His348Gln杂合突变伴hrg353Gln杂合多态性导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系分析

目的：对1例遗传性凝血因子Ⅶ（FVH）缺陷患者进行基因分析和家系调查,初步探讨其发病的分子机制。方法：检测先证者及其家系成员凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）、凝血酶原活性（FII：C）、凝血因子V活性（FV：C）、FVII活性（FVII：C）和凝血因子x活性（FX：C）及FVII抗原（FVII：Ag）等进行表型诊断;用DNA直接测序法分析先证者Ⅳ基因的全部外显子、侧翼、5’和3’非翻译区及家系成员相应的突变位点区域,用反向测序证实所发生的突变。结果：先证者PT延长为22．4s,FVII：C和FVII：Ag明显降低,分别为7％和10％;父亲、母亲、姐姐及儿子的PT正常或稍延长,FVII：c分别为63％、54％、57％和46％,FVH：Ag分别为67％、53％、61％和49％;先证者和所有家系成员的APTT及其他凝血指标均在正常参考范围内。测序发现先证者Ⅳ基因第8号外显子存在g．11482T〉G（His348Gln）杂合突变和g．11496G〉A（Arg353Gln）杂合多态性;其母亲、姐姐、儿子均存在F7基因g．11482T〉G杂合突变;父亲存在,7基因g．11496G〉A杂合多态性。结论：肜基因His348Gln杂合突变协同Arg353Gln杂合多态性是导致该先证者FVII缺陷症的分子机制。     

错义突变Gly400Val导致的凝血因子Ⅺ缺陷症

目的 检测一个中国汉族人凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺陷家系中的基因突变。方法 测定先证及家系成员凝血因子活性(FⅪ：C)；抽取外周血单个核细胞中的基因组DNA，采用PCR扩增FⅪ基因所有外显子及其侧翼序列，直接测序；针对突变位点进行等位基因特异性PCR(ASPCR)扩增。结果 先证者部分凝血活酶时间(APTT)延长94．15s，FⅪ：C为正常的2．1％。家系成员杂合子的FⅪ：C均下降，为正常对照的27．0％～48．4％。先证者FⅪ基因外显子11第1296位苷酸G突变为T，导致其所编码的甘氨酸残基为缬氨酸残基替代((Gly400Val)。部分家系成员该位点呈杂合性改变。结论 Gly400Val为FⅪ缺陷的原因，杂合子的FⅪ水平可能由于显性负机制的存在而进一步降低。     

静脉血栓患者FⅫ C46T基因多态性分析

目的：探讨凝血因子Ⅻ（FⅫ）基因第一外显子C46T基因多态性与静脉血栓形成的关联性。 方法：应用PCR-RFLP分析方法检测87例静脉血栓患者和129例健康对照的FⅫ基因外显子C46T基因型及其频数分布,采用多元Logistic非条件回归方法分析FⅫ基因第一外显子C46T基因多态性与静脉血栓形成的关联性。 结果：在研究人群中存在有FⅫ 46C/C、C/T、T/T 3种基因型,静脉血栓患者中的FⅫ 46C/C基因型频数分布（6.90%）高于健康对照人群（4.65%）。经多元Logistic非条件回归分析,FⅫ 46C/C基因型与深静脉血栓无关联性（χ²=1.036,P=0.309,OR=1.86,95%CI：0.57～6.12）。 结论: 不能确定FⅫ基因第一外显子C46T基因多态性是静脉血栓形成的危险因素,静脉血栓形成与FⅫ基因第一外显子C46T基因多态性的关联性有待于深入研究。     

凝血因子Ⅻ缺陷症导致再发体外受精和胚胎移植失败原因2例分析

目的：探讨机体凝血因子Ⅻ（FⅫ）水平对再发体外受精和胚胎移植（IVF-ET）的影响。方法：检测患者凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血因子Ⅻ促凝活性（FⅫ：C）、纤溶酶原活性（PLG：C）、D-二聚体（D-D）等凝血指标;PCR扩增FⅫ基因的14个外显子及其侧翼序列,进行DNA测序,发现基因突变,则反向测序予以证实。50例正常对照组用于排除FXII基因多态性。结果：2例F如缺陷患者APTT显著延长,FⅫ：C明显降低。患者1基因分析发现g．6753delACA杂合突变（国内外鲜见报道）和46T／T。患者2发现g．7142insertC杂合突变和46C／T。结论：FⅫ缺陷症患者易导致机体纤溶功能下降,是引起患者IVF—ET失败的重要原因之一。     

蛋白C基因C5498T致Ⅰ型遗传性蛋白质C缺陷症

目的 对一个遗传性Ⅰ型蛋白C(PC)缺陷症家系进行基因突变的检测。方法 分别用ELISA和发色底物法测定血浆蛋白Ｃ活性和抗原。用PCR法对先证者PC基因的9个外显子及其侧翼、内含子2序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。突变位点经限制性内切酶分析证实。结果先证者的蛋白C活性和抗原分别为26％和1．43g／L。先证者表现为PＣ基因外显子3区杂合错义突变Ｃ5498T,引起Arg15→Ｔrp。在基因启动子区存在2405C／T、2418A／G、2583A／T多态性。结论 该突变导致遗传性Ⅰ型PC缺陷症。     

蛋白C基因复合杂合突变导致的肺栓塞及家系研究

目的了解1例肺栓塞患者及其家系成员发生蛋白C缺陷症的分子发病学机制。方法收集先证者及其家系成员的枸橼酸钠抗凝血,采用发色底物法检测PC活性(PC∶A)、蛋白S活性(FPS∶A)和抗凝血酶活性(AT∶A),采用ELISA方法检测PC抗原(PC∶Ag)水平。采用PCR方法对先证者PC基因所有9个外显子及其侧翼序列进行扩增、测序,发现突变后,对先证者家系成员的PC基因有关外显子片段进行PCR扩增和测序。结果先证者及其父亲、母亲和妹妹均为Ⅱ型PC缺陷症患者。PC基因测序结果显示先证者的PC基因分别出现了位于3号外显子第5540位碱基的G→A的杂合突变和位于第7号外显子第10230位碱基C→T的杂合突变,导致PC E29K和R147W双杂合突变。先证者父亲携带PC E29K杂合突变,而先证者母亲和妹妹均为PCR147W杂合突变的携带者。结论先证者为PC E29K和R147W基因复合杂合突变携带者,且这两种突变分别遗传自其父母。其中,PC E29K错义点突变为目前国际上尚未见报道的新突变,而PC R147W是一种已报道的常见于遗传性易栓症患者的可导致Ⅱ型PC缺乏的错义点突变。     

蛋白C基因复合杂合突变导致的肺栓塞及家系研究

了解1例肺栓塞患者及其家系成员发生蛋白C缺陷症的分子发病学机制。 方法 收集先证者及其家系成员的枸橼酸钠抗凝血,采用发色底物法检测PC活性（PC∶A）、蛋白S活性（FPS∶A）和抗凝血酶活性（AT∶A）,采用ELISA方法检测PC抗原（PC∶Ag）水平。采用PCR方法对先证者PC基因所有9个外显子及其侧翼序列进行扩增、测序,发现突变后,对先证者家系成员的PC基因有关外显子片段进行PCR扩增和测序。结果 先证者及其父亲、母亲和妹妹均为Ⅱ型PC缺陷症患者。PC基因测序结果显示先证者的PC基因分别出现了位于3号外显子第5540位碱基的G→A的杂合突变和位于第7号外显子第10230位碱基C→T 的杂合突变,导致 PC E29K 和 R147W 双杂合突变。先证者父亲携带 PC E29K 杂合突变,而先证者母亲和妹妹均为 PCR147W杂合突变的携带者。 结论 先证者为PC E29K和R147W基因复合杂合突变携带者,且这两种突变分别遗传自其父母。其中,PC E29K错义点突变为目前国际上尚未见报道的新突变,而PC R147W是一种已报道的常见于遗传性易栓症患者的可导致Ⅱ型PC缺乏的错义点突变。     

Pro 275 Ser纯合突变导致的Ⅱ型遗传性蛋白C缺陷症

目的 对1例Ⅱ型遗传性蛋白C（PC）缺陷症家系进行基因突变的检测。方法 分别用发色底物法和ELISA测定血浆蛋白C活性和抗原。用PCR法对先证者PROC基因的9个外显子及其侧翼序列进行扩增,PCR产物经割胶纯化后直接测序,检测其基因突变。家系成员DNA在先证者PROC基因突变区域扩增后测序。突变位点经限制性内切酶分析证实,并经105例健康体检者作对照以排除基因多态性。结果 先证者的蛋白C活性和抗原分别为5％和13．9％。PROC基因测序分析发现先证者表现为外显子9区C12625T纯合错义突变,该突变引起编码的蛋白CPro275Ser氨基酸替换。结论 Pro275Ser纯合突变是导致该例先证者Ⅱ型遗传性Pc缺陷症的分子机制,该突变为国际首报。     

2个遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系的表型与基因型分析

  目的  对2个遗传性凝血因子Ⅺ（FⅪ）缺陷症家系进行表型诊断和基因突变分析,探讨其分子发病机制。  方法  对2014年11月及2018年1月潮州中心医院收治的2例遗传性凝血因子FⅪ缺陷症患者及家系进行分析。采用血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、FⅪ活性（FⅪ∶C）和FⅪ抗原（FⅪ∶Ag）等凝血指标进行表型诊断;对2个先证者FⅪ基因所有的外显子及其侧翼序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。针对先证者的突变位点,分别对其家系成员进行相应的基因突变检测。应用逆转录PCR (RT-PCR)检测先证者-1 FⅪ mRNA的水平,分析突变对FⅪ mRNA剪切造成的影响。  结果  先证者-1男性,7岁。PT为10.7 s,APTT为 97.4 s（参考值9～12.8 s和24～40 s）,FⅪ∶C为0.6%,FⅪ∶Ag<1%（参考值65%～150%和72.1%～122.3%）;先证者-2女性,30岁。PT为11.7 s,APTT为71.3 s,FⅪ∶C为0.7%,FⅪ∶Ag<1%。2例先证者因子Ⅷ活性（FⅧ∶C）、因子Ⅸ活性（FⅨ∶C）和因子Ⅻ活性（FⅫ∶C）均在正常范围内。先证者-1基因测序发现FⅪ基因内含子4的3′端剪切受位存在c.326-1G>A剪接突变及10号外显子c.1107C>A（p.Tyr351X） 复合杂合突变;家系分析表明,先证者-1外婆、母亲及哥哥存在c.326-1G>A杂合剪接突变,奶奶及父亲存在c.1107C>A杂合无义突变。在先证者-1外周血中未能检测到FⅪ mRNA。先证者-2 FⅪ基因测序发现8号外显子存在c.841C>T（p.Gln263X）纯合无义突变;家系分析表明先证者-2父亲、母亲、女儿及儿子存在c.841C>T杂合突变。  结论  FⅪ基因c.326-1G>A剪接突变、p.Tyr351X和p.Gln263X是导致2个遗传性FⅪ缺陷症先证者FⅪ缺乏的原因。     

女性血友病A FⅧ基因的双重杂合突变-1例基因分析

目的对1例女性血友病A(HA)患者家系进行基因分析，以探讨其分子发病机制。方法FⅧ：C等测定进行HA表型诊断；用LD—PCR进行内含子22倒位检测，对FⅧ基因的所有外显子及其侧翼序列进行扩增，用末端标记双脱氧法检测核酸序列。结果表型检测先证者(父亲)及其女儿的FⅧ：C分别为6．9％、3．4％；3人内含子22倒位为阴性；先证者女儿FⅧ14号外显子存在自发杂合突变(112183-112191)insA，18号外显子131252T→C(Leu1975Pro)；父亲FⅧ18号外显子存在相同突变，母亲FⅧ基因检测没有发现先证者的这2个突变。结论FⅧ14号外显子(112183-112191)insA与18号外显子131252T→C双重杂合突变可能是导致该患者HA的分子机制，其中18号外显子131252T→C为国际首次报道，14号外显子(112183-112191)insA为国内首次报道。     

一个复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XII缺陷症家系分析

目的：对一个复合杂合基因突变导致的遗传性凝血因子XII（FXII）缺陷症家系进行实验室表型和基因突变分析,寻找致病基因并初步探讨其分子发病机制。方法：检测先证者及其家系成员（共3代5人）血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血因子VIII促凝活性（FVIII:C）、凝血因子Ⅸ促凝活性（FIX:C）、凝血因子XI促凝活性（FXI:C）、XII促凝活性（FXII:C）和FXII抗原含量（FXII:Ag）等指标以明确诊断。采用PCR直接测序法分析先证者F12基因所有的外显子及其侧翼序列,对可疑的突变反向测序进行验证,并对家系成员的相应突变位点区域进行检测。采用ClustalX-2.1-win软件和4个在线生物信息工具（Mutation Taster、Poly-Phen-2、PROVEAN和SIFT）分析氨基酸突变位点的保守性和突变对蛋白质功能的可能影响;用Swiss-Pdb Viewer 4.0.1软件对突变位点进行蛋白模型相互作用分析。结果：先证者APTT为59.1 s,明显延长;FXII:C和FXII:Ag分别降低至4%和5%,其父亲、母亲、女儿的FXII:C和FXII:Ag降低至32%～37%。基因分析发现先证者F12基因第13号外显子存在复合杂合基因突变,即c.1561G＞A杂合错义突变（p.Glu502Lys）和c.1637T＞C杂合错义突变（p.Met527Thr）;其父亲为p.Met527Thr携带者,母亲和女儿为p.Glu502Lys携带者。保守性分析结果表明,Glu502和Met527在同源物种间高度保守;4个在线生物信息学软件对该两个突变的预测结果一致,均预示很可能是有害突变,可引起相关疾病。突变蛋白模型分析显示,野生型Glu502与His365之间形成1条氢键,Glu502替换为Lys502导致氢键的消失;野生型Met527与Leu524之间形成1条氢键,Met527替换为Thr527导致Thr527-Leu524之间增加2条氢键。结论：该先证者F12基因第13号外显子上存在p.Glu502Lys和p.Met527Thr复合杂合突变,推测该突变遗传自具有血缘关系且分别存在p.Glu502Lys和p.Met527Thr杂合子的父母,并与该家系FXII水平降低有关。     

酪氨酸羟化酶基因新突变导致多巴反应性肌张力障碍家系分析

【目的】研究多巴反应性肌张力障碍（DRD）家系TH基因突变特点。【方法】提取先证者及其父母和两个姐姐外周血基因组DNA,使用高通量测序（NGS）的方法对已知肌张力及运动障碍相关的256个致病基因进行检测。【结果】家系中2例患者（先证者和其大姐）的酪氨酸羟化酶（TH）基因外显子14、9存在c.1481C>T（p.Thr494Met）、c.943G>A（p.Gly315Ser）复合杂合突变,父母分别携带一个杂合突变,其表型正常的二姐和50名正常对照者均未检测到该突变。【结论】TH基因c.1481C>T（p.Thr494Met）、c.943G>A（p.Gly315Ser）突变导致了该DRD家系的基因异常,并且发现了新的TH基因突变,扩展了DRD基因型与临床表型的关系谱,对DRD的早期精准诊断和治疗是改善预后的关键。     

β地中海贫血一个特殊基因突变的家系分析

目的：对一个国人罕见的重型地中海贫血基凶突变[CD41／42（-TCTT）·-90（C→T）]及其父母进行基因分析。方法：采用PCR／ASO探针杂交法检测中国人常见17种β-地贫基因突变，β-珠蛋白基因全长DNA克隆测序技术分析其突变基闲型。结果：发现先证者父亲携带中国人常见基因突变CD41／42（-TCTT），母亲则为中国少见地中海贫血基因突变-90（C→T），而先证者则为密码子CD41／42（-TCTT）缺失突变复合-90（C→T）转录子突变。结论：-90（C→T）在我国目前仅发现1例家系突变。     

一个佩梅病大家系蛋白脂蛋白1基因突变分析

目的分析并确定佩梅病(PMD)一大家系蛋白脂蛋白1(PLP1)基因突变及遗传特征。方法收集先证者及其家系成员临床资料,采用多重连接依赖的探针扩增(MLPA)方法进行PLP1基因重复突变检测、DNA直接测序进行PLP1基因点突变检测,分析基因型与表型的关系。结果本家系先证者(Ⅴ∶4)符合临床诊断PMD。PLP1基因检测结果发现先证者(Ⅴ∶4)存在第2外显子c.96C>G(p.F32L)的半合子改变,先证者之母(Ⅳ∶16)、外祖母(Ⅲ∶20)与曾外祖母(Ⅱ∶7)存在与先证者相同的c.96C>G(p.F32L)杂合改变,为表型正常的携带者。结论本家系中先证者为PLP1基因c.96C>G(p.F32L)半合子突变致病,明确了本家系PLP1基因突变与遗传特征,为准确的遗传咨询和进一步的产前诊断打下了基础。     

CLN6基因复合杂合突变导致神经元蜡样脂褐质沉积症一家系遗传学研究

目的: 探讨一个常染色体隐性遗传神经元蜡样脂褐质沉积症（NCL）家系的遗传学原因。方法: 应用目标区捕获高通量靶向测序对先证者进行候选基因突变筛查,并通过PCR测序在先证者及其父母中对突变位点进行验证;RT-PCR及TA克隆测序考察上述两种突变是否影响剪接。结果: 测序结果显示先证者存在CLN6：c.486+2T>C和c.486+4A>T复合杂合突变,分别来自父母双方。RT-PCR及TA克隆测序提示两种突变均可导致两种异常剪接。结论: CLN6：c.486+2T>C和c.486+4A>T复合杂合突变很可能为该NCL家系患者的遗传学病因,新突变基因丰富了CLN6基因突变谱。