用nested RT—PCR法检测肝癌患者外周血癌细胞

寻求一种高灵敏的检测肝癌患者外周血中部细胞的方法。方法：采用ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ－ＰＣＲ法检测外周血中的肝癌细胞。能从２ｍｌ人外周静脉血中检测到１０个左右肝癌细胞表达的人甲胎蛋白ｍＲＮＡ。。此方法特异性强，灵敏高，可作为一种理想的临床检测手段。     

铜锌超氧化物歧化酶基因对HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）对肝癌细胞增殖的抑制作用。方法：利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术，将人铜锌ＳＯＤ基因导入人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２细胞内，获得高表达。检测其对ＨｅｐＧ２细胞生物学特性的影响。结果：与对照相比ＳＯＤ基因转染后的肝癌细胞生长受到抑制，细胞体积变大，分裂象减少，Ｓ期细胞比率减少，软琼脂集落形成率低，裸鼠成瘤瘤体小。结论：铜锌ＳＯＤ基因具有抑制ＨｅｐＧ２肝癌细胞增殖的作用。     

外周血中肝癌细胞转移的检测

目的 寻找检测外周血中肝癌细胞的灵敏方法，以便早期发现肝癌患者的血行微转移灶。方法 采用逆转录和巢式多聚酶链式反应及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术，将ＡＦＰ ｍＲＮＡ作为肝癌细胞的特异标志，特异扩增检测肝癌患者外周血中微量转移的肝癌细胞。结果 ３０全正常人和２１例肝转移癌均阴性，２４例慢性肝病中有１例阳性；８３例肝癌患者有５１例阳性，阳性率６１．５％。结论 用此方法可以较目前其它检查方法更早发现肝癌患者     

不同肝病者外周血sIL-2R的检测及意义

目的：探讨几种肝病患者外周血可溶性白细胞介素２受体（ｓＩＬ２Ｒ）水平状态及其临床意义。方法：采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测慢性乙型肝炎、肝硬化和原发性肝癌患者（共７０例）与健康人（２２例）的外周血ｓＩＬ２Ｒ水平，并比较原发性肝癌（１５例）手术前后ｓＩＬ２Ｒ水平的变化。结果：与对照组相比，慢性乙型肝炎、肝硬化和原发性肝癌患者的ｓＩＬ２Ｒ水平明显增高；肝癌术后ｓＩＬ２Ｒ水平明显下降；ｓＩＬ２Ｒ水平与肝癌临床分期相关。结论：进一步证实血清ｓＩＬ２Ｒ水平可间接反映几种肝病的细胞免疫功能状态。     

巢式RT—PCR检测肝癌患者外周血微量转移癌细胞

目的建立肝癌患者外周血微转移癌细胞的分子检测方法.方法从肝癌患者外周血中分离有核细胞,用TRzol提取RNA,特异引物扩增AFPmRNA,凝胶电泳观察结果.分析AFPmRNA扩增结果与患者临床指标的关系.结果肝癌患者外周血有核细胞RNA提取成功率为100%,33例肝癌患者AFPmRNA阳性率为69%(23/33),临床肝内门静脉癌栓、肝外转移患者AFP'mRNA扩增阳性率为100%,临床无转移患者AFPmRNA阳性率为56%(15/27),P＜0.05,AFPmRNA阳性患者的肿块最大径平均为10.67,AFP＞400μg/L者占40%(8/20),AFP'mRNA阴性患者肿块最大径平均为7.13cm,AFP＞400μg/L者占10%(1/10).结论巢式RT-PCR是检测肝癌患者外周血微转移癌细胞的稳定方法.     

RT-PCR法检测肝癌患者周围和肝静脉血AFP mRNA及其临床意义

目的：通过对外周静脉因和肝静脉血AFPmRNA表达检测的比较，旨在寻找一种比较好的监测肝癌细胞转移的方法，并了解肝癌细胞在体内的转移机制。方法：抽取肝癌患者外周及肝静脉血，采用RT－PCR方法检测AFPmRNA，比较二者的阳性率。结果：在肿瘤直径＞5cm的肝癌患者，其外周血，肝静脉血AFPmRNA表达差异无显著性（P＝0．618），而在直径＜5cm的肝癌患者，其二处血AFPmRNA表达差异有显著性（P＝0．028）。结论：肝癌直径＜5cm的患者，直接检测肝静脉血能更准确地反映肝癌细胞肝内播散的情况。肝癌直径＞5cm的患者中，外周血，肝静脉血AFPmRNA表达差异无显著性，这部分患者的外周血AFPmRNA可代表其肝静脉血中AFPmRNA的状况。     

改良IME-FICC方法对乳腺癌外周血微转移的检测

【目的】探讨一种改良IME-FICC（免疫磁珠富集-免疫荧光细胞化学）法检测乳腺癌外周血微转移癌细胞及其意义。【方法】通过与磁珠共价结合的表皮细胞黏附分子（EpCAM）抗体富集外周血中表达EpCAM的癌细胞，结合免疫荧光化学法检测细胞角蛋白（CK）8／18阳性的癌细胞（呈绿荧光）。放置MCF-7乳腺癌细胞于正常人外周血标本中以检验本方法癌细胞回收率及敏感度，检测20例正常女性志愿者及12例Ⅳ期乳腺癌患者治疗前的外周血标本，探索其特异性及临床应用可行性。【结果】免疫磁珠富集后癌细胞回收率达86％～93％．可在10^7外周血单个核细胞中检测到1个癌细胞，特异性为100％。Ⅳ期乳腺癌患者外周血中CK8／18阳性细胞检出率75％。【结论】改良IME-FICC法是一种简便、省时、敏感性及特异性高的检测方法，有较大的临床应用前景。     

肝星状细胞经趋化因子SDF-1/CXCR4轴途径促进肝癌细胞侵袭的作用及其机制

目的：探讨肝星状细胞（HSC）通过SDF-1/CXCR4轴对肝癌细胞侵袭的影响和可能机制,为研究肝癌的侵袭过程提供依据。方法: 采用Western blotting和RT-PCR检测HSC LX02和肝癌细胞MHCC97、SMMC7721、Hep3B、HepG2中SDF-1和CXCR4的表达。采用Transwell实验检测LX02共培养或外源性SDF-1干预对肝癌细胞HepG2以及CXCR4基因沉默后的HepG2侵袭的影响。Western blotting法检测上皮标志E-Cadherin和间质标志Vimentin的表达水平。结果：与肝癌细胞比较,LX02中趋化因子SDF-1呈高表达（P<0.05）。4株人肝细胞癌细胞均有CXCR4高表达。HSC或SDF-1均能促进肝癌细胞HepG2侵袭（P<0.05）,并诱导E-Cadeherin蛋白表达下调,Vimentin蛋白表达上调。通过RNA干扰技术靶向沉默肝癌细胞CXCR4基因后,HSC和SDF-1对肝癌细胞HepG2侵袭能力均无明显影响（P>0.05）,肝癌细胞E-Cadeherin、Vimentin蛋白及mRNA表达水平亦无明显变化。结论：HSC可通过SDF-1/CXCR4轴促进肝癌细胞侵袭,其机制可能与诱导肝癌细胞上皮-间质转化有关。     

大肠癌患者外周血微转移的分子诊断

目的 探讨大肠癌患者外周血微转移的分子诊断方法。方法 以非同位素RT-PCR方法，检测21例大肠癌患者术前和术后外周血中大肠癌细胞的标志物细胞角蛋白20(cytokemtin，CK20)，同时检测10例健康者外周血作对照。结果 21例病人外周血中查出CK20阳性表达14例，阳性率66．67％，10例健康者外周血均无CK20表达。结论 检测大肠癌患者外周血微转移癌细胞有助于早期诊断大肠癌肝脏微转移。     

一氧化氮对人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2生长增殖的影响

目的：应用两株人肝癌细胞（SMMC-7721和HepG2）为实验模型，以硝普钠（SNP）为NNO供体，探讨NO对人肝癌细胞生长增殖的影响。方法：应用MTT、荧光染色技术和电子显微技术、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术定性和定量地检测SMMC-7721和HepG2细胞凋亡情况。结果：NO供体SNP能抑制人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2的生长增殖，并诱导其凋亡，在一定范围内呈时间-剂量依赖关系，同时也引起细胞坏死；SMMC-7721细胞对NO作用的敏感性较HepG2高。结论：NO可抑制人肝癌细胞生长增殖，诱导细胞凋亡，并引起死亡，且两株细胞对其敏感性不同。     

应用荧光定量PCR检测肝细胞癌微小转移

目的：探讨甲胎蛋白（AFP）-mRNA在肝细胞癌（HCC）患者外周血中的表达和临床意义。方法：采用荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-PCR）方法,检测25例HCC患者外周血中AFP-mRNA的表达。结果：HCC患者外周血中AFP-mRNA表达率显著高于肝炎和肝硬化患者（P〈0.01）。HCC患者外周血中AFP-mRNA表达与患者的肝外转移可能相关,与患者的临床分期、肿瘤直径、数目、血清AFP水平无明显相关（P〉0.05）。结论：AFP-mRNA可作为血液循环中肝癌细胞的标志物。     

原发性肝癌患者外周血中肝细胞特异性AFP mRNA检测及意义

【目的】寻找一种敏感的方法以检测原发性肝癌患者外周血中肝细胞特异性AFPmRNA。【方法】巢式RT PCR检测外周血有核细胞成分中AFPmRNA。【结果】 49例肝癌中 17例检出AFPmRNA ,阳性率 35 % ,其中 9例证实有转移的 6例阳性 (6 7% )。 19例肝硬化、6例急性肝炎、8例慢性肝炎、5例肝良性肿瘤、6例肝内胆管癌、11例肝转移癌、13例健康对照组均为阴性。外周血细胞AFPmRNA的存在与肝内肿癌灶的数目、是否有门静脉癌栓形成、远处器官转移与肿瘤的TMN分期密切相关 ,与血清AFP浓度无关。【结论】检测肝癌患者外周血AFPmRNA ,可帮助早期发现肝癌细胞的血行播散。     

原发性肝癌患者外周血甲胎蛋白mRNA表达水平与临床参数的关系

目的　了解肝细胞癌患者外周血甲胎蛋白 (AFP)mRNA的表达水平与不同临床参数的关系。方法　采用realtimeRT -PCR技术 ,定量检测 5 6例肝细胞癌、17例慢性活动性肝炎、2 1例肝硬化和 2 0名健康志愿者外周血AFPmRNA的表达水平。结果　 5 6例肝癌患者外周血AFPmRNA的平均表达水平为 34 6 44 .6± 9490 5 .4copies/μgRNA ,其中 2 9例为阳性 ;17例慢性活动性肝炎、2 1例肝硬化患者和 2 0名健康志愿者外周血均未检测到AFPmRNA的表达。结论　肝癌患者外周血AFPmRNA表达水平与肝癌分期、门静脉癌栓及肝外转移密切相关 ,与肿瘤直径、数目及血清AFP水平无明显相关 ,可作为预测肝癌发生远处转移的一个可靠指标     

肝癌外周血AFP mRNA的测定及意义

目的 建立一种灵敏的巢式逆转录聚合酶链反应法（ＲＴ－ＰＣＲ）,用于检测外周血中的ＡＦＰ ｍＲＮＡ。方法 将患者分成四组：原发性肝细胞癌组３８例,慢性肝炎组９例,肝炎后肝硬化组１２例,正常对照组１０例。通过采肝素抗凝外周血、分离单个核细胞、抽提ＲＮＡ、逆转录合成ｃＤＮＡ、设计ＡＦＰ基因引物来进行巢式ＰＣＲ扩增。 结果 所有正常人外周血中ＡＦＰｍＲＮＡ全部阴性,原发性肝细胞癌组的外周血中ＡＦＰ ｍＲＮ     

肝细胞癌患者血液AFP mRNA检测的临床意义

目的：探讨肝细胞癌患者血液甲胎蛋白（ＡＦＰ）ｍｒＲＮＡ检测的临床意义。方法：取９３例肝癌患者,１５例肝炎后肝硬化患者,１２例慢性肝炎患者及１０例健康人静脉血各５ｍｌ,应用巢式ＲＴ－ＰＣＲ检测其周围静脉血中ＡＦＰｍＦＮＡ。结果：在５０个肝癌血标本中检测到ＡＦＰｍＲＮＡ（５３．８％）,而对照组中未检测到１例。ＡＦＰｍＲＮＡ检出率与肝癌分期、血清ＡＦＰ浓度、肝内转移、门静脉癌栓、肿瘤大小及远处转移有明显     

联合免疫磁珠与逆转聚合酶联反应在肝细胞癌患者外周血癌细胞检测中的应用

目的 研究联合免疫磁珠分类与巢式逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）在肝细胞癌患者外周血癌细胞检测中的应用价值。方法 分别收集肝细胞癌（45例）、肝硬化（16例）、肝炎（20例）患者及健康人（18例）的外周血，以CD15和Ber-EP4免疫磁珠富集血液中的癌细胞，用巢式RT-PCR检测其外周血甲胎蛋白（AFP）mRNA水平。结果 AFPmRNA在肝细胞癌、肝硬化和肝炎患者的检出率分别为72．1％．43．8％和25．0％，肝细胞癌组与肝硬化组和肝炎组比较的差异均有显著性意义（P〈0．05和P〈0．01）。结论 联合免疫磁珠分类与巢式RT-PCR法可提高肝细胞癌患者外周血AFPmRNA的检出率。     

外周血胰岛素样生长因子Ⅱ-mRNA对肝癌的诊断价值

目的探讨外周血胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF-II）-mRNA在肝癌诊断和判断预后中的价值。方法从癌组织和外周血中制备总RNA,经随机引物和逆转录酶作用合成IGF-ⅡcDNA,再分别以RT-PCR扩增IGF-ⅡcDNA片段,分析其在肝病诊断与鉴别中的临床价值。结果肝癌组织和外周血中扩增出的IGF-Ⅱ基因片段大小为170bp,并与原设计相一致。肝癌、癌灶周围和远癌组织中,IGF-Ⅱ基因检出率分别为100%、53.3%和0。肝癌患者外周血IGF-II基因片段阳性率34.2%,在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期肝癌中分别为14.3%、19.4%和45.5%,在伴有肝外转移肝癌中全数阳性,在AFP〈50ng/ml的17例中阳性6例（35.3%）;肝硬化、慢性肝炎、急性肝炎和肝外肿瘤组中未见IGF-Ⅱ基因片段阳性。IGF-Ⅱ基因标志与肝癌大小间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论外周血IGF-Ⅱ基因分析有助于肝癌的诊断、转移判别及术后复发的监测。     

肝癌组织及外周血IGF—IImRNA片段扩增的临床应用

目的：探讨外周血胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF－Ⅱ）－mRNA在肝癌诊断和判断预后中的临床价值。方法：从肝癌组织和外周血有核细胞中帛备总RNA,经随机引物和逆转录酶作用合成cRNA,再分别以RT－PCR扩增IGF－Ⅱ基因片段,分析其在肝病诊断与鉴别中的临床价值。结果：在肝癌组织和外周血中扩增出的IGF－Ⅱ基因片段大小为170bp,并与原设计相一致;30份肝癌、癌灶周围和远癌组织中,IGF－Ⅱ基因检出率分别为100．0％、53．3％和0．0％;外周血IGF－Ⅱ基因片段阳性率：肝癌患者为34．2％,肝硬化、慢性肝炎、急性肝炎和肝外肿瘤组中未见 阳性;在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期肝癌中分别为14．3％、19．4％和45．5％;有伴有肝外转移的13例肝癌中全数阳性;在17例AFP＜50ng/ml的肝癌中,IGF－Ⅱ基因分析有助于肝癌的诊断、转移判别及术后复发的监测。