人骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性观察

目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞(MSCs)部分生物学特性。方法：自健康人骨髓中分离出MSCs,进行原代培养,第5d首次更换培养液,以去除未贴壁细胞,以后每周换液2次,细胞铺满整个培养瓶底90％时开始传代培养。倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态及生长特性,并绘制传代细胞的生长曲线。流式细胞仪检测第3代MSCs细胞表面分子CD29、CD44,以进行MSCs鉴定。结果：MSCs体外培养为贴壁生长。MSCs原代培养约18～21d才达传代要求;传代培养细胞生长潜伏期仅24～36h,对数增长期约3～5d,之后为平台期,4～6d传1代。传至第8代,出现凋亡征象。第3代MSCs细胞表面CD29、CD44的表达率分别为90．6％和91．5％,MSCs均一性较高。结论：从人骨髓中分离出的MSCs在体外环境中具有很强的自我更新和分裂增殖能力。     

体外传代培养对人视网膜色素上皮细胞免疫调控能力的影响

目的 研究体外传代培养对人类视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelialium,HRPE)细胞免疫调控能力的影响.方法 建立HRPE细胞与异体淋巴细胞共培养系统,采用流式细胞术检测原代及传代HRPE细胞(第1、2、3、4、5、6代)Fas表达以及诱导异体淋巴细胞凋亡能力的差异.结果 HRPE与淋巴细胞体外共培养时,HRPE细胞Fas表达随着传代逐渐减弱,Fas表达与传代代数呈负相关(阳性细胞率r=-0.859,P＜0.001;平均荧光强度r=-0.880,P＜0.001),HRPE细胞诱导淋巴细胞凋亡随着传代逐渐减弱,淋巴细胞凋亡率与传代代数呈负相关(r=-0.838,P＜0.001),共培养时传代HRPE细胞Fas表达迅速下降,至第3代与第4代间Fas表达差异无统计学意义(P＞0.05),共培养时传代HRPE细胞诱导淋巴细胞凋亡率迅速下降,至第3代与第4代问淋巴细胞凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 体外传代培养的HRPE细胞,传代数越大细胞变异越大,第3代后细胞的免疫调控能力明显下降.     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养

目的 建立人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法.方法 运用植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养.倒置相差显微镜和免疫荧光染色方法对培养细胞进行鉴定.结果 原代和传代培养的细胞生长良好,光镜下细胞呈长梭形"峰-谷"样生长,具有典型的平滑肌细胞特征.经传代培养至第5代,细胞生长特性未见异常改变;经考马斯亮兰R250及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色检测,证实为平滑肌细胞.结论 植块贴壁法可成功进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养,传代后细胞生物学特征稳定,为慢性肾病并发心血管疾病的机制研究奠定了实验基础.     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养

目的建立人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法。方法运用植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养。倒置相差显微镜和免疫荧光染色方法对培养细胞进行鉴定。结果原代和传代培养的细胞生长良好,光镜下细胞呈长梭形"峰-谷"样生长,具有典型的平滑肌细胞特征。经传代培养至第5代,细胞生长特性未见异常改变;经考马斯亮兰R250及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色检测,证实为平滑肌细胞。结论植块贴壁法可成功进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养,传代后细胞生物学特征稳定,为慢性肾病并发心血管疾病的机制研究奠定了实验基础。     

软骨细胞体外分离培养与鉴定的实验研究

目的探讨兔关节软骨细胞分离、培养和鉴定的方法，建立软骨细胞的体外培养体系。方法4周龄新西兰白兔采用机械-酶消化法，分离膝关节软骨细胞接种培养以及传代培养．倒置相差显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化对细胞进行鉴定。结果成功建立了体外培养软骨细胞的实验方法。原代培养的软骨细胞呈多角形，传代3次后出现反分化。形态学、免疫化学染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定。甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色阳性。细胞传至5代后．出现“成纤维细胞样”。结论本研究建立了简单易行的软骨细胞分离、培养方法；初代、第2代、第3代细胞生长良好，适合于实验研究；软骨细胞5代培养后．细胞袁型发生改变。     

人喉上皮细胞的体外培养及生物学特性

目的建立一种有效的培养体系并提供一个研究人喉上皮细胞的体外模型。方法采用胎牛血清(2%)并添加促生长因子的培养基,对中晚期引产胎儿的喉黏膜进行组织块原代、传代培养,并通过倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜、细胞角蛋白免疫组化染色观察培养细胞的特性。结果组织块接种后3d即可见生长晕,10～14d时汇合成片,传代后24h即见细胞贴壁并开始增殖,约12d左右连接成片,可传代2～4代;组织块表层、深层细胞呈现不同的表现;培养细胞呈扁平、多角形,胞浆含张力原纤维,细胞间可见丰富的桥粒连接,细胞角蛋白表达阳性。结论本实验采用的培养方法和条件适宜人喉上皮细胞的生长;从生物学行为来看,体外培养的人喉上皮细胞来自于组织块的基底细胞和中间细胞,并与其来源细胞一样具有增殖能力和分化潜能,具有广阔的应用前景。     

酶消化法原代培养兔结膜成纤维细胞及进行传代培养的体会

目的 用酶消化法原代培养兔眼结膜成纤维细胞并进行传代培养。方法 取兔眼结膜，加入胰蛋白酶及乙二胺四乙酸二钠直接消化后放入孵箱培养，并通过改进后的传代培养技术将原代培养成功的成纤维细胞进行传代，观察细胞的生长情况。结果 原代培养7～9d成纤维细胞在培养基中长成单层且分布均匀。传代培养后3～4d成纤维细胞铺满培养基，即可再传代。结论 酶消化法原代培养兔眼结膜成纤维细胞比常规的组织块培养法更快促使细胞长成单层，且贴壁细胞分布更均匀。运用改进后的传代培养技术可以使成纤维细胞的增殖和纯化更加方便快捷。     

人牙周膜成纤维细胞的体外培养

目的：建立人牙周膜成纤维细胞体外培养的方法。方法：采用组织块贴附法原代培养人牙周膜成纤维细胞并传代。结果：牙周膜成纤维细胞体外培养成功率为20％。5代后细胞生长旺盛。经免疫组织化学SABC法证实为来源于中胚层的成纤维细胞。结论：采用组织块贴附法培养原代人牙周膜成纤维细胞。胰酶消化传代后，生长状况良好，可作为人牙周膜成纤维细胞的实验模型。     

人乳头状瘤病毒16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系的建立(英文)

目的建立人乳头状瘤病毒（HPv）16型DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系，确证HPv与喉癌的发生有无关系。方法采用脂质体介导法，将pSVHPV16DNA导入原代培养的人喉上皮细胞，继续培养、传代，取20代细胞，用PCR检测细胞是否含有病毒的特异片段，用免疫组化染色检测E6、E7蛋白的表达，用倒置显微镜、生长曲线、流式细胞仪、细胞角蛋白免疫组化染色、透射电镜及软琼脂克隆形成试验检测细胞的生物学特性。结果有3株细胞已连续培养传代超过20代，细胞含有HPV16DNA的特异片段并有E6、E7蛋白的表达，细胞呈锚着依赖性、接触抑制性单层平铺生长，生长曲线呈典型的“s”型，细胞增殖指数为48％，所有细胞均表达角蛋白，胞浆含张力原纤维，软琼脂培养克隆形成试验阴性。结论成功建立了HPV16DNA诱导的永生化人喉上皮细胞系，为喉癌研究提供了新的理想模型，HPV16对人喉上皮有致癌作用，在喉癌组织标本中检测到的HPV16DNA必定在其多步癌变过程中发挥了重要作用。     

癌相关成纤维细胞对上皮性卵巢癌细胞耐药性影响及机制初步研究

目的：探讨癌相关成纤维细胞（carcinoma?associated fibroblasts,CAFs）对卵巢癌细胞化疗耐药性影响及机制。方法：通过CAFs和卵巢癌细胞Ovcar3共培养,采用流式细胞术检测顺铂（cis?diammin?odichloroplatinum,DDP）对共培养前后卵巢癌细胞凋亡率的改变;应用实时定量PCR、Western blot检测DDP对共培养前后卵巢癌细胞中PI3K、AKT、XIAP 的mRNA水平及其蛋白水平的变化;以及AKT 体外特异性阻断剂LY294002对CAFs引起化疗耐药的逆转作用。结果：CAFs与卵巢癌细胞共培养后,DDP诱导的卵巢癌细胞凋亡显著减少（P < 0.05）;共培养组卵巢癌细胞中PI3K及XIAP 的mRNA表达水平明显高于对照组（P < 0.05）;共培养后PI3K/XIAP蛋白表达显著升高（P < 0.05）;磷酸化AKT（p?AKT）蛋白表达显著升高（P < 0.01）。抑制剂LY294002可显著降低XIAP蛋白表达。结论：CAFs可通过影响PI3K/AKT/XIAP信号通路,影响卵巢癌化疗耐药效应。     

恒河猴骨髓基质干细胞与新型可吸收羟基磷灰石及β-磷酸三钙体外相容性的观察

目的观察恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC)与新型可吸收羟基磷灰石(HA)及AO人工骨β-磷酸三钙(β-TCP)的体外相容性．为在灵长类动物体内构建组织工程化骨作材料方面的准备，方法取第三代恒河猴骨髓基质细胞与材料复合培养。实验分3组：A组将rBMSC与HA复合培养；B组rBMSC与β-TCP复合培养：C组为对照，只有细胞不加材料。倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及增殖情况．MTT法半定量检测细胞增殖。结果倒置显微镜下见HA组细胞生长良好，与对照组无显著差异。β-TCP组有一些细小颗粒脱落散在分布于板底或细胞表面．有少量细胞脱落死亡。扫描电镜见HA组细胞贴附、增殖良好，β-TCP组细胞贴附率不高。MTT法显示HA组细胞增殖与对照组接近，而β-TCP组则显著低于对照组。结论新型HA与恒河猴BMSc生物相容性好，可用作恒河猴骨组织工程的支架材料．AO人工骨需要作性能上的改进。     

Pin1抑制剂Juglone对宫颈癌细胞增殖的抑制作用

目的比较Pin1抑制剂（Juglone）和环磷酰胺（CTX）对4株宫颈癌细胞生长的影响，以探讨Juglone的抗肿瘤作用。方法体外培养人宫颈癌细胞系HeLa、SiHa、C33a以及Caski，用细胞生长曲线和MTT试验观察细胞生长状况，流式细胞仪检测细胞周期，Westernblot和比色法检测Caspase3蛋白表达及活性。结果细胞生长曲线和MTT试验均表明，Juglone对4株宫颈癌细胞生长有明显的抑制作用，且抑制作用随作用浓度和作用时间增加而增强。流式细胞仪检测表明，Juglone（50umol／L）培养24h后，G2／M期细胞比例数较CTX组明显增加，而G0／G1期细胞比例数却较CTX组降低。Westernblot和比色法显示Juglone各浓度组中Caspase3活性明显高于CTX组。结论Juglone可能通过体外抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡等途径抑制肿瘤的发展。     

KLF5对吉西他滨诱导的肺腺癌细胞凋亡的促进作用及其机制

目的 研究krüppel-like factor 5基因（KLF5）的表达对吉西他滨介导的肺腺癌细胞凋亡的影响及分子机制。 方法 在体外培养的肺腺癌细胞H441中,分别转染KLF5表达质粒和空载体对照质粒培养68 h后,加入100 nmol/L的凋亡诱导药物吉西他滨处理4 h,使用细胞计数和流式细胞术方法检测细胞增殖和凋亡; Western blot检测KLF5蛋白的表达,RT-PCR检测KLF5及凋亡相关基因CD95和BAX的表达;免疫荧光染色比较凋亡相关蛋白Caspase 3的表达。 结果 Western blot结果证明KLF5转染成功。无吉西他滨诱导情况下,KLF5高表达对H441细胞的凋亡无显著影响,CD95和BAX基因的表达差异无统计学意义;吉西他滨诱导情况下,与对照组相比,KLF5高表达的H441细胞中凋亡细胞比例增加（P<0.05）,CD95和BAX基因的表达上升（P<0.05）,Caspase 3的表达上调。 结论 在吉西他滨诱导下,体外KLF5高表达促进肺腺癌细胞H441的凋亡。其机制可能是通过抑制细胞增殖和修复激活Caspase 3、CD95和BAX等细胞凋亡通路相关蛋白实现。     

PHA739358抑制乳腺癌细胞增殖、诱导凋亡的分子机制

目的 研究Aurora激酶抑制剂PHA739358抑制人乳腺癌T47D细胞增殖、诱导凋亡的分子机制.方法 用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)评价PHA739358对T47D细胞增殖的影响;免疫荧光法观察染色体、核的变化;流式细胞术检测细胞周期阻滞和凋亡率;Western印迹检测AuroraA、pAurora A、Histone H3、p-Histone H3,周期特异性指标Cyclin B1,周期调节性指标Cdc2、Cdc25c、p-Cdc2、p-Cdc25c,凋亡诱导指标p21、p53,凋亡相关指标PARP、Bcl-2、Bax.结果 不同浓度的PHA739358处理细胞24h、48 h后,明显抑制T47D的增殖,IC50分别为(3.44±0.54) μ,mol/L、(0.21±0.67)μmol/L,核与纺锤体形态发生明显变化,G2/M期阻滞增加呈剂量依赖性,Western印迹显示Aurora A、Histone H3、Cdc2、Cdc25c无明显趋势变化,p-AuroraA、p-Histone H3、CyclinB1、Bcl-2随着浓度的增加而减少,p-Cdc2、p-Cdc25c、P21、P53、Bax、PARP随着浓度的增加而增加.流式细胞术凋亡率由0.31％ ±0.03％增加到40.6％±0.81％.结论 PHA739358抑制乳腺癌细胞T47D增殖、诱导凋亡的分子机制为乳腺癌治疗提供了新思路.     

口腔癌相关成纤维细胞对舌癌细胞株增殖活性的影响

目的本研究拟通过体外实验观察口腔癌相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)对舌癌细胞增殖能力的影响。方法建立口腔CAFs与舌癌细胞株Tca8113的交互作用模型,对Tca8113进行形态学观察,并通过MTT法及流式细胞术,观测口腔CAFs对Tca8113增殖活性及细胞周期的影响。结果CAFs和Tca8113直接混合培养组的Tca8113细胞形态及生长方式发生变化;与正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)相比,CAFs增强了Tca8113的增殖活性(P<0.05),并提高了处于S期和G2期的癌细胞的比例(48.1%vs40.0%)。结论口腔CAFs可在体外促进舌癌细胞株Tca8113的增殖,提示其在口腔鳞癌发展中起重要作用。     

EGCG诱导前列腺癌细胞PC-3凋亡及对Survivin蛋白表达的影响

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocat-echin-3-gallate,EGCG)对人前列腺癌细胞PC-3凋亡及对其Survivin蛋白表达的影响。方法使用不同浓度的EGCG(0、20、40、80μg/mL)处理前列腺癌细胞株PC-3,通过细胞增殖曲线实验检测EGCG对PC-3细胞增殖的影响;流式细胞仪检测不同浓度EGCG处理PC-3细胞48h后对细胞周期及凋亡的影响;用RT-PCR法检测各浓度EGCG作用48h后PC-3细胞中Survivin基因的表达差异,使用Western blot进行确认。结果 EGCG可以抑制PC-3细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用随EGCG浓度的增加而增强(P<0.05);Sur-vivin在PC-3细胞中高表达,EGCG促使PC-3细胞的Survivin表达下调,其表达水平随EGCG浓度的增加而减少(P<0.01)。结论 EGCG能下调PC-3细胞中Survivin蛋白的表达,这可能是EGCG抑制PC-3细胞增殖、诱导其凋亡的关键机制。     

苦参碱对Raji细胞凋亡及凋亡相关蛋白Fas/FasL表达的影响

目的：探讨中药苦参碱对人Burkitts淋巴瘤Raji细胞凋亡的作用及其可能机制.方法：应用MTT法测定苦参碱对Raji细胞生长的抑制作用;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;WesternBlot检测Fas,FasL,Caspase-3蛋白的表达量.结果：苦参碱0.2～1.6g/L作用Raji细胞24,48,72h后,对Raji细胞生长具有增殖抑制作用,且呈明显的量效和时效关系,48h半数抑制浓度（IC50）为1.34g/L.苦参碱0.4,0.8,1.6g/L组作用48h后,Raji细胞总凋亡率分别为15.10%,27.88%,48.08%,与对照组8.78%相比较差异具有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）.Western Blot检测结果显示Fas,FasL,Caspase-3蛋白表达水平随苦参碱浓度的提高而增加.结论：一定浓度苦参碱可诱导Raji细胞发生凋亡,其凋亡机制可能与上调Fas,FasL蛋白的表达以及激活Caspase-3有关.     

白藜芦醇对人甲状腺乳头状癌IHH4细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察白藜芦醇对人甲状腺乳头状癌细胞(IHH4)增殖和凋亡的影响,并初步探讨其可能的机制?方法:采用CCK-8法检测白藜芦醇对IHH4细胞增殖的影响;倒置显微镜?透射电镜?DAPI染色观察细胞的形态学变化;细胞免疫荧光和Western blot法检测细胞内cleaved caspase-3蛋白的表达;应用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)观察细胞周期和凋亡的改变?结果:①白藜芦醇可以呈时间和浓度依赖性抑制IHH4细胞增殖;②与正常对照相比,加入白藜芦醇后IHH4细胞皱缩?变圆?脱落,细胞质中出现大小不等的空泡,胞质内容物增多;透射电镜下细胞核的染色质高度凝聚?边缘化;DAPI染色后荧光显微镜下观察,细胞核呈致密浓染;③细胞免疫荧光和Western blot显示,随着白藜芦醇作用浓度和时间的增加cleaved caspase-3蛋白的表达明显增加;④流式Annexin V-FITC/PI双染检测显示白藜芦醇呈浓度依赖性诱导IHH4细胞凋亡?白藜芦醇可引起细胞S期阻滞?结论:白藜芦醇可抑制人甲状腺乳头状癌IHH4细胞增殖,诱导IHH4细胞凋亡?白藜芦醇阻滞细胞于S期,可能是抑制IHH4细胞增殖?促使其凋亡的原因之一?     

恒河猴骨髓基质干细胞与新型可吸收羟基磷灰石及β-磷酸三钙体外相容性的观察

目的 观察恒河猴骨髓基质干细胞(rBMSC)与新型可吸收羟基磷灰石(HA)及AO人工骨茁-磷酸三钙(茁-TCP)的体外相容性。为在灵长类动物体内构建组织工程化骨作材料方面的准备。方法 取第三代恒河猴骨髓基质细胞与材料复合培养。实验分3组:A组将rBMSC与HA复合培养;B组rBMSC与茁-TCP复合培养;C组为对照,只有细胞不加材料。倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态及增殖情况,MTT法半定量检测细胞增殖。结果 倒置显微镜下见HA组细胞生长良好,与对照组无显著差异。茁-TCP组有一些细小颗粒脱落散在分布于板底或细胞表面,有少量细胞脱落死亡。扫描电镜见HA组细胞贴附、增殖良好,茁-TCP组细胞贴附率不高。MTT法显示HA组细胞增殖与对照组接近,而茁-TCP组则显著低于对照组。结论 新型HA与恒河猴BMSc生物相容性好,可用作恒河猴骨组织工程的支架材料,AO人工骨需要作性能上的改进。     

Caspase3在哇巴因诱导Jurkat细胞凋亡中的作用

目的 探讨哇巴因诱导Jurkat细胞凋亡的机制。方法 四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察哇巴因对Jurkat细胞生长的抑制作用；应用DNA片段分析、流式细胞术观察细胞凋亡；半定量逆转录PCR(RT-PCR)检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase3)基因表达水平；应用westernblot测定caspase3的活性亚单位；比色法检测caspase3活性。结果 哇巴因能诱导Jurkat细胞凋亡，在细胞凋亡过程中，caspase3活性明显升高。结论 caspase3活化参与了哇巴因诱导Jurkat细胞的凋亡过程。