胎牛血清对胎鼠神经干细胞分化的影响

目的探讨胎牛血清对神经干细胞（neural stem cells,NSCs）分化结果的影响．方法通过无血清培养的方法,将胎鼠大脑皮质进行原代培养所获得的神经干细胞克隆传代纯化后,分别接种在加入DMEM／F12＋B27和DMEM／F12＋B27＋5％FCS两种不同培养基的培养皿中诱导分化,9d后行免疫荧光细胞化学染色,用抗体β—Tubulin Ⅲ、GFAP、GalC鉴定分化细胞,并观察其形态特点．结果成功分离获得NSCs,并具有分化为神经元和胶质细胞的能力;在相同时间内含血清培养基中的细胞球分化快而充分,且分化结果不同．结论血清可促进NSCs分化并影响分化结果．     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索大鼠胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法:从孕14 d SD胎鼠前脑组织分离神经干细胞,用DMEM/F12无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),进行体外扩增、培养和传代.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养,经nestin染色鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

成体小鼠肠神经嵴干细胞体外分离、培养及鉴定

目的:利用简化无血清培养基和连续传代法,从成体小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞(GNCSCs),观察细胞体外培养过程中增殖、分化的特点.用p75, GFAP,Peripherin,α-Actin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系.方法:将新生1, 5 d的小鼠肠管制成单细胞悬液,接种于无血清DMEM/F12完全培养基中贴壁培养,连续传代培养并观察克隆球的形成过程.将克隆球接种于含血清的DMEM/F12完全培养基中,观察其分化现象.用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达.结果:成体小鼠肠管中有少数细胞在无血清培养基中存活且增殖形成克隆球.免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清诱导下可分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞.结论:成体肠管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs,在体外GNCSCs可分化为肠神经系统所必须的细胞类型.     

胎鼠脊髓神经干细胞分离培养及诱导分化

目的 探讨机械分离法与酶消化法在脊髓源性神经干细胞（NSCs）体外培养的优劣,并观察脊髓源性NSCs体外培养时增殖和分化的特点.方法 取妊娠第15天（E15 d）的胎鼠神经管组织,分别采用酶消化法和机械吹打分离法离散细胞,进行无血清培养,并以上述两种方法传代培养.借助免疫细胞化学法对NSCs及分化结果进行鉴定,细胞球计数法检测成球率,测量神经球直径分析细胞增殖能力,MTT法监测细胞生长情况.结果 ①培养的细胞具有增殖成球生长的特性并且抗巢蛋白免疫荧光阳性、血清可诱导分化出胶质细胞酸性蛋白（GFAP）、神经元特异性希醇化酶（NSE）阳性表达的细胞.②细胞直径：酶消化组（137.74±11.62）μm,机械分离组（143.69±12.20） μm（P ＞0.05）.③生长曲线结果显示酶消化组NSCs综合生长增殖能力较高,OD值：酶消化组（0.39 ±0.15）,机械分离组为（0.36±0.13）.结论 胎鼠脊髓组织中存在具有自我增殖和多分化潜能的NSCs,原代无血清成球培养时采用酶消化法更有利于获得较多NSCs.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞（NSCs）的分离、培养、分化及鉴定的条件与方法。方法分离孕14～16dSD大鼠胚胎脑皮质及皮质下区域NSCs,无血清培养基（DMEM／F12,含bFGF、EGF、B27等）条件下培养,通过有限稀释法克隆、传代,含血清培养基诱导分化,免疫组织化学法鉴定NSCs及诱导分化后的细胞。结果体外培养的NSCs能稳定增殖成神经干细胞球并传代（nestin染色阳性）,经诱导可分化为神经元细胞（NSE染色阳性）、星形胶质细胞（GFAP染色阳性）和少突胶质细胞（CNP染色阳性）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可在体外大量培养出稳定增殖并具有多向分化潜能的大鼠胚胎NSCs,为进一步研究NSCs的生物特性及应用奠定了基础。     

缺氧对体外培养的鼠胚神经干细胞分化的影响

目的分离大鼠胚胎皮质神经干细胞（NSCs）进行体外培养,探讨缺氧对体外培养的鼠胚大脑皮质神经干细胞分化的影响。方法对孕14d（E14d）大鼠取鼠胚脑皮质用无血清培养技术分离培养神经干细胞,血清：培养基贴壁诱导分化。通过免疫细胞化学染色检测细胞分化情况;NSCs采用三气培养箱予以不同缺氧干预,缺氧培养后再用10％胎牛血清培养基进行贴壁分化,用MAP2免疫荧光染色检测缺氧对NSCs向神经元方向分化的影响。结果①大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;②缺氧干预实验中,5％O2组尤以72h组可诱导NSCs向神经元方向分化。结论从大鼠胚胎皮质可成功分离NSCs,缺氧可影响NSCs的分化,适度缺氧可诱导离体培养的大鼠脑皮质NSCs向神经元方向分化。     

胚胎大鼠大脑额叶皮质神经干细胞的分离、培养与鉴定

目的：探讨从胚胎大鼠大脑额叶皮质分离培养神经干细胞（neural stem cell，NSCs）的方法及NSC。的特性。方法：将14．5d胎龄的大鼠额叶皮质脑组织制备成单细胞悬液，于含EGF和bFGF的DMEM／F12无血清培养液中培养，形成原代细胞球后，进行单细胞克隆传代扩增。免疫荧光组化方法检测克隆球Nestin、Map-2、GFAP抗体标记情况。结果：原代培养2周后，可形成大量悬浮生长的神经球，BrdU和Nestin检测呈阳性，诱导分化后呈Map-2、GFAP阳性。结论：可从胚鼠脑皮质中分离培养纯化、扩增传代获得NSCs，经诱导后可以分化为神经元和星形胶质细胞，可作为细胞替代治疗中枢神经系统疾病的供体来源。     

条件培养基对神经干细胞增殖与分化作用的影响

目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）条件培养基对体外培养神经干细胞（NSCs）增殖与分化作用的影响。方法用 BMSCs 条件培养基分别在增殖与分化条件下培养 NSCs,观察 NSCs 形态变化。用 MTT 法及 NSCs 球数目和直径的统计分析了解 NSCs 增殖情况,同时行免疫荧光及 Western blot 法鉴定其分化情况。结果原代培养获得大量未分化且悬浮生长的 NSCs 球,并能分化为神经元细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞。BMSCs 条件培养基组能够促进 NSCs 球的吸附贴壁,但与对照组相比光密度（OD）值差异无统计学意义,NSCs 球数目和直径差异亦无统计学意义。另外,BMSCs 条件培养基组少突胶质细胞特异性蛋白MBP 表达量高于对照组（P <0.05）,星形胶质细胞特异性蛋白 GFAP 表达量低于对照组（P <0.05）,而神经元特异性蛋白 MAP-2表达量未见明显异常。结论大鼠 BMSCs 条件培养基促进 NSCs 向少突胶质细胞方向分化,但不抑制其增殖作用。     

神经干细胞接种密度对其增生和分化的影响

为探讨神经干细胞不同接种密度对其增生和分化的影响,取10～12周龄胎儿的大脑皮质用胰酶消化获得单细胞,分别以1×10~2/mL、1×10~4/mL和1×10~6/mL的细胞密度接种,用无血清培养基DMEM/F12、上皮细胞生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白血病抑制因子(LIF)培养;用MTT法测OD值并观察神经干细胞的存活和增生情况。从培养基中剔除生长因子,继尔以10％胎牛血清诱导分化,用免疫细胞化学(ICC)方法,研究不同细胞密度培养后神经干细胞的分化能力。结果:在1×10~6/mL细胞密度下培养,神经干细胞增生活跃,形成神经球,Nestin表达阳性,10％胎牛血清诱导后神经干细胞可分化为神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞;低细胞密度(低于1×10~4/mL)培养不利于神经干细胞的存活和增生,血清诱导未见分化的细胞。提示:适宜的神经干细胞接种密度有利于其增生和分化。     

胚胎神经上皮干细胞体外克隆增殖与分化的实验研究

目的观察胚胎神经上皮干细胞在体外克隆增殖和诱导分化的情况。方法取孕11 d大鼠的胚胎,经分离获得神经管上皮细胞,在无血清培养基内克隆、增殖、传代。取不同时期的神经球进行神经干细胞的鉴定和诱导分化,并通过免疫组织化学染色鉴定分化的结果。结果胚胎神经上皮干细胞在体外能够克隆、增殖,形成的神经球呈nestin阳性,在分化培养基内可分化为星型胶质细胞和神经元。结论胚胎神经上皮干细胞可在体外进行单细胞克隆和诱导分化。     

星形胶质细胞诱导神经干细胞定向分化试验研究

目的 研究新生SD大鼠星形胶质细胞培养上清液对神经干细胞(neural stem cells，NSCS)体外定向分化的影响，探讨神经干细胞分化条件。方法 收集新生和成年SD大鼠星形胶质细胞培养的上清液，以1：3比例同DMEM／F12培基混合，分别对胎鼠来源的神经干细胞进行诱导分化，倒置相差显微境下观察细胞的生长情况。并采用免疫荧光检测方法对分化细胞鉴定和计数。结果 新生鼠星形胶质细胞培养上清液与DMEM／F12的混合培基诱导神经干细胞分化为神经元的比例明显提高。结论 新生鼠星形神经胶质细胞能促使神经干细胞向神经元方向分化。     

LIF对人胚神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨LIF对人胚神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法:从孕24周流产胎儿脑组织中分离NSCs,并分4组培养。对照组用基础培养液,第1,2,3实验组分别于基础培养液中加入20μg/L EGF和B27,20μg/L LIF和B27,20μg/L LIF、20μg/L EGF及B27。观察细胞生长情况并在不同时间进行细胞计数。诱导细胞分化后,显微镜下观察。结果:培养3 d细胞开始分裂并聚集成球,后逐渐增大,培养10 d,第1,2,3实验组和对照组神经球形成数分别为(21.5±7.8),(23.8±5.4),(25.2±6.3)和(24.8±6.9),各组间差异无统计学意义。分化实验显示含LIF培养的神经干细胞分化少。结论:在体外,LIF能够促进神经干细胞的增殖并抑制神经干细胞的分化。     

大鼠海马神经干细胞的扩增及与三维微小凹图式复合的研究

目的比较2种培养基下海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的生长特性,进而实现海马NSCs扩增的优化及其与聚乳酸(poly-L-lactide,PLLA)三维微小凹图式的复合。方法分离大鼠胚胎海马细胞并采用Neurobasal为基础的培养基和DMEM/F12为基础的培养基进行扩增。以四甲基氮唑蓝(MTT)比色法及神经球数目统计法评价2种培养基下细胞增殖行为。采用紫外光光刻、硅蚀刻及软光刻技术制备PLLA三维微小凹图式并实现海马NSCs与微小凹图式的复合。结果原代分离的海马细胞呈神经干细胞标志物阳性并能向神经元系和胶质细胞系分化。在30d的扩增时间内,海马NSCs在以Neurobasal为基础的培养基中缓慢扩增聚集成神经球,少见细胞贴壁及分化;在以DMEM/F12为基础的培养基中海马NSCs扩增迅速,但易贴壁和分化。培养第25天时后者神经球数量为前者的4.7倍。微加工制备的微小凹图式结构清晰、稳定,具有高纵横结构比(≥1)。扩增的海马NSCs能在三维微小凹图式上成功复合生长。结论以DMEM/F12为基础的培养基有利于大鼠海马NSCs的扩增,以Neurobasal为基础的培养基利于海马NS...     

EPO促进胚胎神经干细胞向神经元分化的形态学研究

目的：探讨促红细胞生成素（erythropoietin ,EPO）促进神经干细胞（neural stem cells ,NSCs）分化的形态学表现,为细胞移植治疗脑部疾病和脑损伤提供实验依据。方法取大鼠14 d胚胎脑皮质先增殖培养,后贴壁分化培养。适时镜下观察,免疫细胞化学染色,用nestin鉴定NSCs ,GFAP鉴定神经胶质细胞、MAP2鉴定神经元。选取第3代 NSCs ,向培养基中分别添加不同剂量的 EPO ,浓度分别为0．5u/ml ,5u/ml ,50u/ml ,500u/ml ,并设不添加EPO的对照组,MAP2免疫荧光共聚焦显微镜观察NSCs向神经元方向的分化。结果1）鼠胚脑皮质在无血清悬浮培养形成大量神经球,并可传代,球内细胞均表达 nestin。分化培养,可检测出MAP2或GFAP阳性细胞。2）EPO≥5u/ml各组分化培养,表达MAP2阳性细胞显著升高（P＜0．05）。结论大鼠胚胎脑皮质体外培养可获得NSCs ;适当浓度EPO可提高NSCs向神经元的分化。     

Wistar大鼠骨髓源性神经干细胞分离与培养及其鉴定

目的分离、培养和鉴定Wistar大鼠骨髓源性神经干细胞。方法从Wistar大鼠骨髓组织中分离骨髓源性神经干细胞,采用无血清培养技术进行培养、传代,应用免疫细胞化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果分离培养获得大量悬浮生长的细胞团,该细胞具有连续增殖的能力,并能分化为神经元和神经胶质细胞。结论 Wistar大鼠骨髓组织中可成功分离培养神经干细胞,该细胞在体外适宜的条件下能够大量增殖,并具有多向分化潜能。     

骨髓源性EPCs对脊髓源性NSCs增殖分化的影响

目的：观察骨髓源性内皮祖细胞( EPCs)对脊髓源性神经干细胞( NSCs)增殖分化的影响。方法通过密度梯度离心法获取骨髓血单个核细胞,以 EBM-2进行诱导培养EPCs并进行免疫细胞化学染色鉴定,成熟的方法获取及鉴定SD大鼠的脊髓NSCs,1×105/ml第3代NSCs置于Tran-swell小室下层与1×105/ml上层原代EPCs进行体外1∶1共培养,以单纯第3代的NSCs培养为对照,培养7 d,双盲法分别计数各组在相差显微镜下神经球形成的数目,并用目镜测微尺测量神经球的平均直径,通过5%血清诱导培养NSCs 7 d后,行β-微管蛋白-Ⅲ免疫荧光染色,Hoechst细胞核染色后在显微镜下计算神经元/细胞总数得出百分率。结果骨髓源性EPCs与脊髓源性NSCs共培养组神经球平均数目为(22．27±3．85)个,平均直径为(61．70±7．21)μm,诱导培养后分化为神经元的平均百分率为(46．10±3．70)%,与对照组比较差异均有统计学意义( P<0．01)。结论骨髓源性EPCs能促进脊髓源性NSCs增殖及其向神经元分化。     

胰岛素样生长因子-1诱导新生小鼠海马源性神经干细胞增殖分化的研究

目的探讨胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对新生小鼠海马源性神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响。方法通过取新生C57BL／6J小鼠海马组织,机械分离,体外培养NSCs,特异性标志蛋白Nestin免疫荧光鉴定。在细胞培养液中加入100μg／L的IGF-1记为IGF-1组,同时设立正常细胞对照组。CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,GFAP、133Tubulin细胞免疫化学检测细胞分化情况。结果体外成功培养NSCs,特异性蛋白Nes-tin具有表达。IGF-1组NSCs较对照组增殖显著,且IGF-1组细胞具有显著的迁移和分化能力。细胞免疫荧光鉴定,IGF-1可促进细胞分化为星形胶质细胞和神经元（P〈0．05）。结论IGF-1能够促进体外培养的新生小鼠海马源性NSCs增殖,并诱导NSCs向星形胶质细胞和神经元分化。     

Wnt3a影响大鼠海马神经干细胞增殖的体外研究

目的:探讨Wnt3a对胚胎大鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)体外增殖的影响。方法:采用机械分离、无血清传代培养法,从胎鼠海马中获得NSCs,使用免疫荧光法对NSCs及其分化情况进行鉴定。将NSCs与5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)共孵育,观察Wnt3a对NSCs体外增殖情况的影响。结果:海马源胚胎NSCs具有增殖能力,可以传代培养,可分化为神经元和星形胶质细胞。与Brdu共孵育后,添加Wnt3a的实验组Brdu阳性率高于对照组(P0.01)。结论:使用机械分离、无血清培养的方法获得的NSCs具有增殖和多向分化能力,Wnt3a可以促进大鼠海马NSCs的体外增殖。     

外源性重组HMGB1对神经干细胞增殖分化的影响及其机制研究

目的研究外源性重组高迁移率组蛋白B1（HMGB1）对神经干细胞增殖及分化的影响及其作用机制。方法在无血清的神经干细胞培养基中培养SD鼠大脑皮层细胞,传代扩增及纯化神经干细胞,免疫荧光检测神经干细胞标记物巢蛋白（nestin）,分析神经干细胞纯度。CCK-8测定加入不同浓度的重组HMGB1对神经干细胞增殖活性的影响,选择重组HMGB1的最适浓度进行后续实验;细胞免疫荧光检测重组HMGB1对神经干细胞分化的影响,Real-time PCR检测晚期糖基化终末产物受体（RAGE）mRNA、Toll样受体（TLRs）mRNA、基质金属蛋白酶9（MMP-9）mRNA、神经生长因子（NGF）mRNA的表达,Western blot检测RAGE、TLRs、MMP-9、NGF蛋白的表达。结果大鼠大脑皮层细胞在培养至第3代时,nestin鉴定神经干细胞纯度可达99%及以上。在重组HMGB1 10 ng/mL刺激下,神经干细胞增殖活性最高。实验组神经Ⅲ类β-微管蛋白（TUJ1）表达高于对照组(P<0.05),实验组RAGE、TLRs、MMP-9、NGF mRNA及蛋白表达均高于对照组(P<0.05)。结论外源性重组HMGB1或可通过RAGE、TLRs、MMP-9等信号通路促进神经干细胞增殖及其向神经元方向分化。