不同品系小鼠感染甲型流感病毒肺小血管内血栓形成

目的本实验旨在观察不同品系小鼠感染甲型流感病毒后肺组织内血栓形成的情况。方法使用H1N1病毒A/California/7/2009(CA7)株和H3N2病毒A/Brisbane/10/07株,对BALB/C小鼠、Scid小鼠、NOD/LTJ小鼠、BALB/C-nu小鼠、NOD-Scid小鼠和icosl-KO小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒。检测小鼠感染后肺组织病毒拷贝数并观察肺组织病理学改变。结果 H1N1和H3N2滴鼻攻毒的各组小鼠均染毒,病理表现为程度略有差异的间质性肺炎。13只H1N1病毒感染小鼠和6只H3N2感染小鼠在肺组织中观察到多个小血管内有血栓形成,血栓成分主要为纤维素和血小板。结论各品系小鼠感染H1N1和H3N2流感病毒后均可能出现肺组织内血栓形成。     

甲型H1N1流感病毒感染小鼠的发病机制

目的 甲型H1N1 流感病毒A/California/7/2009感染BALB/c小鼠,研究甲型H1N1流感病毒病毒性肺炎发病机制.方法 4～6 周龄雌性BALB/c 小鼠60只,随机分为2组,实验组和对照组,每组30只.CA7 流感病毒滴鼻制备甲流病毒感染小鼠模型.攻毒后第5天解剖实验和对照组小鼠,取肺组织,测定肺组织中IL-2,IL-6,TNF-α含量.结果 结果实验组肺组织中IL-6,TNF-α,水平明显高于对照组,IL-2水平明显低于对照组,差异均有显著性(P<0.05).结论 IL-6、TNF-α、IL-2这3种细胞因子在感染甲流病毒后的显著性变化与病毒感染后的肺组织病理损伤有密切的关系.     

禽流感H5N1亚型病毒对五个不同品系小鼠致病性的比较

目的 比较了不同遗传背景小鼠对禽流感H5N1亚型病毒的致病敏感性,为H5N1禽流感模型制作和机理研究提供依据.方法 近交系BALB/c、C57BL/6和封闭群ICR、NIH Swiss和KM Swiss共五个不同品系小鼠.每个品系实验动物30只,分接毒组20只,空白对照组10只,每组雌雄各半.病毒株为A/Goose/Guangdong/NH/2003(H5N1),经测定TCID50为10-4.875/mL.接毒组通过鼻腔接种0.1 mL病毒液,对照组接种正常鸡胚尿囊液.小鼠接毒后连续观察14 d,观察记录临床症状、体温、体重变化,对在实验期间死亡和实验14 d结束后仍然存活的小鼠均进行组织器官病理取材,进行RT-PCR病毒分离检测、HE染色及H5N1抗原特异性免疫组化染色.结果 ①临床症状:H5N1禽流感病毒能感染五个品系的小鼠,引起呼吸急促等症状和一过性体重、体温下降.②死亡情况:小鼠在接毒后第1天即出现死亡,死亡的高峰期集中在接毒后第3～6天.五个品系小鼠死亡率存在差异,BALB/c为70%,ICR为50%,NIH Swiss为40%,C57BL/6为25%,KM Swiss为10%;③病毒分离:各组接毒小鼠在死亡后均进行了病毒分离,死亡小鼠的肺脏均分离到病毒,其他脏器未分离到病毒.④病理变化:实验期间五个品系死亡小鼠肺脏病理改变相近.大体观:死亡小鼠肺部淤血,呈暗红色,体积增大,局部肺组织实变.镜下观:死亡小鼠的共同病理改变为间质性肺炎,具体表现为肺泡腔及间质出血、炎性细胞浸润;间质增生,肺泡隔增宽;肺泡腔中见纤维素性渗出,透明膜形成.⑤免疫组化结果:在死亡小鼠的气管上皮细胞和肺巨噬细胞可观察到H5N1禽流感病毒阳性表达.结论 小鼠作为H5N1禽流感病毒模型具有普适性,不同品系小鼠感染鹅源H5N1禽流感病毒的临床症状、病程和病理变化与人禽流感病例相似.不同品系小鼠的死亡比例有明显差别,可以根据不同的实验目的,选择不同品系的小鼠制作H5N1禽流感动物模型.不同品系的遗传特性对禽流感易感性产生明显的影响,遗传背景可能与H5N1禽流感病毒感染应答机理存在联系:BALB/c和C57BL/6均为近交系,其中BALB/c小鼠的品系特征之一表现为干扰素产量低,接种H5N1病毒后表现为高死亡率(70%),而C57BL/6小鼠的干扰素产量高,接种H5N1病毒后表现为低死亡率(25%),提示不同遗传背景小鼠的干扰素水平与H5N1感染致死具相关性.为进一步研究H5N1禽流感病毒易感性相关基因以及其与宿主免疫反应的关系提供了一个研究基础.     

A/California/7/2009与A/California/4/2009病毒感染力比较

目的甲型H1N1流感病毒A/California/7/2009与A/California/4/2009病毒序列比较同源性在99%以上,本实验旨在比较两株病毒感染BALB/c小鼠研究感染力强弱。方法分别将A/California/7/2009(CA7)与A/California/4/2009(CA4)两株病毒分别连续10倍稀释后,对4~6周龄雌性BALB/c小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒,每个稀释度接种10只实验小鼠,测定CA7 MLD50为101.24/0.05 mL,检测小鼠感染、致病的多项指标,观察期为14 d。结果相同TCID50的CA7和CA4病毒感染小鼠,CA4感染小鼠后14 d内死亡率为20%,而CA7感染小鼠后8 d内死亡率为100%。CA7 106TCID50感染的小鼠病理表现为重度弥漫性间质性肺炎,CA4 106TCID50感染的小鼠病理表现为中度-重度间质性肺炎。结论在相同条件下,CA7感染力明显强于CA4。     

三个品系小鼠流感病毒气溶胶感染模型的比较

[摘要] 目的 通过气雾攻击产生气溶胶的感染方式对三个品系的小鼠分别进行感染,比较三个品系小鼠在感染过程中的感染差异,从而对三个品系小鼠流感模型的特点进行分析,为流感发病机制的研究及疫苗和药物的开发选择合适的感染模型提供参考。方法 选用A/Puerto Rico/8/34（H1N1）病毒株,采用气雾攻击的方法感染近交系C57BL/6、BALB/c和远交群 ICR三个品系的小鼠,每日称小鼠体重,肉眼观察小鼠状态,分别于感染后3d,7d,14d处死小鼠,取肺脏称其湿重,进行肺脏的病毒测定及病理观察。结果 三个品系小鼠均可感染,其中C57BL/6小鼠的存活率低于其他两个品系,3d 的肺指数和病毒载量均明显高于ICR小鼠（P<0.05),镜下病理结果显示较其他两个品系也更明显。BALB/c小鼠与其他两个品系小鼠相比,体重在后期的恢复最慢,存活率比 C57BL/6高但比ICR低;肺指数和病毒载量与其他两个品系相比没有显著差异;镜下病理改变相似,但弱于C57BL/6强于ICR。ICR小鼠的发病进程与其他两个品系小鼠基本相似,但体重、存活率、肺指数、病毒载量及镜下病理改变等指标均弱于其他两个品系。结论 三个品系小鼠均可建立流感气溶胶模型,但感染后的三个模型各有特点,在实验中可以根据不同的研究目的来选用合适的小鼠品系建立模型。     

板蓝根颗粒对甲型流感病毒小鼠的作用

目的测定板蓝根颗粒抗流感病毒的药效作用。方法 A/California/7/2009(CA7)病毒滴鼻感染BALB/c小鼠观察14d,观察板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染小鼠的保护作用,计算小鼠存活率、存活天数以及延长生命率。感染的小鼠第5天每组小鼠处死一半,取肺组织,观察板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺组织的保护作用。结果板蓝根可明显延长甲型H1N1流感病毒感染小鼠的存活天数并提高存活率,病理结果显示板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠的肺组织有一定程度的保护作用,与模型组比较差异显著(P0.05)。结论板蓝根颗粒对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠有较好的保护作用。     

PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性的影响分析

目的 本研究利用A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,评估PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性,探究A/H6N1流感病毒的致病性分子基础。方法 通过A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/SanJiang/275/2007株反向遗传操作系统和点突变技术拯救病毒rA/H6N1和PB2 E627K位点发生突变的 rA/H6N1-627,两株拯救病毒分别以101EID50~106EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、死亡率、病毒滴定等方面进行致病性分析。结果 成功构建A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,rA/H6N1的8个基因片段完全源于A/H6N1的基因组,核苷酸序列及生物学特性与A/H6N1完全一致。rA/H6N1能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性(MLD50>106.5EID50),病毒在小鼠体内的分布情况及各个脏器中的病毒滴度与A/H6N1保持一致; rA/H6N1-627能感染小鼠,引起小鼠体重下降,但不能引起所有106EID50组小鼠死亡,病毒能在小鼠的肺脏和脑部进行增殖。结论 实验结果表明,在H5N1禽流感中发挥重要作用的PB2-E627K位点并非A/H6N1流感病毒的毒力决定因子。A/H6N1流感病毒致病性的分子基础还有待继续研究,该反向遗传操作系统和点突变技术的建立为研究该亚型流感病毒致病机制、传播机制及病毒基因功能奠定了基础,同时也为A/H6N1亚型禽流感病毒新型疫苗的研制开辟了新途径。     

H1N1流感与H7N9禽流感感染BALB/c小鼠发病特点初步研究

目的本实验旨在初步探讨A/Shanghai/4664T(H7N9)和A/Puerto Rico/8/34(H1N1)病毒感染BALB/c小鼠的发病特点,为H7N9致病机制与防治的研究提供数据支持。方法将同等剂量(5×103TCID50)流感病毒滴鼻感染BALB/c小鼠,分析其在感染后体重、肺指数、病毒载量和肺组织病理的变化情况。结果 H1N1PR8感染组和H7N9感染组小鼠在7 d内体重均持续减低,H1N1 PR8组较H7N9组降低更为明显;在感染后3 d H7N9组与PBS组肺指数无显著差异(P0.05),但感染后7d H7N9组与PBS组相比显著增高(P0.05);H1N1PR8组比H7N9组感染后3 d肺指数显著增高(P0.05),但感染后第7天无显著差异(P0.05)。H1N1 PR8组和H7N9组病毒载量在感染后第3天均显著升高,但两组无显著差异;第7天两组病毒载量均有所降低,但H7N9组病毒载量显著高于H1N1 PR8组(P0.05)。H1N1 PR8在感染后3 d主要病理变化为炎症细胞浸润和水肿,而H7N9组主要轻度炎症细胞浸润;在感染后7 dH1N1 PR8组可见大量炎症细胞浸润,出现大面积肺水肿;H7N9组表现为大量炎症细胞浸润。结论 H7N9和H1N1 PR8感染BALB/c小鼠均可发病,但发病特点有所差异,H7N9病毒对鼠的适应性比H1N1 PR8差。     

人H7N9禽流感病毒、高致病H5N1禽流感病毒及H1N1流感病毒感染小鼠特征分析

目的 对比分析人高致病H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒及H1N1流感病毒分别感染BALB/c小鼠后的机体反应特征。方法 分别以H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒滴鼻感染BALB/c小鼠,观察小鼠存活率、体征变化及感染后肺组织病理损伤差异,检测小鼠感染流感病毒后肺组织增殖细胞核抗原（PCNA）表达并观察小鼠感染后修复状况。结果 H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒均感染BALB/c小鼠,小鼠存活率依次为H7N9>H1N1>H5N1,肺组织病理损伤严重程度依次为H5N1 >H1N1 >H7N9,PCNA表达水平依次为H7N9 >H1N1 >H5N1。结论 H7N9病毒感染后宿主炎症反应较小,感染后小鼠肺组织自我修复能力较强;H5N1病毒感染BALB/c小鼠后的机体反应最为强烈,感染后恢复能力差,致死率高。     

H7N9禽流感病毒小鼠感染动物模型的建立

目的 建立H7N9小鼠感染动物模型。方法 1?08,1?07或1?06 TCID50H7N9禽流感病毒原液（A/Anhui/1/2013）滴鼻感染BALB/c小鼠。主要观测指标：临床症状、死亡率、病理变化、病毒载量和血清抗体检测。结果 被感染的小鼠表现为竖毛、弓背、体重下降;病理表现为间质性肺炎,感染后第2天开始在呼吸道脱落细胞中检测到病毒;免疫组化或病毒分离方法在肺、肾、脑、肠、脾等组织检测到病毒;感染后14d在小鼠血清中血凝抑制试验特异性抗体效价达到160;淋巴细胞减少,单核细胞增多。结论 H7N9感染BALB/c小鼠模型与人类禽流感感染疾病的基本特征相似,为研究该病的发病机制及药物疫苗的研发提供了工作基础。     

清透邪热方对甲型H1N1流感病毒感染Ana-1细胞TLR-7、MyD88及NF-κB mRNA及蛋白表达的影响

目的 研究清透邪热方体外抗甲型H1N1流感病毒效应机制。方法 将清透邪热方制备成0.388、0.194、0.097、0.0485、0.02425mg/mL不同浓度,用H1N1甲型流感病毒感染小鼠Ana-1巨噬细胞,给予不同浓度清透邪热方及达菲进行干预,检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素诱导蛋白-10（IP-10）和白细胞介素-6（IL-6）表达,Toll样受体7（TLR7）及其下游髓样分化因子88(MyD88)、核因子-κB（NF-κB）mRNA和蛋白表达。结果 清透邪热方能够抑制甲型H1N1流感病毒感染Ana-1细胞TNF-α、IP-10、IL-6的表达;其中清透邪热方0.02425mg/mL组降低H1N1病毒感染组TNF-α、IL-6显著（P＜0.01）;清透邪热方0.097mg/mL组降低IP-10显著（P＜0.01）。清透邪热方能够抑制H1N1流感病毒感染后Ana-1细胞后TLR-7、MyD88及NF-κB mRNA及蛋白表达升高;其中清透邪热方0.0485mg/mL组抑制H1N1病毒感染组TLR-7 mRNA、MyD88 mRNA表达显著（P＜0.01）;清透邪热方0.02425mg/mL组抑制H1N1病毒感染组NF-κB mRNA表达显著（P＜0.01）;清透邪热方0.0485mg/mL组抑制H1N1病毒感染组TLR-7蛋白表达升高显著（P＜0.01）,清透邪热方0.388mg/mL组抑制H1N1病毒感染组MyD88蛋白、NF-κB蛋白表达显著（P＜0.01）。结论 清透邪热方通过抑制甲型H1N1流感病毒感染Ana-1细胞TLR-7、MyD88及NF-κB mRNA及蛋白表达升高,减少TNF-α、IP-10和IL-6表达,起到抗病毒作用。      

H1N1流感与H7N9禽流感感染BALB/c小鼠发病特点初步研究

目的本实验旨在初步探讨A／shanghai／4664T（H7N9）和A／PuertoRico／8／34（H1N1）病毒感染BALB／c小鼠的发病特点,为H7N9致病机制与防治的研究提供数据支持。方法将同等剂量（5×10^3TCID50）流感病毒滴鼻感染BALB／c小鼠,分析其在感染后体重、肺指数、病毒载量和肺组织病理的变化情况。结果H1N1PR8感染组和H7N9感染组小鼠在7d内体重均持续减低,H1N1PR8组较H7N9组降低更为明显;在感染后3dH7N9组与PBS组肺指数无显著差异（P〉0．05）,但感染后7dH7N9组与PBS组相比显著增高（P〈0．05）;H1NlPR8组比H7N9组感染后3d肺指数显著增高（P〈0．05）,但感染后第7天无显著差异（P〉0．05）。H1N1PR8组和H7N9组病毒载量在感染后第3天均显著升高,但两组无显著差异;第7天两组病毒载量均有所降低,但H7N9组病毒载量显著高于H1N1PR8组（P〈0．05）。H1N1PR8在感染后3d主要病理变化为炎症细胞浸润和水肿,而H7N9组主要轻度炎症细胞浸润;在感染后7dH1N1PR8组可见大量炎症细胞浸润,出现大面积肺水肿;H7N9组表现为大量炎症细胞浸润。结论H7N9和H1N1PR8感染BALB／c小鼠均可发病,但发病特点有所差异,H7N9病毒对鼠的适应性比H1N1PR8差。     

甲型H1N1流感病毒在季流病毒、禽流感病毒共感染时变异可能性的验证

目的 甲型H1N1流感病毒A/California/7/2009分别与A/Brisbane/10/07和A/ShenZhen/406H/06共感染小型香猪,预测甲流病毒在与季流H3N2病毒/甲流病毒与禽流感病毒共感染时是否会发生变异.方法 分别将A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2),A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)对5～6月龄小型猪共感染,小型猪经复方氯胺酮0.1 mL/kg麻醉后进行滴鼻感染,感染后第5天安乐死动物,取动物肺组织作病毒测序分析.结果 A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2)共感染后,A/California/7/2009病毒PB1基因993位G→A突变,PA基因1659位G→A突变,没有氨基酸的变异.A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)共感染后A/California/7/2009病毒PB2基因1711位T→C突变.碱基的突变未引起氨基酸的变异.结论 A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2),A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)共感染后在猪的体内没有发生病毒重组、变异.     

甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因遗传进化分析

 【目的】 了解季节性H1N1流感病毒与2009年新型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传进化关系,探讨甲型H1N1流感病毒的遗传变异规律&#65377;【方法】 分别从2006年和2009年流感病人标本中分离并鉴定出季节性HIN1流感病毒和新型H1N1流感病毒,用RT-PCR技术扩增了病毒NA基因全序列,并对其分子进化和重要功能位点的遗传变异进行了分析&#65377; 【结果】 2009年新型H1N1流感病毒与2006年季节性HIN1流感病毒比较,NA基因的同源性较低(77.9% ~ 78.8 %),与世界各地不同年代代表株及WHO推荐的1979 ~ 2010年季节性流感疫苗株比较,NA基因的同源性也较低(78.1% ~ 79.3%),但与WHO推荐的2009年新型H1N1流感疫苗株比较同源性则高达99%以上;系统进化分析结果表明,2009年新型H1N1流感病毒NA基因与欧亚猪流感病毒株A/swine/Belgium/1/1983的亲缘关系最近;并发现自2005年以来季节性H1N1流感病毒NA基因的某些抗原位点和神经氨酸酶活性位点已发生了变异&#65377;【结论】 2009年新型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧亚猪流感病毒;接种季节性流感疫苗不能对本次流行的新型流感产生有效的免疫保护作用;季节性H1N1流感病毒在流行过程中NA基因已发生了一定的变异,有必要持续跟踪和监测病毒的变异情况&#65377;     

L-ficolin对A型H1N1流感病毒感染小鼠的保护作用

目的:探讨L-ficolin分子与A型H1N1流感病毒的相互作用机制。方法:将pcDNA3.1-L-ficolin真核表达质粒以及对照质粒分别肌注小鼠后感染A型H1N1流感病毒,观察感染小鼠的体重变化、肺内病毒血凝滴度,并通过肺指数以及肺组织HE染色判断感染小鼠的肺部病变情况,ELISA检测肺组织IFN-γ和IL-4的水平。结果:A型H1N1流感病毒感染后,与对照组相比,注射了pcDNA3.1-L-ficolin质粒的小鼠体重无明显下降,肺内病毒血凝滴度较低,肺组织病变较轻,并且肺内IFN-γ和IL-4的水平增高。结论:pcDNA3.1-L-ficolin对小鼠抵御A型H1N1流感病毒感染有一定的保护作用,该质粒可作为抗流感病毒的新型候选制剂。     

人H7N9禽流感病毒与H1N1流感病毒感染小鼠病理学损伤的比较

目的 比较分析H7N9病毒与H1N1病毒感染小鼠病理学损伤特点,初步探讨两种病毒感染致小鼠急性肺损伤的致病机制. 方法 H7N9病毒与H1N1病毒分别感染小鼠,观察不同病毒感染后小鼠生存率,并于不同时间点取心、肝、脾、肺、肾、脑、肠等组织,伊红-苏木素染色并进行组织病理学分析,免疫组化检测病毒抗原分布及中性粒细胞浸润.综合分析肺组织病理损伤与病毒复制、宿主免疫反应之间的关系. 结果 H7N9病毒感染小鼠肺及脾脏损伤较轻,存活率较高.H1N1 病毒感染的小鼠肺及脾脏损伤较重,感染后9 d全部死亡;两种病毒抗原主要分布于支气管上皮细胞、少量间质细胞和肺泡上皮细胞,病毒复制水平无明显差异.但H1N1病毒感染后肺及脾脏中均有大量中性粒细胞浸润,小鼠机体炎症反应明显强于H7N9病毒感染后小鼠炎症反应. 结论 H7N9病毒与H1N1病毒感染后小鼠病理学损伤特点及程度均不同,病毒复制是小鼠肺损伤的诱发因素但并非决定因素,宿主针对病毒感染产生的免疫反应程度与急性肺损伤密切相关.     

2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶编码基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型流感病毒(A/H1N1)聚合酶PA、PB1和PB2编码基因的进化规律。方法:从NCBI流感病毒基因数据库下载2009年新型甲型H1N1流行株的PA、PB1和PB2聚合酶编码基因序列以及人、猪和禽流感病毒相应的参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA4.0）软件比对和修剪此次流行株的代表序列及所有参考株序列并构建系统树,再比对和修剪此次流行株的代表序列及人A/H1N1病毒各年代(1918~2008年)参考序列并构建系统树,同时比对此次流行株的代表序列及人A/H1N1各年代(1918~2008年)参考序列编码PB2蛋白的氨基酸序列。结果:不同地区分离的2009年新型甲型H1N1流感病毒的聚合酶PA、PB1和PB2编码基因均具有高度同源性,并聚集在一个独特的进化支上,与猪流感病毒对应基因接近。三者均与2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒基因(A/Iowa/CEID23/2005/H1N1)具有高度的相似性。2009年新型甲型H1N1流感病毒、2005年美国爱荷华州流行的H1N1 (DQ889682)病毒PB2蛋白第627位氨基酸与禽类流感病毒相同,均为谷氨酸,而与其他人A/H1N1 (1918~2008年)病毒的赖氨酸不同。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒聚合酶基因可能来源于2005年美国爱荷华州分离的人A/H1N1病毒,禽流感病毒可能参与了聚合酶基因的重排过程。