含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗的构建和免疫原性研究

目的研制基于表位的SARS-CoV基因疫苗,为传统灭活或减毒疫苗提供有益的配伍选择。方法通过网络数据库结合生物软件分析的方法,确定可能在SARS-CoV感染过程中起重要作用并具较好抗原性参数的结构区域作为候选抗原表位,以密码子优化的方法提高表位串联蛋白的真核表达效率,构建了含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗。结果多表位串联基因接入真核表达载体后,可在真核细胞内高效表达。多表位嵌合SARS-CoV基因疫苗免疫小鼠后,可诱导融合蛋白特异的体液免疫反应。结论该基于多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗可以诱导抗体应答,为该疫苗的深入研究奠定了基础。     

CEA的多表位疫苗基因的设计及构建的表达载体在原核表达系统中的表达

目的 本研究设计肿瘤相关抗原CEA的多表位疫苗基因和构建的重组表达载体在原核表达系统中成功表达融合蛋白.方法 根据预测分析得到的表位氨基酸序列,选取预测分值较高的CTL表位(IMIGVLVGV)和B细胞表位(SNNSKPVEDK),并结合“非选择性”辅助T细胞表位(AKFVAAWTLKAAA)串联起来,按原核系统偏爱的氨基酸密码子优化,委托生物技术公司合成寡核苷酸,退火获得目的基因,并将目的基因克隆至原核表达载体pET32a(+)多克隆位点内.将此重组载体转化E.coli BL21(DE3)表达融合蛋白,并经SDS-PAGE、Western blot分析鉴定.用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表位融合蛋白ozlf-86/87.结果 嵌合有多表位目的基因的原核重组质粒pET32a(+)/ozlf-86/87,进行酶切和测序鉴定,构建成功.SDS-PAGE分析表明,重组质粒在37℃1.0mmol/L IPTG条件下诱导6h能很好地表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为20kDa,与预期Mr大小吻合;蛋白表达量均约占细菌总蛋白量的20％.,并经Western blot鉴定为目的蛋白.用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化成功获得表位融合蛋白,即ozlf-86/87,纯度达到90％以上.结论 本研究获得的多表位融合蛋白对胃肠道恶性肿瘤诊断试剂的研究和进一步的疫苗研究奠定了基础.     

间日疟原虫多表位疫苗基因的设计、合成与酵母表达

目的针对疟原虫生活史复杂,蛋白种类多且具有期特异性,逃避宿主免疫机制健全,流行广泛等特点,构建间日疟多期多阶段多表位疫苗候选株。方法根据文献报道筛选间日疟有效保护性抗原表位,利用计算机模建技术进行组合、排列,演绎多表位肽基因,人工合成基因,构建酵母表达系统,甲醇诱导表达多表位肽。结果以间日疟原虫3个PvCSPT表位、1个PvCSPB细胞表位、2个PvMSP-19B细胞表位、2个PvDBP-Ⅱ保守序列、1个PvAMAB细胞表位和1个PvAMAT细胞表位,加入白喉毒素T细胞表位和Pan-DRTh细胞表位肽,设计合成了一条由786bp组成的间日疟原虫多表位肽疫苗基因(PvDBW);利用G418压力筛选得到多个高拷贝pPIC9K/PvDBW/P.pastoris菌株;用甲醇诱导后表位肽呈分泌性表达,表达量为80mg/L。结论成功地构建了间日疟原虫多期多阶段多表位疫苗pPIC9K/PvDBW/P.pastoris菌株,得到了分泌性表达的多表位肽,为探索间日疟原虫多期、多表位疫苗的可行性奠定了物质基础。     

表位肽疫苗的研究进展

目前应用的疫苗主要是以减毒、灭活的病原体及其抗原成分（亚单位疫苗）为基础,存在生物危害性和遗传变异致使原疫苗效力丧失等问题。而且传统的疫苗无法对大多数肿瘤及HIV、HCV、结核杆菌等几种难以克服的传染性疾病实施有效的治疗和预防。随着生物化学、分子免疫学技术及基因工程技术的发展,表位疫苗的出现弥补了传统疫苗的一些不足,尤其在诱导细胞免疫方面,减少了疫苗毒副作用,提高了安全性,增强了免疫针对性。目前,表位疫苗在避孕、传染性疾病、恶性肿瘤疫苗等方面已成为研究的热点。     

HIV多抗原表位疫苗的构建

以CD8^＋的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和CD4’的辅助性T淋巴细胞（HTL）为介导的细胞免疫应答是有效地控制和清除包括HIV在内的多种病毒病原体的必备条件。因而，人们对于能够诱导CTL和HTL免疫应答的HIV-1疫苗的研究兴趣浓厚，使HIV疫苗很快由学术研究向商品开发和工业生产等领域过渡和延伸。     

基于胃癌MG7-Ag模拟表位基因疫苗的构建

目的 构建以胃癌MG7－Ag模拟表位为基础的DNA疫苗。方法 将HindⅢ酶切位点、ＭＧ７－Ａg模拟表位和通用性辅助性Ｔ细胞（Ｔh细胞）表位编码序列的反向互补序列顺次设计于下游引物中，通过２次聚合酶链式反应将２种表位连接于一段载体基因，ＨindⅢ酶切位点位于载体片段与表位基因之间，将目的基因插入pUCm-T载体，酶切鉴定和序列测定证实后，利用pUCm-T载体和pcDNA3.1( )载体共有的ＫpnⅠ和ＸbaⅠ酶切位点，将目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )载体，酶切鉴定后，利用目的的基因和pcDNA3.1（＋）载体上的ＨindⅢ酶切位点，ＨindⅢ酶切去除载体基因片段，得到胃癌ＭＧ７－Ａg模拟表位和通用性Ｔh细胞表位的真核表达载体。结果 经序列测定证实：ＰＣＲ产物为载体基因、ＨindⅢ酶切位点、ＭＧ７－Ａg模拟表位及通用性Ｔh细胞表位的融合片段，最终得到的重组pcDNA3.1（＋）质粒含有正确编码以上２种表位的基因片段。结论 以胃癌ＭＧ７－Ａg模拟表位为基础的ＤＮＡ疫苗构建成功，为进一步研究其在胃癌免疫治疗中的作用奠定了基础。     

表位疫苗的研究进展

疫苗（vaccine）是控制乃至消灭传染性疾病的有效手段。 传统疫苗有2种：减毒活疫苗和灭活疫苗。减毒活疫苗虽可刺激机体产生CTL、Th反应，并增强体液免疫等多种保护性反应，但减毒不充分可导致临床感染，减毒过强又可使疫苗效价降低。死疫苗虽然比较安全，但亦有一定的毒副作用。     

人癌胚抗原基因的克隆及基因疫苗的构建

目的:克隆人癌胚抗原(CEA)基因cDNA,构建CEA基因疫苗.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人结肠癌细胞组织克隆出细胞中CEA基因片段,通过基因重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1真核表达载体上,构建成pcDNA3.1/CEA疫苗,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对pcDNA3.1/CEA疫苗进行鉴定.结果:经PCR扩增发现2.1 kb的目的基因条带、酶切电泳分析可见2.1 kb的目的基因条带和5.4 kb的载体条带、DNA测序证实载体中的目的基因序列与CEA的cDNA序列完全相同.结论:本实验成功地克隆了CEA 基因并构建了其基因疫苗,为进一步研究CEA基因疫苗抗肿瘤的实验打下基础.     

靶向人端粒酶逆转录酶T细胞表位肽的治疗性癌症疫苗研究进展

人端粒酶逆转录酶(hTERT)是人端粒酶的催化亚单位,正常成熟组织中基本无表达,而在多数恶性肿瘤中高表达,而使其成为恶性肿瘤特异性疫苗免疫治疗的首选抗原.T细胞表位肽疫苗是用抗原的T细胞表位制备的疫苗,在肿瘤免疫治疗中有其独特的优势.hTERT的T细胞表位肽疫苗可诱导机体产生特异性免疫应答,在小鼠体内显示了抗肿瘤效应,并已进入人体试验阶段,显示出较好的应用前景.文中就hTERT的T细胞表位肽疫苗在恶性肿瘤中的免疫治疗的研究进展作一综述.     

以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体的构建

目的：构建以HBV HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达质粒，以探讨HBV基因免疫的新途径。方法：PCR扩增HBc第1－72aa及93－183aa编码序列并定向克隆至pcDNA3.1的NheI/XhoI位点，构建真核表达载体pHBcdM。合成HBV多表位基因并插入HBc原脊区基因位点，构建HBc-Mep融合基因真核表达质粒。经PCR、酶切及序列测定等方法筛选阳性质粒。结果：双酶切及测序结果证实阳性质粒正确克隆了约885bp、编码HBc与HBV多表位的复合基因。结论：成功构建了以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体pHBc-Mep，为研究pHBc-MeP作为DNA疫苗的免疫活性奠定基础。     

人肝细胞癌抗原HCA661 DNA疫苗的构建

目的：构建人肝细胞癌特异性抗原HCA661的DNA疫苗。方法：通过PCR从SMMC7721中获得编码肝细胞癌特异抗原HCA661的基因组DNA序列,插入pGEM-T easy载体后测序,并将目的基因定向亚克隆进入真核表达载体pCI-neo,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pCI-neo-HCA661。结果：PCR产物为 1 040 bp,测序结果与Gene Bank登记完全相同;PCR和酶切结果表明,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的目的基因片段。结论：成功地构建了含有HCA661基因的DNA疫苗。     

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白与外膜蛋白基因融合DNA疫苗载体的构建

目的 为增强问号赖型钩端螺旋体（钩体017株）DNA疫苗内鞭毛蛋白基因（flaB2)与外膜抗原基因（ompL1)的免疫保护作用，构建一种能表达flaB2与omPL1蛋白融合蛋白的DNA疫苗载体。方法 通过聚合酶链反应分别扩增017钩体flaB2与ompL1片段并进行融合，获得的嵌合基因ompL1-flaB2中含有10个氨基酸的中间接头序列，以维持其空间构象，结果 经酶切鉴定，证实有一1.8kb片段插入载体，其flaB2及ompL1DNA测序结果与文献报道的一致。结论 表达017株钩体flaB2与ompL1抗原融合蛋白的DNA疫苗载体构建成功。     

霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达

目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。     

乙肝核心抗原DNA疫苗的构建及其免疫原性分析

构建ＨＢＶ核心抗原ＤＮＡ疫苗,并探讨基实验动物内的表达及其免疫原性。方法：采用ＰＣＲ法从ＨＢＶ全基因ＤＮＡ中获得核心抗原ＤＮＡ片段,并将其重组到ｐｃＤＮＡ３载体。以此为候选疫苗分别免疫小鼠和树Ｊｕ,并检测其抗ＨＢｃＩｇＧ。结果：构建了乙肝核心抗原候选核酸疫苗ｐｃＤＮＡ３－ＨＢｃ。免疫接种该疫苗后第２周抗ＨＢｃＩｇＧ水平开始升高,小鼠至第９周,树Ｊｕ至第７周升至峰值。结论：构建ｐｃＤＮＡ３－ＨＢＣｄ     

依赖于STR的法医学DNA分型技术研究进展

ＤＮＡ分型技术 ,又称ＤＮＡ指纹技术 ,是对人类基因组中具有多态性的重复序列进行基因分型的技术。该技术首先出现在 2 0世纪 80年代中期 ,它的出现使法医学实验室根据一个人的体液进行个体识别的能力有了划时代的进步 ,从而摆脱以前依赖于血型、血清酶型和ＨＬＡ等技术而无法对个体识别做出肯定结论的尴尬境况。在过去的 16年里 ,现代分子生物学技术在法医遗传学中的应用使个体识别和亲权鉴定技术得到飞速发展 ,现在分析样本所需ＤＮＡ的量仅为 1985年英国遗传学家ＡｌｅｃＪｅｆｆｒｅｙｓ进行第一次ＤＮＡ分型所需量的 1/2 5～ 1/10 0 ;…     

CEA慢病毒载体的制备及其在树突状细胞中的表达鉴定

目的 构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒表达载体并包装成感染性病毒颗粒,获得稳定表达CEA的树突状细胞(DC).方法 以人CEA的测序质粒为模板,PCR扩增CEA全长,装入pLentiGFP转移质粒,经过测序证实其序列与标准序列完全一致.将pLentiGFP-CEA、包装质粒p△8.2和pVSV-G用LipofectamineTM2000共同转染293T细胞,包装成感染性病毒颗粒,感染树突状细胞,并进行RT-PCR和Western blot检验CEA在细胞中的表达.结果 DC细胞病毒感染48h后荧光显微镜观察CEA慢病毒载体在细胞中高效表达,PCR扩增可得到人CEA的2009 bp基因片段,与预期大小一致,Western blot显示CEA在感染DC中表达.结论 成功构建了CEA慢病毒表达载体,重组慢病毒感染DC细胞后表达出有活性的CEA蛋白,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

癌胚抗原特异性寡核苷酸适配子的体外筛选及其意义

目的:通过体外筛选获得癌胚抗原(CEA)特异性适配子,为高表达CEA肿瘤的靶向奠定基础。方法:构建长度为81 bp的随机ssDNA文库,体外筛选、富集CEA特异性适配子,通过配体介导的靶蛋白纯化实验检测经筛选的适配子与纯化蛋白结合;提取LS174T细胞总蛋白,免疫共沉淀检测经筛选的适配子与细胞总蛋白的结合。结果:经体外7轮筛选富集及筛选条件的优化,配体介导的靶标分离实验证实了筛选出的适配子与纯化CEA蛋白的结合;免疫沉淀及Westem blot证实了其识别并特异性结合天然状态的CEA。结论:经过体外7轮筛选,证实了所获得的CEA适配子可特异性地与纯化CEA和天然状态的CEA蛋白结合,为后续高表达的CEA肿瘤的靶向诊断和治疗奠定了初步的实验基础。     

Selection of DNA aptamer that specific binding human carcinoembryonic antigen in vitro

Objective：To select the specific aptamer of carcinoembryonic antigen （CEA）, one of the most attractive molecule for cancer target therapy and imaging. Methods： Seven rounds in vitro selection were performed against the purified CEA protein. Ligand-mediated target purification and Co-immunoprecipitation were adopted to verify the specific binding of the aptamer to the purified and native protein separately. Results：The CEA-specific aptamer which can bind both the purified and native protein with the high specificity was obtained. Conclusion：This is the first time the CEA specific apatmer was produced. The results in this study provides the preliminary evidence for further investigation and application of CEA-aptamer in the future.     

RT-PCR检测癌胚抗原基因转染树突状细胞的表达

目的 :通过向人DCs转染含人CEA真核表达质粒 ,使DCs特异性的表达和提呈CEA。方法 :RT -PCR检测转染人CEA真核表达质粒DCs的表达。结果 :转染CEA质粒的DCs,RT -PCR检测有一特异性扩增带。结论 :用脂质体能成功将人CEA真核表达质粒转入DCs并表达     

Cloning and sequence analysis of carcinoembryonic antigen promoter from human colorectal carcinoma with relative DNA fragment from normal tissues

Carclnoembryonicantigen(CEA),whichwasoriginallydescribedbyGoldandFreedmanin1965asacolontumor--relatedantigenLI,lsakindoftumor--associatedglucoproteinthatisexpressedinalargepercentageofprimaryandmetastaticcancersincludingcolon,lungandbreastcancers.SomeexperimentsindicatedthatCEAmayfunctionasacelladhesionmolecule,whichcouldplayanimportantroleinembryogenesisandtumordevelopment;'fTheCEAgeneisamemberofalarge,rapidlyevolvingimmunoglubinsupergenefamily,whosegenesrevealahighdegreeofsequencesimila…