用体外消化/Caco-2细胞模型观察维生素C和柠檬酸对铁生物利用的影响

目的 采用体外消化/Caco-2细胞模型来观察维生素C和柠檬酸对铁生物利用的影响,并验证在本实验室建立的体外消化/Caco-2细胞模型的有效性.方法 利用一个带透析膜的插入环将体外消化和Caco-2细胞培养结合在一起,模拟体内环境,使食物的消化和吸收在该模型中能同时进行.并在含铁样品液中分别加入维生素C和柠檬酸,以Caco-2细胞的铁蛋白形成量作为反映铁生物利用率的指标.结果 在样品液铁浓度<100μmol/L时,细胞中铁蛋白形成量随着铁浓度的增加而递增;加维生素C组的细胞铁蛋白形成量高于加柠檬酸组;加入维生素C使方法更灵敏,加入柠檬酸使测定的铁浓度范围更宽.结论 在本实验室建立的体外消化/Caco-2细胞模型是成功的,维生素C对铁生物利用的促进作用高于柠檬酸.     

在20L气升式生物反应器中用西藏红豆杉细胞悬浮液生产紫杉醇和巴可亭Ⅲ

作者采用20 L 气升式生物反应器对西藏红豆杉 Taxus wallichiana 的细胞培养进行了放大研究,并与摇瓶培养进行了比较。培养条件为:培养物100 g/L,培养基为 Gam-borg B5,每批培养期28天,工作容积为18L,温度25 C,通气量为2.5 L/min。结果显示,在培养初始阶段,细胞悬浮液未出现迟滞     

铜绿假单胞菌制剂对大鼠C6胶质瘤细胞作用的实验研究

目的研究铜绿假单胞菌注射液（PA-MSHA）对体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞的增殖抑制机制.方法体外培养大鼠C6胶质瘤细胞,测定细胞活力、细胞贴壁率,绘制生长曲线,计算细胞倍增时间,确定最佳细胞接种浓度及药物干预区间.倒置显微镜观察药物作用后细胞形态学变化,MTT比色法测定不同时间、不同浓度PA-MSHA对C6胶质瘤细胞的增殖抑制率,计算细胞存活率及半数抑制浓度（IC50）.结果 C6细胞在常规培养条件下呈贴壁生长,生长状态良好,每次传代前活力测定,存活率均〉95%.于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h测定贴壁率分别为20%、68%、82%、85%、92%、98%,符合本实验要求.细胞生长曲线提示5×10^3/孔的浓度为96孔板内最佳接种浓度.细胞接种后24～72 h为细胞倍增时间.倒置显微镜下观察药物作用后细胞形态学变化明显.MTT比色法结果提示,细胞生长抑制率与药物作用时间和剂量正相关.计算24 h和48 h IC50值分别为（5.80±1.79）×10^8 cfu/mL和（3.90±2.14）×10^8 cfu/mL.结论铜绿假单胞菌（PA-MSHA）制剂对体外培养的C6胶质瘤细胞具有增殖抑制作用,且呈时间剂量依赖性.     

不同浓度的维生素C对C2C12成肌细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察不同浓度的维生素C（VitC）对体外培养的骨骼肌成肌细胞（C2C12）增殖、凋亡的影响。方法：取体外培养的C2C12细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,离心重悬,调整细胞密度,按200 μL/孔接种,常规培养,待细胞融合率达80%且未出现细胞分化时,将细胞分6组：阴性对照组（C2C12 细胞中加入单纯无血清培养基）、H2O2组（C2C12 细胞中加入含500 μmol/L H2O2的无血清培养基）和VitC 1,2,3,4组（C2C12 细胞中加入含500 μmol/L H2O2的无血清培养基的基础上,分别加入不同浓度的VitC：10,20,60,100 mg/L）。分别在干预0,6,24,36,48,72 h后采用四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测各组C2C12细胞的增殖。在干预36 h后采用Annexin V-PI双染法检测各组C2C12细胞凋亡率。结果：在干预36和72 h时,各浓度的VitC组的吸光度（OD）值均较H2O2组显著升高（P＜0.001）,其中以VitC 4组升高最为显著,而且VitC 4组在干预36 h时的吸光度值高于阴性对照组（P＜0.05）;在干预36 h时,VitC 2,3和4组的C2C12成肌细胞凋亡率明显低于H2O2组;VitC 2和3组的C2C12成肌细胞凋亡率高于阴性对照组,而VitC 4组的C2C12成肌细胞凋亡率明显低于阴性对照组,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：VitC能够有效抑制H2O2诱导的C2C12成肌细胞的凋亡,高浓度的VitC可能在干预36 h时对C2C12成肌细胞有促增殖的作用。     

肌腱生物反应器的开发与组织工程肌腱的构建

分析了骨骼肌和气动肌腱的力学特点,确定以能模拟肌肉运动的气动肌腱作为肌腱生物反应器的动力元件,并开发肌腱生物反应器的控制系统和测量系统的软硬件,设计细胞培养室及换液系统,形成了一套完整的肌腱生物反应器系统。采用鸡的趾深屈肌腱细胞构建组织工程肌腱。通过工程化肌腱的构建实验表明：整个肌腱生物反应器系统运行良好,并能成功培养组织工程肌腱达12周。     

体外诱导C2C12细胞向成骨细胞的分化

目的成骨细胞特异性转录因子a1(core binding factor a1,Cbfa1)通过调节生长因子和骨特异性细胞外基质蛋白的基因表达而参与成骨细胞的分化和骨发育过程。文中构建成Cbfa1,以腺病毒载体转染成肌细胞C2C12,为种子细胞构建组织工程化骨。方法体外培养小鼠成肌细胞C2C12,用重组腺病毒质粒pAd-IL-31介导Cbfa1/Osf2基因瞬时转染小鼠成肌C2C12细胞,Western blot检测Cbfa1蛋白表达。结果 Cbfa1蛋白表达、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、骨钙素(osteocalcin,OCN)分泌量以及茜素红染色感染组明显高于对照组。结论成肌细胞C2C12可以作为种子细胞构建组织工程化骨。     

血清量及首次换液时间对荧光小鼠骨髓基质细胞体外增殖的影响

目的研究不同量的血清及首次换液时间对荧光小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)体外增殖的影响。方法转基因荧光小鼠BMSCs取材后种植于24孔培养板中,分别用含10%、20%、30%胎牛血清的DMEM/F12混合培养基常规培养。于4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h、72h首次全量换液,观察其生长情况,用CD44、CD54、CD45抗体对10%、20%胎牛血清传代培养至第5代的细胞进行免疫细胞化学染色。结果BMSCs在含10%、20%胎牛血清的DMEM/F12中生长较好,原代培养的细胞其贴壁细胞数随首次换液时间的延长而增多,但纯度下降。首次换液时间相同而培养液血清含量不同的两组细胞免疫组织化学染色的阳性率差别无显著性(P>0.05),CD44和CD54抗体反应的阳性率随着首次换液时间的延长而逐渐降低,CD45抗体反应的阳性率则随首次换液时间的延长而逐渐升高。结论贴壁分离纯化对转基因荧光小鼠的BMSCs体外培养有效,其体外培养适宜的血清体积分数为0.1～0.2,首次换液时间以8h时为佳。     

酸、碱性氧化电位水替代硫酸洗液的实验研究

目的:探讨酸性氧化电位水(EOW)和碱性氧化电位水(AOW)替代硫酸-重铬酸钾液清洗玻璃器皿,用于细胞培养、生物材料、生化检测等实验的可行性。方法:取玻璃培养瓶、试管和吸管各100个(只),洗涤灵洗刷、自来水冲净,烤干后分3组浸入各浸泡液中。A组:硫酸-重铬酸钾洗液;B组:EOW;C组:AOW。浸泡24h后取出,自来水冲洗10遍,双蒸水2遍、三蒸水1遍,烤干,高压蒸汽灭菌后接种RSC-364大鼠滑膜细胞,分别进行细胞生长速度、贴壁率、存活率和活细胞形态比较。结果:细胞生长速度测定:1～3d为对数长生期,平均倍增时间A组为26h,B组34.7h,C组25.8h;4～5d为平台期,细胞生长减慢;第6天细胞停止生长,增殖曲线迅速下降。细胞贴壁率:A组74%,B组65%,C组70%(P>0.05)。细胞存活率:A组93.5%,B组94.1%,C组94.6%(P>0.05)。三组细胞形态变化不大,接种后第1天,95%的细胞由圆形逐渐贴壁成长梭形;第5天细胞长满瓶壁,生长减慢。结论:A、B、C三组细胞生长速度接近,酸、碱性氧化电位水均可替代硫酸洗液清洗玻璃器皿,用于细胞培养。     

苯丙氨酸对C2C12细胞葡萄糖摄取能力的影响及与mTOR-p70S6K通路的关系探讨

目的 观察苯丙氨酸对小鼠成肌细胞系C2C12葡萄糖摄取能力的影响,以及刺激后细胞内哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）-p70S6K信号通路分子的变化。方法 体外培养C2C12细胞,分化诱导为多核的肌管细胞后进行饥饿处理,然后分别用不同浓度苯丙氨酸（1.25、2.5、5、10、20 mmol/L）处理细胞,以KRB平衡液作为对照。通过检测2-NBDG评价细胞葡萄糖摄取能力。用Western blot方法检测细胞内mTOR、p70S6K、胰岛素受体底物（IRS）-1、蛋白激酶B(Akt)的表达情况。结果 与KRB平衡液对照相比,5 mmol/L亮氨酸使C2C12细胞的葡萄糖摄取能力下降了约30%（P=0.001）,5 mmol/L苯丙氨酸使C2C12细胞摄取葡萄糖的能力上升了约40%（P＜0.01）,且苯丙氨酸的这种促进作用随浓度增大有逐渐增强的趋势。苯丙氨酸对细胞内mTOR Ser2448磷酸化水平无明显影响。除1.25 mmol/L外,其它浓度苯丙氨酸均能抑制p70S6K Thr389的表达。亮氨酸使IRS-1 Ser636/639磷酸化水平表达增高（P＜0.01）,除1.25 mmol/L外,其它浓度的苯丙氨酸均有抑制IRS-1 Ser636/639表达的趋势,但与对照相比差异无统计学意义（P=0.381）。高浓度短时间的苯丙氨酸刺激对C2C12细胞内的Akt Ser473表达无明显影响。结论 苯丙氨酸可能通过减少p70S6K的磷酸化,继而减少p70S6K对IRS-1的刺激作用而使细胞葡萄糖摄取能力增强。但苯丙氨酸对mTOR-p70S6K通路的抑制作用不通过Akt的激活。     

组织块法兔肌腱细胞体外培养观察

目的 :探索肌腱组织块培养法中腱细胞的生长规则及形态 ,为腱细胞培养提供一种简便、可靠的方法。方法 :取家兔 2 0只 ,体重 1.5～ 2 .5kg ,应用显微外科技术剥除屈肌腱外膜组织后 ,以胰酶及胶原酶消化去除残存腱外膜组织 ,腱组织剪成 1mm3 小块 ,放入 5 0ml培养瓶中 ,向瓶内加入少量培养液 (约 1ml) ,培养液由F -12培养基加 2 0 %胎牛血清、青霉素 6mg/L、链霉素 0 .1g/L及抗坏血酸 30mg/L组成。用无菌探针将组织块均匀分置 ,小心置入 37℃、5 %CO2 培养箱中培养 ,2 4h后组织块与瓶壁粘着后再加入F - 12完全培养液。当融合成单层细胞后进行传代培养 ,并以 10 0 0转 /min速度离心淘洗 10min ,去除上层液体 ,向沉淀物加入F -12完全培养液 ,吸管吹打后计数吸取 ,按 1∶2分瓶传代培养。结果 :组织块培养法成功率 95 % ,腱细胞自组织块内爬出贴壁生长时间平均为 (12± 1.7)d左右 ,细胞倍增时间平均为 (6± 0 .9)d。结论 :组织块方法兔腱细胞培养简便、易行。     

Induction of Bone Matrix Protein Expression by Native Bone Matrix Proteins in C2C12 Culture

Objective To study the expression of bone matrix protein （BMP） induced by bovine bone morphogenetic proteins （BMPs） in vitro. Methods Type 1 collagen, osteopontin （OPN）, osteonectin （ON）, osteocalcin （OC）, and bone sialoprotein （BSP） were detected by immunohistochemistry in C2C12 cultured from day 1 to day 28. Results The signaling of bone matrix protein expression became weaker except for type I collagen, OC and BSP after 5 days. Fourteen days after culture, the positive signaling of type I collagen, OPN, ON, OC, and BSP was gradually declined, and could be detected significantly as compared with that of the negative control on day 28. BMP assay showed that the lkaline phosphatase （ALP） activity was higher in C2C12 culture than in the control during the 14-day culture. Also, total protein and DNA significantly increased during the 14-day culture. High levels of ALP were seen in preosteoblasts and osteoblsts in vivo and in differentiating osteoblasts in vitro. ALP was well recognized as a marker reflecting osteoblastic activity. Conclusion Native bovine BMP induces conversion of myoblasts into osteoblasts, produces type I collagen, and plays significantly role in osteoinduction and bone matrix mineralization of C2C 12 in vitro.     

蒲黄总黄酮抑制棕榈酸培养下C2C12骨骼肌细胞白细胞介素6的表达

目的：观察蒲黄总黄酮（Pollen Typhae total flavones，PTF）对棕榈酸培养下C2C12骨骼肌细胞白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）表达的影响，探讨PTF改善骨骼肌胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）的可能机制。 方法：0．25mmol／L棕榈酸培养建立骨骼肌细胞IR模型。根据处理方法不同，设对照组、模型组、核转录因子κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）抑制剂PDTC组、罗格列酮（rosiglitazone，ROS）组、ROS＋PDTC组、PTF组和PTF4-PDTC抑制剂组。处理16h后，^3H-脱氧葡萄糖摄入法观察细胞对葡萄糖的转运率，实时定量多聚酶联反应检测IL-6 mRNA的表达，酶联免疫吸附测定法检测细胞培养上清中IL-6蛋白水平。 结果：0．25mmol／L棕榈酸培养16h，C2C12细胞葡萄糖摄取率下降30．43％，IR模型建立；PTF可使IR模型细胞葡萄糖转运率增加32．39％。IL-6 mRNA表达及细胞培养上清液中IL-6蛋白水平均显著下降，差异有统计学意义（P＜0．05）；加入PDTC后，细胞IL-6 mRNA表达及细胞培养上清液中IL-6蛋白水平上升（P〈0．05）。 结论：PTF通过抑制NF-κB通路而抑制C2C12骨骼肌细胞IL-6 mRNA表达及蛋白分泌，可能是其减轻骨骼肌炎症状态和改善IR的机制之一。     

不同浓度的维生素C对C_2C_（12）成肌细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察不同浓度的维生素C（VitC）对体外培养的骨骼肌成肌细胞（C2C12）增殖、凋亡的影响。方法：取体外培养的C2C12细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,离心重悬,调整细胞密度,按200μL/孔接种,常规培养,待细胞融合率达80%且未出现细胞分化时,将细胞分6组：阴性对照组（C2C12细胞中加入单纯无血清培养基）、H2O2组（C2C12细胞中加入含500μmol/L H2O2的无血清培养基）和VitC 1,2,3,4组（C2C12细胞中加入含500μmol/L H2O2的无血清培养基的基础上,分别加入不同浓度的VitC：10,20,60,100 mg/L）。分别在干预0,6,24,36,48,72 h后采用四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测各组C2C12细胞的增殖。在干预36 h后采用Annexin V-PI双染法检测各组C2C12细胞凋亡率。结果：在干预36和72 h时,各浓度的VitC组的吸光度（OD）值均较H2O2组显著升高（P〈0.001）,其中以VitC 4组升高最为显著,而且VitC 4组在干预36 h时的吸光度值高于阴性对照组（P〈0.05）;在干预36 h时,VitC 2,3和4组的C2C12成肌细胞凋亡率明显低于H2O2组;VitC 2和3组的C2C12成肌细胞凋亡率高于阴性对照组,而VitC 4组的C2C12成肌细胞凋亡率明显低于阴性对照组,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论：VitC能够有效抑制H2O2诱导的C2C12成肌细胞的凋亡,高浓度的VitC可能在干预36 h时对CC成肌细胞有促增殖的作用。     

膀胱灌注、粘膜下定期注射丝裂霉素C预防膀胱癌术后复发疗效观察

目的 :比较单纯膀胱灌注丝裂霉素C(MMC)和膀胱灌注法、定期粘膜下注射MMC预防膀胱肿瘤术后复发的疗效 ;方法 :3 7例膀胱肿瘤术后患者分为两组 ,分别接受单纯膀胱灌注MMC和膀胱灌注及定期粘膜下注射MMC治疗 ;结果 :随访 (2 4～ 3 4)个月 ,单纯膀胱灌注组 1 5例 ,复发 6例 ,占 40 % ;膀胱灌注、定期粘膜下注射组 2 2例 ,复发 4例 ,占1 8.1 8% ,两组对比差别有显著性 (P <0 .0 5) ;结论 :膀胱灌注、定期粘膜下注射MMC预防膀胱肿瘤术后复发效果满意 ,优于单纯膀胱灌注     

蓝光对人视网膜色素上皮细胞线粒体膜电位及细胞色素C的影响

目的　探讨蓝光导致人视网膜色素上皮 (retinal pigm ent epithelium,RPE)细胞损伤的分子机制 ,明确在此过程中线粒体膜电位及细胞色素 C(cytochrom e C,Cyt C)是否发生变化。方法　用蓝光照射体外培养的人 RPE细胞 ,罗丹明 12 3荧光染料孵育人 RPE细胞 ,流式细胞仪检测线粒体膜电位 (ΔΨm)。分为 3组 ,A组 :不同光照强度 ;B组 :同一光照强度 ,不同光照时间 ;C组 :同一光照强度和光照时间 ,不同细胞培养终止时间。用酶联免疫法测定Cyt C的活性 ;比色测定 Caspase- 3的活性。分为两组 :(2 0 0 0± 5 0 0 ) lx,光照 6 h为 组 ,光照 12 h为 组。结果　A组线粒体膜电位随着光照强度增加 ,呈逐渐下降趋势 ;B组在光照 3h,RPE细胞荧光强度无明显变化 ,当光照 6 h,荧光强度明显下降 ;C组光照后 6 h,荧光强度开始明显下降 ,一直持续到光照后 4 8h。 组和 组光照后 2 4及 36 h,Cyt C的浓度明显升高 ,光照后 2 4 h,后者 Cyt C浓度的升高值明显高于前者。未检测到 Caspase- 3活性变化。结论　蓝光照射导致培养的人 RPE细胞损伤过程与线粒体膜电位降低、细胞色素 C释放有关     

GDNF促进体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞增殖的时效及量效关系的研究

目的观察外源性胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）促进大鼠C6胶质瘤细胞增殖的时效及量效关系,为深入研究GDNF对C6细胞的促增殖机制提供最佳的时效及量效作用点。方法将体外培养的C6细胞分为空白对照组、溶剂对照组和实验组（GDNF浓度分别为10、30、50、70、90μg／L,作用时间分别为12、24、48、72h）,用MTT比色法检测不同浓度GDNF通过不同作用时间对C6细胞增殖情况的影响。结果浓度在50μg/L以上的GDNF作用24h后,C6细胞增殖水平升高,在48h时达到高峰而后趋于平稳或呈下降趋势,与对照组比差异有统计学意义。其中,70μg/LGDNF作用48h后,C6细胞的增殖率明显高于其他实验组。结论外源性GDNF促进体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞增殖的最佳时效及量效作用点为浓度70μg/L、时间48h。     

干扰素联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎28例对照研究

目的　观察干扰素α-2 b联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎 (CHC)的应答情况。方法　84例 CHC患者随机分为 3组。治疗组 2 8例 :干扰素 α-2 b 3 mu,每周 3次 ,肌肉注射 ,同时口服利巴韦林 3 0 0 m g,每日 3次 ,共 6个月 ;对照 A组 2 6例 :干扰素α-2 b 3 m u,每周 3次 ,肌肉注射 ,共 6个月 ;对照 B组 3 0例 :利巴韦林 3 0 0 mg,每日 3次 ,口服 ,共 6个月。停药后 3组均继续观察 6个月。以丙氨酸氨基转移酶 (AL T)正常 ,HCV-RNA阴转为标准观察治疗应答及持续应答情况。结果　治疗结束时及治疗结束后 6个月治疗组、对照 A组和对照 B组 3组治疗应答率及持续应答率分别为 57.1%、3 8.5%、3 .3 %和 42 .9%、19.2 %、0 ,3组比较有显著差异 (P<0 .0 5)。结论　干扰素α-2 b联合利巴韦林治疗 CHC疗效明显优于单独应用干扰素或利巴韦林