变率较高.     

喉鳞状细胞癌组织线粒体基因D-310区碱基的多态性

目的 探讨喉鳞状细胞癌组织中线粒体基因D310区碱基序列多态性及其临床意义。方珐提取11例喉鳞状细胞癌组织总DNA，利用聚合酶链反应（PCR）对线粒体基因包含D310区的D-LOOP区部分序列进行扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳并直接测序，观察该区碱基序列的改变。结果D310区多态性表现为多聚C保守片段胞嘧啶碱基数量的改变，发生率为8／11（72．73％）。5/8（62．50％）的标本突变是同质性的，3／8（37．50％）标本为异质性突变。共检测到6种不同的序列改变，以单个胞嘧啶的插入最常见，约占全部序列改变的50％。结论在喉鳞状细胞癌组织。D310区具有明显多态性，是突变的多发区域之一。     

免疫组织化学法检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体突变

目的： 采用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)常见的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变,并对IHC检测的敏感性、特异性和 成本-效益进行评估。方法：应用PCR和IHC检测208例NSCLC患者的EGFR突变情况。用全自动免疫染色仪检测两 种针对最常见突变的特异性抗体,即EGFR外显子19的缺失突变(19del突变)抗体(克隆号SP111)和外显子21的L858R 突变抗体(克隆号SP125)。同时构建成本-效益模型进行最优检测方案分析。结果：以IHC 1+为阳性阈值,与PCR检 测相比较,IHC检测的总体敏感性和特异性分别为81.7%(95% CI：72.4%~89.0%)和94.7%(95% CI：92.6%~99.5%); SP111 抗体检测 EGFR 19del 突变的敏感性为 65.9%(95% CI：49.4%~79.9%),特异性为 98.8%(95% CI：95.7%~ 99.9%);SP125 抗体检测 EGFR L858R 突变的敏感性为 94.2%(95% CI：84.1%~98.8%),特异性为 99.4%(95% CI： 96.5%~100%)。在本研究的患者群体中,当IHC和PCR的成本比达到1?3或差距更大时,优先使用IHC检测EGFR突 变是合理的。结论： IHC检测NSCLC常见的EGFR突变具有良好的特异性和较好的敏感性。在中国人群中,当IHC 和PCR的成本比为1?3或差距更大时,优先采用IHC方法检测EGFR突变是经济有效的。     

p53基因在涎腺多形性腺瘤发生中的基因序列突变

目的 检测腺多形性腺瘤ｐ５３基因第７、８外显子的碱基突变,探讨该瘤的发生及生物学特征。方法 从手术标本中选择涎腺多形性腺瘤１４例。采用聚合酶链反应－单链构象多态性分析技术及ＤＮＡ核酸序列测定方法对涎腺多形性腺瘤７例第７外显子异常者。３例第８外显子阳性者。５例第７外显子ＳＳＣＰ（其中３例第８外显子ＳＳＣＰ也呈阳性）的肿瘤进行核酸序列测定。结果 发现ＳＳＣＰ阳性的肿瘤相应的外显子碱基序列已发生变化。第     

外周血检测中国非小细胞肺癌患者EGFR基因突变的Meta分析

目的通过Meta分析探讨检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因突变的临床价值。方法2位研究者按照相同的检索策略分别进行独立检索,根据纳入标准与排除标准进一步筛选。确定纳入文献后使用Meta-DiSc 1.4和RevMan 5.1软件进行分析,分析指标包括敏感度、特异度、诊断优势比（DOR）。结果筛选后共纳入13项研究,包括1 105例研究样本。Meta分析结果显示,汇总后的敏感度为66%(95%CI=0.61~0.71,I2=81.6%);特异度为96%(95%CI=0.94~0.97,I2=61.9%),Spearman相关系数为-0.022,P=0.943,不存在阈值效应;DOR为54.78(95%CI=28.11~106.75,I2=31.2%)。SROC曲线分析AUC=0.963 1,Q*=0.909 1。结论外周血代替组织进行EGFR基因突变检测的特异度高而敏感度低。外周血尚无法完全替代肿瘤组织进行EGFR基因突变检测,但可以成为组织检测的有效补充。但当外周血检测提示EGFR基因突变阴性时,应充分考虑到可能产生的漏诊。     

应用HRM法检测肺癌患者循环DNA中表皮生长因子受体基因突变

目的 探讨高分辨熔解曲线(HRM)法检测肺癌患者血浆循环DNA中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的可行性.方法 采用HRM法对含不同比例EGFR基因突变型质粒的系列混合样本进行检测,以评价其灵敏度.应用HRM法检测2009年9月至2010年5月收治的96例肺癌患者血浆循环DNA中EGFR基因19、21外显子突变状况,并与基因测序法的结果比较分析.结果 HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为5%的突变,其检测灵敏度达5%.经HRM法,在96例肺癌患者中检测出17例发生了EGFR突变,突变率为17.7%,其中外显子19和21突变分别占88.2%(15/17)和11.8%(2/17);经基因测序法验证,结果完全一致.结论 HRM法检测EGFR简单易行,快速,敏感性较高,可作为临床EGFR突变筛查的优选方法.

Abstract：

Objective To discuss the practicability of detecting epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in plasma circulating DNA of lung cancer patients by high-resolution melting (HRM).Methods The sensitivity of HRM was analyzed by the detection of samples containing different proportions of EGFR-mutated plasmids.The mutations in exons 19 and 21 of EGFR were detected by HRM in 96 lung cancer patients from September 2009 to May 2010.And the results of HRM were compared with those of sequencing.Results The HRM detection could identify the EGFR mutations in a proportion of 5% of mutated plasmid DNA.And the EGFR mutations were detected in 17 (17.7%,17/96) cases.Among which,the number of exons 19 and 21 mutations was 15 (88.2%,15/17) and 2 (11.8%,2/17)respectively.The results of sequencing were consistent.Conclusion The HRM analysis may be an optimal method for clinical screening of EGFR mutation due to its simplicity and promptness with a high sensitivity.     

粪、血APC及K-ras基因突变联合检测在大肠癌筛查中的作用

目的 通过联合检测粪、血浆中APC和K-ras两种基因的突变,探讨其在大肠癌筛查中的作用.方法 收集本院2003年10月～2004年3月行肠镜检查患者的肝素抗凝血5 ml,大便3～5 g.提取粪便及血浆DNA,采用PCR-SSCP法检测APC和K-ras突变.结果 和结论(1)大肠癌和腺瘤患者血浆APC基因突变分别为41.9%和57.7%(P＞0.05),高于正常对照组(P＜0.05).粪便APC基因突变分别为51.6%和42.3%(P＞0.05),高于正常对照组(P＜0.05).两种检测方法具有高度的吻合度(kappa值为0.811,P＜0.001).(2)血浆K-ras基因突变在大肠癌、腺瘤和正常对照分别为48.4%、3.8%和0%,粪便K-ras基因突变在3组中分别为54.8%、7.7%和11.1%,大肠癌组高于腺瘤组和正常组(P＜0.05),腺瘤组和正常组间无差异(P＞0.05).两种方法检测的吻合度一般(kappa值为0.662,P=0.000).(3)联合检测APC及K-ras基因突变可以提高诊断大肠癌的灵敏度.血、粪联合检测检测APC和K-ras基因突变较粪便检测无明显优势.(4)APC基因突变与是否发生肿瘤区域淋巴结转移有关,K-ras基因突变与病变分化程度有关.     

HBV P基因YMDD变异的检测及临床应用的初步研究

目的采用错配PCR扩增方法进行HBVP基因YMDD变异的检测，对其临床意义进行初步的研究。方法应用分子克隆方法，构建YMDD、YVDD和YIDD变异的阳性质粒，并对该方法进行敏感性及特异性试验。对65例未经抗病毒治疗的乙型肝炎患者检测YMDD变异情况。结果经PCR方法、酶切鉴定及直接测序鉴定出YMDD、YVDD和YIDD质粒构建成功，且该方法具有较好的敏感性和特异性。65例未经拉米夫定治疗的乙型肝炎患者存在YMDD变异，出现变异6例，阳性率为9．07％；其中YIDD和YI／YMDD各1例，YVDD3例，YV／YMDD1例。结论本检测方法简便、实用，在未经抗病毒治疗的患者中可存在YMDD变异，其与野生株一样是自然存在的，抗病毒药物压力不是导致HBV YMDD变异的唯一因素。     

聚合酶链反应技术在腓骨肌萎缩症基因诊断中的应用

目的 探讨应用聚合酶链反应（ＰＧＲ）技术建立中国人腓骨肌萎缩症（ＣＭＴ）基因诊断的方法。方法 分别应用ＰＣＲ－双酶切、聚合酶链反应－单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）、聚合酶链反应－变性梯度凝胶电泳（ＰＣＲ－ＤＧＧＥ）或ＰＣＲ直接测序等方法对３２个确诊的ＣＭＴ家系进行了ＰＭＰ２２、ＭＰＺ、Ｇx３２等致病基因的突变检测。结果 ２１．９％的ＣＭＴ家系患者有Ｇx３２、ＭＰＺ和ＰＭＰ２基因的突变。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测到１０个家系有异常泳带,经ＰＣＲ测序证实有５个为多态;另５个为与疾病相关的致病的点突变,即４个Ｇx３２和１个ＭＰＺ基因的点突变。PCR-双酶切诊断了２个包含ＰＭＰ２２基因在内的大片段重复突变的ＣＭＴ１Ａ型家系。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ仅１个家系患者异常泳带,该结果也可经ＰＣＲ－ＳＳＣＲ方法检出。结论 ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ－双酶切可作为Ｇx３２、ＭＰＺ、ＰＭＰ２２基因的点突变和ＣＭＴ１Ａ的大片段重复突变的初筛的方法,而ＰＣＲ－ＤＧＧＥ方法用于Ｇx３２基因的突变检测不理想,点突变应经ＤＮＡ测序证实。     

利用多重数字PCR检测KRAS相关突变

 目的 建立多重数字PCR体系检测血浆细胞游离DNA(cell-free DNA, cfDNA)中KRAS第2外显子12、13密码子的7种突变。方法 构建7种KRAS突变型质粒用以建立多重数字PCR检测体系,以灵敏度、特异度和动态范围为主要参数评估体系的性能。利用该体系检测15例手术可切除的胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)患者血浆cfDNA中KRAS第2外显子12、13密码子突变情况,并与ARMs的检测结果进行比对。结果 自建的多重数字PCR在0.01%～10%的动态范围内线性良好。两个检测体系的灵敏度分别可达到0.025%和0.043%。15名PDAC患者组织中KRAS突变的阳性率达到100%。数字PCR检测血浆cfDNA所得的结果与组织结果的匹配率达到40%,ARMs检测组织和血浆cfDNA结果的匹配率为20%。15例样本中使用多重数字PCR检测到血浆cfDNA的最低丰度达到0.09%。结论 多重数字PCR具备高灵敏度和特异性,可用于准确定量外周血cfDNA中KRAS相关突变的水平。     

线粒体DNA3316、3394等4个突变位点与2型糖尿病的关系研究

目的:探讨DNA tRNA Leu(UUR)基因及ND-1基因3316 G/A、3394 T/C等4个突变位点与2型糖尿病的关系。方法:对236例海南地区2型糖尿病患者和252例健康对照者进行空腹血糖测定并采用聚合酶链式反应—限制性核酸内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)的分析方法进行mtDNA的3243、3316、3394、和3593共4个位点进行突变筛选,并采用DNA测序方法确证。结果:实验组空腹血糖(9.37±3.01)mmol/L与健康对照组(4.96±0.76)mmol/L差异有统计学意义(P<0.05);实验组检出3316(G→A)突变8例,3394(T→C)突变3例;健康对照组未发现上述突变;突变检测结果与测序一致。两组间3316(G→A)突变率差异有统计学意义(P<0.05)。结论:线粒体DNAtRNALeu(UUR)基因及ND-1基因3316、3394位点的基因突变,尤其是3316位点(G→A)突变可能与某些核基因或环境因素协同促进了2型糖尿病的发生。     

二氢嘧啶脱氢酶基因单核苷酸多态性与结直肠癌患者5-FU化疗毒副作用的关系

目的:探讨二氢嘧啶脱氢酶基因(DPYD)单核苷酸多态性(SNP)与5—氟尿嘧啶(5-FU)化疗毒性反应的相关性,为结直肠癌的个体化治疗提供依据.方法:对60份结直肠癌患者的EDTA抗凝外周血提取基因组DNA后进行实时定量PCR,测定DPYD的14G1A、G2194A、T85C、G1156T和T464A等位点的SNP,并...