乳鼠皮层神经元原代培养与观察

目的:通过原代培养乳鼠皮层神经元,为脑血管疾病的研究提供实验模型。方法:酶消化法原代培养出生1天Wistar乳鼠的皮层神经元,利用免疫细胞化学和免疫荧光方法进行鉴定。结果:培养的细胞贴壁生长,胞体饱满,突起较长。免疫细胞化学染色显示神经元特异性烯醇化酶阳性细胞达85%,免疫荧光显示胶质细胞酸性蛋白阳性细胞达15%。结论:酶消化法原代培养乳鼠皮层神经元是一种可靠、稳定的获得神经元的方法。     

原代SD大鼠海马神经元扫描电镜形态学特点

目的:观察体外培养的原代海马神经元扫描电镜形态学特点。方法:体外培养新生SD乳鼠原代海马神经元,行免疫细胞化学鉴定,用扫描电镜观察其形态学特点。结果:培养的海马神经元形态多样,梭形神经元胞体较大,伸出两个突起;神经元细胞有的基底宽广,突起有粗有细,与周围的神经元细胞连结紧密;锥体细胞从胞体发出2～3个突起,从粗大的突起上又分出突起;培养的神经元以锥体形为主,其次为梭形、三角形。结论:培养的神经元为MAP-2染色阳性,扫描电镜可见神经元胞体及突起形成神经元的特有结构。     

培养中的下丘脑神经元的形态学研究

取新生大鼠下的丘脑分散培养１、３、７、１４ｄ的细胞，应用免疫细胞化学、电镜和图像分析等技术研究了丘脑神经元。结果显示：培养的下丘脑神经元可表达神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶；某些神经元突起可见串珠样膨体，突起末端有生长锥；电镜下，神经元胞质含丰富的蛋白质合成细胞器，神经元培养１－３ｄ生长最快；７ｄ胞面积和突起长度均达高峰值，１４ｄ时基本维持在７ｄ水平。     

半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂孟鲁司特对缺血性损伤后神经元形态的作用

目的:观察半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂孟鲁司特对原代神经元缺血性损伤后形态变化的作用。方法:在不同浓度孟鲁司特存在条件下,以缺氧缺糖(OGD)2 h和再灌(R)24 h(OGD/R)诱导大鼠原代神经元及皮层混合培养细胞的神经元损伤;以免疫染色法检测神经元数量、胞体大小、胞体总神经突起数量、一级神经突起数量、长度及其分支数量等指标,观察神经元形态的变化。结果:OGD/R可明显减少神经元的数量,显著改变神经元的形态。而孟鲁司特(0.0001～1μmol/L)能减轻单独神经元培养中OGD/R诱导的神经元数量减少,抑制一级神经突起分支数量增加;在混合培养中,孟鲁司特(0.0001～0.1μmol/L)增加OGD/R后一级神经突的长度,减少神经突起数量以及一级神经突起分支数量。结论:半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂孟鲁司特对大鼠原代神经元缺血性损伤有保护作用。     

人重组aFGF对鼠胚神经上皮细胞分化及受体表达的影响

目的 观察人重组酸性成纤维细胞生长因子（ａＦＧＦ）对原代培养鼠胚神经上皮细胞分化及受体表达的影响,方法 应用神经细胞原代培养,免疫细胞化学及图像分析。结果 ａＦＧＦ可使神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）阳性细胞数增加,胞体增大,细胞培养第７天其作用明显,ＮＳＥ免疫阳性着色发布下神经细胞胞质和突起中,在培养第３,７,１０天,ａＦＧＦ可促进其受体ｆｌｇ蛋白的表达,结论ａＦＧＦ可诱导鼠胚神经上皮细胞分化及受     

低浓度补体C3对大脑皮层神经元生物活性及突起生长的影响

目的 探讨补体C3对大脑皮层神经元生物活性和突起生长的影响及可能机制. 方法 在原代培养的孕16 d大鼠胚胎皮层神经元中分别加入不同浓度的外源性C3蛋白、神经生长因子和C3a受体拮抗剂SB290157.WST-8 法测定神经元活性(细胞存活率).选用MAP2与β-tubulin免疫荧光细胞化学双标染色,荧光显微镜下观察并计算神经元纯度;应用神经元形态分析软件采集神经元树突、轴突长度及胞体面积等数据,分析不同浓度补体C3及C3a受体拮抗剂对突起生长的影响.以不含其他试剂的神经元细胞及其培养液作为正常对照组. 结果 皮层神经元存活率检测显示,高浓度 (10～100 μg/mL) C3组明显低于正常对照组(P<0.05),而低浓度(0.01～1 μg/mL)C3组与对照组无明显差异. 1 μg/mL 和5 μg/mL C3均促进皮层神经元突起生长,尤其是轴突的生长,其树突和轴突长度分别增长20% ～39%和40% ～61%,与正常对照组比较有显著差异(P<0.05和P<0.01);而加入C3a受体拮抗剂后,皮层神经元树突和轴突长度与对照组比较无明显差异. 结论 低浓度补体C3对皮层神经元轴突和树突生长有明显促进作用,而该作用可能由C3活性片段C3a受体介导.     

原代培养神经元细胞缺氧损伤后脑红蛋白表达研究

目的探讨皮层神经元细胞缺氧损伤后脑红蛋白的表达。方法构建C57BL／6胎鼠皮层神经元原代培养的细胞缺氧模型,联合MTT微量酶反应比色法、Real—TimePCR、免疫荧光染色及Western Blot等方法,观察缺氧后细胞形态学、细胞生存率、NgbmRNA及蛋白表达情况。结果原代培养皮层神经元缺氧4h后细胞生存率明显下降,NgbmRNA及蛋白表达升高,8h达高峰,此后逐渐稳步下降,至缺氧24h仍高于对照组。结论缺氧损伤可诱导原代培养皮层神经元NgbmRNA及蛋白的表达。     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

低浓度补体C3对大脑皮层神经元生物活性及突起生长的影响

目的探讨补体C3对大脑皮层神经元生物活性和突起生长的影响及可能机制。方法在原代培养的孕16 d大鼠胚胎皮层神经元中分别加入不同浓度的外源性C3蛋白、神经生长因子和C3a受体拮抗剂SB290157。WST-8法测定神经元活性(细胞存活率)。选用MAP2与β-tubulin免疫荧光细胞化学双标染色,荧光显微镜下观察并计算神经元纯度;应用神经元形态分析软件采集神经元树突、轴突长度及胞体面积等数据,分析不同浓度补体C3及C3a受体拮抗剂对突起生长的影响。以不含其他试剂的神经元细胞及其培养液作为正常对照组。结果皮层神经元存活率检测显示,高浓度(10~100μg/mL)C3组明显低于正常对照组(P<0.05),而低浓度(0.01~1μg/mL)C3组与对照组无明显差异。1μg/mL和5μg/mL C3均促进皮层神经元突起生长,尤其是轴突的生长,其树突和轴突长度分别增长20%~39%和40%~61%,与正常对照组比较有显著差异(P<0.05和P<0.01);而加入C3a受体拮抗剂后,皮层神经元树突和轴突长度与对照组比较无明显差异。结论低浓度补体C3对皮层神经元轴突和树突生长有明显促进作用,而该作用可能由C3活性片段C3a受体介导。     

丹参注射液诱导骨髓基质细胞分化为神经元的研究

目的 :探讨丹参注射液体外诱导成年大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞 .方法 :用贴壁法分离纯化SD大鼠骨髓基质细胞 .培养传至第 5代 ,以 10 %丹参注射液诱导骨髓基质细胞分化 ,6h后相差显微镜观察形态变化及免疫细胞化学染色鉴定神经细胞特异性标志物NSE及GFAP .结果 :诱导 1h后部分骨髓基质细胞胞体收缩 ,有突起伸出 ;6h后突起增多形成网络结构 ,免疫细胞化学染色 ,NSE强阳性表达率为(43 3± 4 3) % ;而GFAP无阳性表达 .结论 :丹参可以诱导成年大鼠骨髓基质细胞在体外分化成为神经元样细胞 .     

大鼠皮层神经元原代培养方法的改进

目的:建立一种简单、较理想的新生大鼠皮层神经元体外原代培养方法.方法:采用低浓度、短时间胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮层神经元悬液,进行培养.结果:在体外培养条件下神经元结构特征明显,并能形成典型的神经元网络.结论:本方法适合普通实验室进行大鼠皮层神经元体外培养.     

早期惊厥样放电对发育中神经元NMDA受体1表达的远期影响

目的探讨早期惊厥样放电对发育中大鼠皮层神经元N-甲基-D-天冬氨酸受体1（N—methyl—D—aspartate receptor1，NR1）表达的远期影响。材料与方法以原代培养的大鼠大脑皮层神经元无镁诱导的反复惊厥样放电为模型。根据对培养6d皮层神经元的不同处理分为三组：正常DMEM培养液组（GONT1）、正常细胞外液组（CONT2）和无镁细胞外液组（MGF）。神经元分别在上述三种液体中孵育3h，然后恢复正常DMEM培养基继续培养，分别应用实时定量PCR与Westernblot方法在培养7、12及17d时测定皮层神经元NMDA受体1mRNA与蛋白表达的变化。结果在正常DMEM培养液中，NR1 mRNA与蛋白的表达在培养7d时处于较高水平，以后逐渐下降，以培养12d为最低。与GONT2和GONT1组相比，MGF组NR1 mRNA与蛋白的表达在培养7d皮层神经元均明显降低，在12d时明显增高（P〈0．05）。GONT2组与GONT1组相比无统计学差异（P〉0．05）。结论发育中皮层神经元早期无镁诱导惊厥样放电对NMDA受体1mRNA与蛋白表达具有远期影响，提供了神经元早期惊厥样放电引起远期功能损伤的可能机制。     

半胱氨酰白三烯受体激动剂和拮抗剂对大鼠原代皮质神经元的作用

目的:观察受体激动剂LTD4对大鼠原代皮质神经元的作用,以及不同拮抗剂对LTD4及缺血性损伤的影响。方法:在大鼠原代培养皮质神经元,以细胞内钙检测、噻唑蓝(MTT)还原反应、碘化吡啶(PI)和Hoechst-33258染色观察神经元损伤;以缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)1.5h和再灌24h诱导神经元损伤。结果:LTD4(0.01~1μmol/L)不能诱导神经元内钙升高,对神经元活性也没有明显的影响。OGD1.5h,再灌24h,可显著降低神经元活性;CysLT1受体拮抗剂普鲁司特(0.2~10μmol/L)和孟鲁司特(0.2~10μmol/L)以及CysLT1/CysLT2受体非选择性拮抗剂BAY u9773(0.02~1μmol/L),对OGD损伤无明显保护作用。结论:半胱氨酰白三烯受体激动剂和拮抗剂对大鼠原代神经元及缺血性损伤无明显作用。     

稳恒磁场对体外培养的大鼠脑神经细胞影响的研究

目的 观察稳恒磁场对体外培养的大鼠幼鼠脑神经细胞的影响.方法 原代培养新生Wistar大鼠的脑皮质神经细胞,测定未照射对照组及30 mT和50 mT强度的稳恒磁场照射组细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量;细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和NO含量.结果 30mT强度照射组和50 mT强度照射组...     

胆红素诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡的研究

目的从细胞与分子水平探讨胆红素神经毒性的机制。方法采用原代培养的大鼠小脑颗粒和大脑皮质神经元,观察胆红素对其毒性的影响。并用ＤＮＡ染色及琼脂糖凝胶电泳法确定胆红素诱导神经元死亡时的形态学及生物化学改变的特征。结果胆红素在０～１７μｍｏｌ／Ｌ的浓度下,选择性地、剂量与时间依赖性地诱导小脑颗粒神经元死亡,呈现凋亡的特征为：核染色质浓缩与ＤＮＡ双链断裂成小片段;在凝胶电泳图上呈“梯形”样改变;用ＲＮＡ和蛋白质合成抑制剂预处理神经元,可阻断其死亡。说明胆红素诱导小脑神经元死亡的过程需要蛋白质的合成。而此浓度的胆红素对大脑皮质神经元的毒性明显低于小脑神经元。结论胆红素可以选择性地诱导小脑颗粒神经元凋亡。     

原代培养神经元类缺血再灌后UCP4的表达与ROS的相关性

目的 观察原代培养神经元类缺血再灌后UCP4的表达与细胞内活性氧水平的变化,探讨二者关系及其意义. 方法 取新生Wistar大鼠的大脑皮质神经元进行原代培养,将培养10 d的大鼠皮质神经元随机分为正常组和类缺血再灌注组,采用免疫细胞化学法观察类缺血再灌后3 h,6 h,12 h时UCP4的表达变化,应用流式细胞仪检测细胞内活性氧量的变化.结果 与正常组比较,在类缺血再灌后3 h,6 h,12 h UCP4的表达持续降低(P<0.05),同时细胞内活性氧量亦渐增高(P<0.05).经相关性分析表明UCP4的表达与细胞内活性氧呈负相关. 结论 UCP4可能参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程;其表达的降低可能影响细胞内活性氧量的变化.     

p38MAPK蛋白在体外培养神经元中的表达及W-7的干预作用

目的:探讨p38MAPK蛋白在体外培养神经元中的激活及钙调蛋白抑制剂W-7的干预作用.方法:神经元原代培养并采用NSE免疫细胞化学技术鉴定神经元.取原代培养7 d的大鼠皮质神经元随机分为5组:正常对照组,仅用DMEM/F12完全培养基;NMDA组,去除正常神经元培养液,加入NMDA 50 μmol·L-1,处理时间10...     

邻苯二甲酸二丁酯对原代培养海马神经元的毒性及机制

目的 本研究探讨邻苯二甲酸二丁酯（DBP）暴露对原代培养海马神经元的神经毒性及可能机制。方法 海马神经元原代培养4 d后将海马神经元暴露在含有终浓度为0.0（对照）、1 g/LDBP的培养基中，选取染毒24、48、96 h 3个时相点，免疫荧光及透射电子显微镜下观察DBP染毒后海马神经元轴突及超微结构的形态变化；膜片钳测定海马神经元的动作电位；cck-8检测DBP染毒后海马神经元活性。Western blot测定脑源性神经营养因子（BDNF）、神经肽Y（NPY）、雌激素受体β（ERβ）核酸及蛋白的表达情况。高效液相色谱串联质谱检测神经递质GABA的释放。结果 DBP染毒96 h后神经元网络稀疏、轴突长度变短（P<0.01），电镜下细胞核呈圆形，染色质聚集，细胞质空泡化；膜片钳测定发现DBP染毒96 h后细胞出现去极化漂移、放电频率增加（P<0.01）；cck-8检测发现DBP染毒24、48、96 h的细胞活性均低于同时间点正常对照组（P<0.01）。DBP染毒48、96 h的ERβ、BDNF、NPY蛋白表达显著低于对照组（P<0.05）。DBP染毒96 h后神经递质GABA的释放显著低于对照组（P<0.05）。结论 DBP染毒后可导致海马神经细胞形态受损，并导致功能改变，这可能与神经递质GABA参与的ERβ-BDNF-NPY信号通道受阻相关。     

体外培养大鼠皮层神经元和星形胶质细胞氧糖剥夺后DDR1的表达情况

目的:探讨DDR1蛋白在氧糖剥夺后的神经元细胞及星形胶质细胞中的表达情况,推测可能机制。方法:采用SD孕鼠的胚鼠皮层培养神经元,采用新生SD大鼠皮层培养星形胶质细胞。建立氧糖剥夺(OGD)损伤模型并随机分为神经元正常对照组、神经元OGD组、星形胶质细胞正常对照组和星形胶质细胞OGD组。噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞活性;免疫荧光染色及Western blot方法检测各组DDR1的表达情况。结果:与正常对照组相比,OGD组细胞形态发生明显改变,MTT法测得细胞活性值降低;与神经元正常对照组相比,神经元OGD组的DDR1蛋白表达水平增加(P<0.05);与星形胶质细胞正常对照组相比,星形胶质细胞OGD组的DDR1蛋白表达水平无明显增加(P>0.05)。结论:OGD处理可诱导DDR1蛋白在大鼠皮层神经元中的表达,提示DDR1蛋白可能参与OGD后细胞凋亡等病理生理过程。