缺口连接酶链反应检测沙眼衣原体DNA的实验研究

目的:建立缺口连接酶链反应方法检测沙眼衣原体.方法:根据编码CT主要外膜蛋白的基因(ompl)的稳定区设计2对互补的寡核苷酸探针.采用G-LCR和常规PCR扩增CT标准株DNA,并对二者检测CT的敏感性进行比较.结果:对5种CT标准株进行G-LCR扩增,均出现54bp长度的DNA片段.敏感性实验可检测出2个CT原体,而PCR可检测出20EBs.G-LCR较PCR敏感10倍;在特异性方面,不扩增肺炎衣愿体及其他细菌DNA,具有很高的特异性.结论:G-LCR用于检测沙眼衣原体特异、敏感、快速、准确,可为CT感染的临床诊断提供依据.     

结核分支杆菌耐多药株katG突变SSCP技术检测的研究

目的 建立并评价ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测结核分支杆菌耐药性基因突变的方法。方法 根据ｋａｔＧ基因易变区设计一对引物,ＰＣＲ扩增,产物经沸点断裂成单链,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,比较电泳的位置。结果 ＰＣＲ检测结核菌ＤＮＡ的灵敏度达到１００个细菌／ｍｌ,与其它细菌和其他分支杆菌无交叉反应。３０株敏感株和Ｈ３７Ｒｖ的ＰＣＲ产物经ＳＳＣＰ检测正常,２０株耐异烟肼结核菌中,１９株的ＰＣＲ产物ＳＳＣＰ检测游异常电泳带     

临床分离多重耐药肠杆菌科细菌Ⅰ类整合子检测及耐药性研究

[摘要] 目的　检测临床分离多重耐药肠杆菌科细菌Ⅰ类整合子分布,分析I类整合子在细菌多重耐药中的作用。方法　标准纸片扩散法(Kirby-Bauer test)检测耐药性,PCR方法扩增I类整合酶基因,经电泳后检测扩增产物。\结果　在分离出的408株细菌中,共有246株检出I类整合子,总体检出率为60.3%(246/408),其中大肠埃希菌检出率为62.4%(126/202),肺炎克雷伯菌检出率为56.8%(71/125),阴沟肠肝菌检出率为60.5%(49/81)。整合子阳性株对多种抗生素的耐药率明显高于整合子阴性株,亚胺培南对所有菌株敏感。结论　I类整合子对细菌多重耐药性的产生和传播起着重要作用,应加强临床细菌基因水平的耐药监测,采取有效措施防止耐药性的传播。     

临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌gyrA基因突变的研究

目的：检测临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌DNA促旋酶gyrA基因突变情况。方法：收集临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌30株及敏感株10株，测定其对萘啶酸、环丙沙星、氧氟沙星的最低抑菌浓度(MIC)；用聚合酶链反应(PCR)扩增gyrA基因部分片断，对PCR产物进行限制性片断长度多态性(PCR—RFLP)及单链构象多态性(PCR—SSCP)分析，检测gyrA突变情况。结果：30株耐喹诺酮菌株都检测到gyrA基因突变，PCR—RFLP均显示两条不同于敏感株的电泳带，其PCR—SSCP则检测到4种不同于敏感菌的迁徙率条带；而10株敏感菌均未检测到gyrA基因突变。结论：阴沟肠杆菌对喹诺酮类药物耐药性与gyrA基因突变有关，gyrA基因第83位氨基酸密码子突变可能为其耐药的主要原因。     

眼部分泌物中158株检出苗及其药敏分析

细菌性眼部结膜炎患者眼部分泌物中检出１５８株细菌。其中金黄色葡萄球菌１８株，表皮葡萄球菌１３株，铜绿假单胞菌１６株，其他假单胞菌６６株。分析结果可见假单胞菌感染率最高，眼部的正常菌群表皮葡萄球菌也可引发感染，细菌对庆大霉素的敏感较高，对氯霉素敏感率较低。     

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV），采用MHV－3，MHV－A59病毒株感染DBT细胞，37℃培养，待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物，进行RT－PCR扩增，结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA，同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。     

连接酶链反应检测男性就诊者尿标本中的沙眼衣原体

目的评价连接酶链反应(LCR)检测性病专科门诊男性就诊者尿标本中沙眼衣原体(CT)的敏感性和特异性。方法取852例患者尿道拭子作CT培养;同时取患者较长时间(2 h以上)不排尿后的首次尿(FVU)标本,用质粒LCR检测CT。对培养法和质粒LCR结果相异的标本,用另一针对CT主要外膜蛋白基因的LCR进行确证,参照“扩大的金标准”来确定检测结果。结果质粒LCR敏感性和特异性分别为98.6%和99.4%,而培养法分别为77.4%和99.5%,前者敏感性高于后者(P<0.001)。在伴或不伴尿道症状的就诊者间LCR敏感性和特异性无显著性差异。结论LCR是一种既敏感又特异的CT诊断方法。FVU可作为筛检男性CT感染的一种非损伤方法。     

实时荧光PCR和RT—PCR方法检测登革病毒的比较研究

目的通过2种检测登革病毒方法的比较，以提高检测登革病毒的灵敏度和特异性。方法利用Taqman MGB技术，根据登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对10份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT—PCR及荧光PCR扩增。结果RT—PCR检测10份临床血清标本，2份阳性，阳性率为20％。实时荧光PCR检测登革病毒与乙脑病毒无交叉反应，检测10份临床血清标本，5份阳性，阳性率为50％。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强，可作为登革病毒的快速检测方法，应用于登革热的临床早期诊断。     

PCR法检测人类脲原体U.Parvum和U.Urealyticum

目的 建立2个快速、同步检测脲原体U. Parvum和U. Urealyticum的PCR反应体系.方法 根据脲原体尿素酶B基因序列,设计2对分别针对U. Parvum和U. Urealyticum的特异性引物,建立2个PCR反应体系.通过脲原体标准株和临床阳性标本的PCR产物测序以及进行特异性和敏感性实验,对2个PCR体系进行评价.应用2个PCR反应体系对48例临床标本进行脲原体检测以及与培养法检测脲原体进行方法学比较.结果 2个PCR体系能够检测U. Parvum、U. Urealyticum标准株和临床标本中脲原体,扩增产物长度与目的片段大小一致.标准株和2个临床阳性标本扩增产物测序结果与GenBank中公布的序列完全一致.2个PCR体系与其他14株细菌(包括5株有尿素酶细菌)无交叉反应,检测限度均为10拷贝/ul的重组质粒DNA.对48例临床标本同时进行PCR和培养法脲原体检测,PCR的阳性检出率为54.2%,培养法为39.6%(P＜0.05).与培养法比较,PCR的灵敏度为94.7%,而与PCR法相比,培养法的灵敏度为69.2%.结论 2个PCR反应体系能够快速、同步进行临床标本中脲原体的分种鉴别,具有高度特异性和灵敏度.     

EB病毒gp85 N端片段的原核表达与初步鉴定

目的：构建EB病毒的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达；分析非搪基化的EB病毒包膜搪蛋白gps5N端截短片段的抗原性。方法：采用基因工程技术，以EB病毒B95—8细胞培养上清为模板，PCR扩增EB病毒的BXLF2基因N端片断。PCR产物经HindⅢ和xho Ⅰ双酶切，并插入原核表达载体pGEX-5T，构建pGEXST-85N重组表达质粒。在大肠杆菌BL21中诱导表达gp85N蛋白。纯化表达的蛋白进行蛋白免疫印迹鉴定，并免疫BALB/C小鼠。结果：序列分析表明。插入片段的序列与GenBank登录的参考序列完全—致。重组表达的蛋白的分子量约为45kD,与预期大小相符。可溶性重组蛋白纯化后免疫雕LuyC小鼠，经ELISA检测获得了高效价的多克隆抗体，且gp85单抗可识别所表达的gp85N抗原。Western blot结果显示，该抗原可与小鼠免疫血清起特异反应。结论：表达并纯化的EB病毒的截短gp85N重组蛋白具有良好的抗原性，为下一步分析所产生抗体的生物学特性提供条件。     

核酸扩增-液相杂交法检测沙眼衣原体DNA

目的：探讨用核酸扩增（PCR）－液相杂交法检测沙眼衣原体DNA的效果。方法：用PCR－液相杂交法对616份临床标本进行了沙眼衣原体检测，并与培养法比较，对与培养法结果不相符合的标本及部分阴性标本进行连接酶链反应（LCR）复检。结果：PCR－液相杂交相法检测沙眼衣原体特异性良好。灵敏度达到0.1fg，临床标本沙眼衣原体DNA阳性检出率为27.6％，显著高于培养法的6.3%（P＜0.001）。以培养法为标准，此法的灵敏度为100％。以LCR法为标准，此法的灵敏度为97.2％,特异度为80.7%，2者具有较好的相符性。结论：PCR－液相杂交法检测沙眼衣原体DNA操作简便，特异性强，灵敏度高，适合临床应用。     

16 SrRNA基因聚合酶链反应检测细菌感染的研究

目的：探索快速可靠的检测细菌感染的新方法。方法：通过自行设计合成的细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物,对２０ 种标准菌株、１２ 种２７ 株临床分离的细菌株、人基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。结果：对所测细菌株均获得３７１ ｂｐ 扩增产物,而与人基因组ＤＮＡ、巨细胞病毒无交叉阳性反应,ＰＣＲ最低能检测ｌｐｇ 大肠杆菌ＤＮＡ。结论：建立了用共同引物ＰＣＲ扩增以判断是否存在细菌感染的方法,该方法检测快速,敏感性和特异性高。     

16S-23S rRNA基因区间细菌鉴定实验研究

目的 :探讨 16 S- 2 3S r RNA基因区间对细菌鉴定的应用。方法 :以 16 S- 2 3S r RNA基因区间为靶序列设计引物 ,采用聚合酶链反应检测标准菌株及临床菌株 DNA。结果 :对 2 7株代表 2 7个菌种的标准菌株进行 PCR扩增 ,分别出现不同的 DNA图谱 ,该图谱能直接或经核酸内切酶处理后用于细菌分类 ,敏感性可达 2 .5 CFU/ml的细菌 ,与人外周血白细胞 DNA和真菌及病毒无交叉。 32株临床细菌标本均扩增出与相应标准菌株一致的图谱。结论 :16 S- 2 3S r RNA基因区间 PCR扩增技术检测细菌 ,具有敏感、特异、快速、准确的优点 ,为临床败血症病原的快速诊断提供了新的方法     

菌液SYBR实时荧光PCR快速检测金黄色葡萄球菌

目的建立菌液SYBR荧光PCR法快速检测金黄色葡萄球菌的方法。方法根据金黄色葡萄球菌的特异基因耐热核酸酶nuc设计引物,PCR方法和SYBR荧光PCR溶解曲线法验证引物的特异性;建立菌液SYBR荧光PCR快速检测方法,奶粉加标实验和菌株特异性实验评价方法的特异性,制备基因组浓度梯度和菌落梯度检验方法的灵敏性。结果利用引物对实验室的3个标准菌株进行PCR扩增,出现的条带均为单一条带,且与目的片段长度一致。16株金黄色葡萄球菌菌株的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,无非特异性扩增。建立的菌液SYBR荧光PCR方法对金黄色葡萄球菌有很好的特异性和灵敏性,灵敏度达1pg／山DNA浓度,并可检测1 CFU／ml的复杂样品。结论本研究建立的菌液SYBR荧光PCR方法快速、特异性好、灵敏性高,对快速检测样品中金黄色葡萄球菌有重要意义。     

建立环介导等温扩增方法检测腹泻患者中小肠结肠炎耶尔森菌

目的建立快速的检测方法对腹泻患者中的小肠结肠炎耶尔森菌进行快速检测。方法利用析因设计试验方法建立并优化检测小肠结肠炎耶尔森菌的环介导等温扩增技术（LAMP）,并与普通PCR法对临床腹泻标本进行检测比较。结果析因设计试验确定LAMP最佳反应体系：Mg2＋＋为2．0mmol,内引物FIP／BIP为1．6umol,dNTPs为1．6mmol,时间为60rain,反应温度为63℃。对12种细菌进行LAMP扩增,仅小肠结肠炎耶尔森菌获得阳性扩增结果,小肠结肠炎耶尔森菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别为38．05fg和15CFU／ml。对腹泻样本进行直接检测,检测限为150CFU／g。539例腹泻患者粪便标本中,LAMP成功检出13例样本中含有小肠结肠炎耶尔森菌,普通PCR检出11例,灵敏度为100％,特异度为99．62％。结论本方法检测小肠结肠炎耶尔森菌特异性强、灵敏度高．且操作简单、快速、检测成本低．适合基层单位及现场廊用．     

PCR测肝硬化腹水中细菌DNA的研究

目的探讨用PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性,了解肝硬化患者发生细菌移位的高危因素。方法在细菌16S rRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBV-DNA、37份肝硬化患者腹水进行PCR扩增。腹水中细菌DNA阳性者纯化后经核苷酸测序鉴别细菌种类,同时收集患者临床资料,运用SPSS11.5软件对患者基本临床特征及主要检验结果进行统计分析。结果7种对照菌株均得530bpDNA片段,而与人基因组DNA、HBV-DNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA。37份腹水中有9份获得530bp DNA片段(24.3%),而腹水细菌培养阳性率为5.4%(2/37),二者比较有显著性差异(P<0.05)。腹水中细菌DNA阳性和阴性的两组肝硬化患者在上消化道出血的发生率、血清总胆红素水平、凝血酶原活动度、Child-Pugh积分、腹水总蛋白浓度、外周血白细胞总数等比较,有显著性差异(P<0.05)。结论用通用引物通过PCR方法扩增细菌16S rRNA基因具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究。肝功能损害、腹水调理活性低下和上消化道出血是肝硬化患者发生细菌移位的高危因素。     

连接酶链反应结合荧光PCR法检测UGT1A1*28基因多态性

目的: 建立一种连接酶链反应结合荧光PCR的方法,检测结肠癌患者外周血UGT1A1*28基因多态性,并探讨其临床应用价值。方法: 设计连接酶荧光PCR引物和探针,首先通过连接酶反应,然后结合荧光PCR技术检测UGT1A1*28基因多态性,构建标准品评判该体系的特异性和敏感性,并检测50例结肠癌患者外周血标本,与DNA测序进行平行比较。结果： 此方法能准确地区分UGT1A1*28基因TA6/6、TA7/7及TA6/7基因型,且最低可检测5 ng人基因组DNA, 50例结肠癌患者外周血标本的检测结果与测序结果一致。 结论： 连接酶链反应结合荧光PCR可准确检测出UGT1A1*28基因多态性。     

环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的研究

用环介导等温扩增技术(LAMP)快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌.利用铜绿假单胞菌gbca基因,特异性设计3对LAMP引物,在反应体系中添加羟基萘酚蓝(HNB)荧光染料,通过反应前后颜色的变化肉眼观察结果,并用琼脂糖凝胶电泳加以验证.对临床标本利用LAMP和PCR法平行检测,验证该法灵敏度、特异性.针对铜绿假单胞菌DNA特异性引物的LAMP法可以扩增,其他无扩增产物.本实验建立的LAMP法具备简便、快速、特异性强和灵敏度高的特点,适于实际应用.     

聚合酶链反应法快速检测幽门螺杆菌

设计一互补于幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ，ＨＰ）脲酶Ｃ基因片段的引物，建立快速检测ＨＰ的ＰＣＲ方法。ＨＰ标准菌株和临床分离株基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳显示３０１ｂｐ的特异区带，而其它几种常见的肠道菌均呈阴性。ＰＣＲ可检出少至１００个幽门螺杆菌细胞，并能用于临床胃粘膜活检标本中ＨＰ的检测，是一种快速、灵敏和特异的检测１ＩＰ的方法。