转基因内皮细胞tpA纤溶活性的变化

利用基因重组技术，将tpAcDNA与逆转录病毒载体LNSX重组构成LNS－ipA，转染病毒包装细胞，形成的重组逆转录病毒颗粒再用来感染牛血管内皮细胞。经G418筛选后的单克隆细胞培液，分别经纤维蛋白板法和发包底物法测取活性。结果：经基因转染的PA317细胞和牛血管内皮细胞，在含人纤维蛋白原和凝血酶的纤维蛋白板上出现溶圈；随培养时间的延长，细胞数量增加，tpA分泌活性也增加。结论：含人tpAcDNA转录单位的牛血管内皮细胞，其纤溶活性明显增高。该研究为将来进行基因治疗奠定了基础。     

逆转录病毒载体LNSHyTK的构建及与丙氧鸟苷联合杀伤B16细…

构建了一个能表达ＨｙＴＫ的重组逆转录病毒载体ＬＮＳＨｙＴＫ，经包装细胞ＰＡ３１７包装成假型逆围录病毒，并利用此病毒感染了小鼠黑色素瘤细胞株Ｂ１６，聚合酶链反应结果表明假病毒中不含复制活性病毒，ｔｋ基因已成功地被导入了Ｂ１６细胞，总ＲＮＡ斑点杂交显示转染细胞中扔稳定的ｔｋ基因转录产物。细胞毒性实验显示，０．０５μｍｏｌ／Ｌ的丙氧鸟苷即可明显降低转染细胞的存活率，表明逆转录病毒介导的ＨｙＲＴＫ基因转移     

逆转录病毒载体LNSHyTK的构建及与丙氧鸟苷联合杀伤B16细胞的研究

构建了一个能表达ＨｙＴＫ的重组逆转录病毒载体ＬＮＳＨｙＴＫ，经包装细胞ＰＡ３１７包装成假型逆转录病毒，并利用此病毒感染了小鼠黑色素瘤细胞株Ｂ１６．聚合酶链反应结果表明假病毒中不含复制活性病毒、ｔｋ基因已成功地被导入了Ｂ１６细胞。总ＲＮＡ斑点杂交显示转染细胞中有稳定的ｔｋ基因转录产物。细胞毒性实验显示，０．０５μｍｏｌ／Ｌ的丙氧鸟苷即可明显降低转染细胞的存活率，表明逆转录病毒介导的ＨyＴＫ基因转移使Ｂ１６细胞获得了对丙氧鸟苷的敏感性。因此，ＨyＴＫ基因／ＧＣＶ可能成为实体瘤的基因治疗途径。     

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因应用于基因治疗。构建，包装含ＣＤ基因的假型逆转录病毒。构建含ＣＤ基因的逆转录病毒重组表达载体ＰＬＣＤＳＮ基础上，以重组表达载体ＰＬＣＤＳＮ转染包装细胞ＰＡ３１７，ＰＬＣＤＳＮ整合人ＰＡ３１７染色 。结果：ＣＤ基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒染ＮＩＨ／３Ｔ３细胞，逆转录病毒重组表达载体ＰＬＣＤＳＮ整合入ＮＩＨ／３Ｔ３细胞染色体     

构建人白细胞介素2逆转录病毒载体和包装细胞

目的：构建人白细胞介素２（ｈＩＬ－２）逆转录病毒载体及包装细胞。方法：用基因重组法将ｈＩＬ－２ｃＤＮＡ与ｐＬＮＣＸ重组成正义和反义ＬＮＣＩＬ－２基因。用磷酸钙－甘油法及感染法将ＬＮＣＩＬ－２基因转入ＰＡ３１７包装细胞内。所得克隆Ａ８的ｈＩＬ－２分泌量，ＤＮＡ、ＲＮＡ分别用ＥＬＩＳＡ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交法分析。结果：Ａ８分泌的ｈＩＬ－２量为８．４ｎｇ·（２４ｈ·１０６细胞）１，ｈＩＬ－２基因完整地整合到转导细胞基因组内并有ｈＩＬ－２ｍＲＮＡ表达，细胞上清内病毒滴度为１０６·ＣＦＵ·ｍｌ１。结论：本研究成功地构建编码ｈＩＬ－２的逆转录病毒载体，并筛选出能产生病毒粒子、分泌ｈＩＬ－２的包装细胞。     

HSV-TK基因逆转录病毒重组体的构建和鉴定

利用逆转录病毒载体ｐＬＮＳＸ构建了带ＨＳＶＴＫ基因的逆转录病毒重组体ｐＬＮＳＴＫ，用磷酸钙沉淀法转染ＰＡ３１７包装细胞，经Ｇ４１８筛选抗性克隆，建立了产生重组病毒的载体产生细胞系ＰＡ３１７／ＴＫ，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒（ＣＦＵ）滴度为３×１０８Ｌ－１。提取ＰＡ３１７／ＴＫ细胞的ＤＮＡ和细胞上清液的ＲＮＡ，在特异性引物引导下，分别用ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ检测证实ＰＡ３１７／ＴＫ细胞整合了ＨＳＶＴＫ基因并产生重组病毒，为ＨＳＶＴＫ基因治疗恶性肿瘤的实验研究打下了基础。     

粒—巨噬细胞集落刺激因子cDNA在造血祖细胞中的表达

目的；探讨逆转录病毒介导的ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ在造血母细胞中转移与表达。方法：采用电穿孔法将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组逆转录病毒ｐＬＸＳＮ／ＧＭ和空载体ｐＬＸＳＮ转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，再将含有ＧＭ－ＣＳＦ重组逆转录病毒的细胞培养上清液感染富含造血干祖细胞群体，采用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析培养细胞基因组中外源基因的整合，用Ｄｅｘｔｅｒ培养体系检测培养３周的各组细胞增殖数，结果：在     

人小分子尿激酶基因治疗的实验研究

探讨人小分子尿激酶（ｍＵＫ）基因治疗血栓性疾病的可行性；方法将ｍＵＫ与逆转录病毒载体ＬＮＳＸ重组构成ＬＮＳＸｍＵＫ，并转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，形成的重组逆转录病毒颗粒经背部皮下组织、腹腔及骨骼肌等途径注入小鼠体内，然后定期从尾部取血，发色底物法测定ｍＵＫ活性，并对注射部位切片进行免疫荧光组织化学染色；结果小鼠注射重组病毒后血中纤溶活性明显升高（Ｐ＜０．０１），免疫组织化学染色证实ｍＵＫ在注射局部细胞中获得表达。结论目前ｍＵＫ已持续表达４月余，显示了本研究技术路线在临床上具有较好的应用前景。     

原发性肝癌基因治疗研究——含人TNF基因重组逆转录病毒转移系…

将人ＴＮＦα基因克隆到重组逆转录病毒载体ｐＲＵＦｎｅｏ，构建了含人ＴＮＦ基因重组逆转录病毒载本ＲＵＦ－ＴＮＦ。将ＲＵＦ－ＴＮＦ转染包装细胞Ｆｌｙ Ａ１３，经药物筛选获得稳定分泌含人ＴＮＦ基因重组逆转录病毒的细胞株ＦｌｙＲＵＦＮ１４。ＦｌｙＲＵＦＮ１４产生的病毒上清液能直接转染靶细胞Ｓａｏｓ－２。本研究建立的逆转录病毒介导的ＴＮＦ基因转移系统为肝癌及其他恶性肿瘤的基因治疗提供了条件。     

原发性肝癌基因治疗研究—含人TNF基因重组逆转录病毒转移系统的构建与表达

将人ＴＮＦα基因克隆到重组逆转录病毒载体ｐＲＵＦｎｅｏ，构建了含人ＴＮＦ基因重组逆转录病毒载体ＲＵＦ－ＴＮＦ。将ＲＵＦ－ＴＮＦ转染包装细胞ＦｌｙＡ１３，经药物筛选获得稳定分泌含人ＴＮＦ基因重组逆转录病毒的细胞株ＦｌｙＲＵＦＮ１４。ＦｌｙＲＵＦＮ１４产生的病毒上清液能直接转染靶细胞Ｓａｏｓ－２。本研究建立的逆转录病毒介导的ＴＮＦ基因转移系统为肝癌及其他恶性肿瘤的基因治疗提供了条件。