Notch1-NICD胞内结构域真核表达载体的构建及其初步功能分析

目的:构建包含Notch1胞内结构域的Notch1-NICD真核表达载体及绿色荧光蛋白载体并转染食管鳞状细胞癌细胞株EC9706及Eca109,并对Notch1-NICD1在食管鳞状细胞癌中的功能进行初步探索.方法:根据Gen-Bank上的Notch1-NICD序列设计扩增引物,由RT-PCR扩增NICD片段,测序鉴定,并通过Blast进行序列比对,然后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)相连,构建Notch1-NICD真核表达载体pNotch1-NICD1,同时将扩增的NICD与pEGFP-C1载体相连构建绿色荧光蛋白表达载体pENotch1-NICD1,并转染EC9706及Eca109,观察Notch1在细胞巾的定位及其途径的激活状态.同时将pNotch1-NICD1真核表达载体转染EC9706及Eca109,用MTT法分别在24 h、48 h、72 h、96 h及120 h观察外源性Notch1片段的导入对EC9706及Eca109细胞增殖的影响.结果:通过RT-PCR获得1个Notch1胞内区片段,并成功构建了包含Notch1胞内区结构域的绿色荧光蛋白载体及真核表达载体.转染pENotch1-NICD1后,Notch1在胞质和胞核内均有表达,表明Notch1信号通路被激活.此外,MTT结果表明转染Notch1-NICD1片段的食管鳞状细胞癌细胞的增殖受到明显抑制(P<0.05).结论:成功构建了Notch1绿色荧光蛋白表达载体及pcDNA3.1(+)真核表达载体.外源Notch1片段的引入能够明显抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖,提示Notch1基因有可能成为治疗食管鳞状细胞癌的一个潜在的分子靶点.     

Notch-1、Notch-3 和 Hes-1 在胃癌中的表达及其临床意义

目的??探讨 Notch 信号通路不同受体（Notch-1、Notch-3）及下游基因 Hes - 1 在胃癌中的表达 及与临床病理参数的关系。方法??选取 2014—2016 年中国人民解放军海军军医大学附属长征医院经病理确 诊的具备完整资料的 30 例不同分期的胃癌标本,通过免疫组织化学染色检测 Notch-1、3 及 Hes-1 的表达, 并收集患者临床病理参数进行统计分析。结果??Notch-1、3 及 Hes-1 在胃癌不同分期中均存在表达,其中 Notch-1 和 Hes-1 阳性率在不同的 T 分期中差异有统计学意义（ P <0.05） ,在中晚期患者中较高（ P <0.05） , 进一步分析表明 Hes-1 和 Notch-1 表达有相关性 （ P <0.05） 。Notch-3 的表达在不同年龄中有差异 （ P <0.05）外,在其他临床病理参数中均无差异。结论??Notch 信号通路中 Notch-1、3 及 Hes-1 在胃癌患者不同临床病理参数中的表达存在一定差异, 未来仍需进一步研究。     

Notch-1蛋白在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的表达

目的探讨肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、成纤维生长因子-4（fibroblastg rowth factor-4,FGF-4）和间接共培养条件下诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞定向分化可行性及Notch信号系统在此分化过程中作用。方法分别采用含有HGF、FGF-4条件诱导液单独培养骨髓间充质干细胞（bone mesenchymM stem cell,BMSC）以及Transwell培养板联合培养MSC和肝细胞,同时加入Notch-1蛋白抑制剂DAPT,通过免疫细胞化学检测白蛋白和Notch-1蛋白表达,RT．PCR检测Notch-1mRNA表达。结果条件诱导液培养第9天免疫细胞化学染色出现白蛋白表达,Notch-1蛋白及Notch-1mRNA表达降低;联合培养组第3天免疫细胞化学染色出现白蛋白表达,Notch-1蛋白及Notch．1mRNA表达降低。加入DAPT抑制Notch信号系统,提高诱导分化率。结论在一定诱导因素作用下,骨髓间充质干细胞可以向肝细胞转化,而且转化的肝细胞具有合成白蛋白功能。在此转化过程中Notch信号系统起到关键作用。     

过表达Notch1对肿瘤细胞增殖的影响

目的通过在肿瘤细胞内过表达Notch1胞内段活性部分,模拟细胞Notch途径的上调,检测细胞增殖状态的变化。方法利用包含Notch1胞内段的逆转录病毒感染实验细胞。通过CBF-1报告载体检测细胞内Notch信号的激活程度,MTS法检测细胞增殖情况,并对细胞的周期分布进行检测。结果Notch1胞内段的表达引起Notch信号在不同细胞中的上调,并引起Hela和HepG2细胞的增殖抑制和BGC-823细胞的增殖加速,而对Chang细胞的增殖没有明显影响。结论Notch信号的上调能引起不同肿瘤细胞增殖状态的变化,对Notch在肿瘤基因治疗中的应用具有重要意义。     

小干扰RNA沉默MAT1基因治疗胰腺癌的实验研究

目的了解体外转录法合成的小干扰RNA（siRNA）沉默MAT1基因对胰腺癌的体内体外抗癌效应。方法用siPORT-脂质体（1ipid）中性阳离子脂质体转染由体外转录法合成、Cy3荧光标记的双链siRNA人胰腺癌BxPC3细胞,观察对胰腺癌细胞生长和细胞周期曲线的影响,检测MAT1基因被siRNA沉默后mRNA和蛋白质的表达水平。在裸鼠胰腺癌皮下移植瘤瘤体内直接注射siRNA观察抑瘤效应。结果合成的4条MAT1-siRNA序列中有一半可显著抑制BxPC3细胞的生长。体外转染MAT1-siRNA72h后,BxPC3细胞生长抑制率达34．9％（P〈0．01）;83．9％的BxPC3细胞滞留于G。／G,期,而空白对照组仅59．86％（P〈0．01）。体外转染MAT1-siRNA48h后MAT1-mRNA水平下调了80．12％,72h后MAT1蛋白质水平下调了50．12％,与各对照组相比差异均有统计学意义（均P〈0．01）。MAT1-siRNA注射组裸鼠移植瘤重量和体积均明显低于对照组（均P〈0．05）,抑瘤率达42．53％。结论siRNA介导的MAT1基因沉默在体外实验中显著抑制了胰腺癌细胞的生长,在体内实验中对裸鼠胰腺癌皮下移植瘤产生明显的抑瘤效应。     

过表达Notch1对肿瘤细胞增殖的影响

目的 通过在肿瘤细胞内过表达Notch1胞内段活性部分,模拟细胞Notch途径的上调,检测细胞增殖状态的变化. 方法 利用包含Notch1胞内段的逆转录病毒感染实验细胞.通过CBF-1报告载体检测细胞内Notch信号的激活程度,MTS法检测细胞增殖情况,并对细胞的周期分布进行检测. 结果 Notch1胞内段的表达引起Notch信号在不同细胞中的上调,并引起Hela和HepG2细胞的增殖抑制和BGC-823细胞的增殖加速,而对Chang细胞的增殖没有明显影响. 结论 Notch信号的上调能引起不同肿瘤细胞增殖状态的变化,对Notch在肿瘤基因治疗中的应用具有重要意义.     

Notch信号通路相关基因的表达与涎腺腺样囊性癌转移的关系

目的筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关的Notch信号通路基因。方法对已构建的涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株ACC-M、ACC-2基因表达谱进行生物信息学分析,在与Notch信号通路基因进行比对后,筛选出差异基因,通过荧光实时定量PCR技术对相关基因的表达差异进行初步验证。结果涎腺腺样囊性癌的表达谱中有46个基因与Notch信号通路有关。验证发现,Notch-1,Notch-2,Notch-4,CHUK,FOXC1,FZD2,FZD3,GBP2和RUNX1在2个细胞株中的表达差别有统计学意义（P〈0．05）,同时Notch-1在发生转移的涎腺腺样囊性癌中的表达明显高于未发生转移的涎腺腺样囊性癌（P〈0．05）。结论Notch信号通路中的多个基因可能参与了涎腺腺样囊性癌的发生和发展;Notch-1的表达与涎腺腺样囊性癌的发生、转移密切相关。     

Notch1和表皮生长因子受体信号通路在调节人舌鳞癌细胞增殖中的交互作用

目的 研究Notch1和表皮生长因子受体(EGFR)信号通路在调节人舌鳞癌细胞增殖中的交互作用.方法 通过分别瞬时转染编码Notch1胞内域的表达载体和靶向人EGFR基因的短发卡RNA(shRNA)的表达载体,以及受体酪氨酸激酶抑制剂 AGl478 处理,分别观察Notch1组成性活化、EGFR基因沉默以及阻断EGFR信号通路对人舌鳞癌细胞系Tea8113 细胞增殖及Notch1和EGFR表达的影响.用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western印迹检测Notch1和EGFR的mRNA和蛋白的变化,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性.结果 Notch1组成性活化抑制Tca8113细胞增殖,上调Notch1表达(mRNA分别为1.102±0.135和0.243±0.032,P<0.05)而下调EGFR表达(mRNA分别为0.083±0.009和0.605±0.075,P<0.05);EGFR基因沉默抑制TcaS113细胞增殖,下调EGFR表达(mRNA分别为0.148±0.019和1.175±0.132,P<0.05)而上调Notch1表达(mRNA分别为0.978±0.115和0.083±0.009,P<0.05);阻断EGFR信号通路对Tca8113细胞的EGFR表达无明显影响(P>0.05),但抑制细胞增殖并上调Notch1表达(P<0.05).结论 Notch1和EGFR信号通路在调节人舌鳞癌细胞增殖中可能存在双向调控的交互作用.     

Notch信号通路在骨与骨病中的研究进展

Notch受体是决定细胞命运的单次跨膜蛋白,当Notch配体的相互作用,使蛋白水解裂解释放出Notch胞内结构域,转位到细胞核中,调节靶基因的转录：包括分割多毛增强剂（HES）和HES相关YRPW基序（Hey）。     

活化Notch1信号促进骨肉瘤细胞体外侵袭作用及机制

目的:初步探讨活化Notch1信号影响骨肉瘤细胞侵袭行为的分子机制。分析Notch1信号活化后,RANKL-OPG-RANK信号轴的变化情况。方法:体外培养骨肉瘤细胞系Saos-2,转染Notch1信号的胞内段ICN1后,检测骨肉瘤细胞的侵袭能力,利用实时定量PCR检测RANKL、RANK和OPG的mRNA表达水平。结果:实验组(Saos-2-ICN)ICN1的蛋白表达水平高于对照组(Saos-2-G418)。Saos-2-G418侵袭细胞数为(41.4±6.4)个,Saos-2-ICN侵袭细胞数为(93.7±12.8)个。Saos-2-G418组RANKL、OPG和RANK分子mRNA相对表达水平分别为(0.6±0.07),(1.2±0.14)和(0.3±0.04);Saos-2-ICN组RANKL、OPG和RANK分子mRNA相对表达水平分别为(1.8±0.3),(0.58±0.09)和(2.0±0.4),两者间具有统计学差异(P<0.05)。结论:活化Notch1信号,提高细胞侵袭力,升高RANKL和RANK基因mRNA表达水平,降低OPG基因mRNA表达水平。本实验结果提示RANKL-OPG-RANK信号轴可能参与Notch1信号调控骨肉瘤细胞的侵袭和转移。     

缺血再灌注前后人心肌组织中Notch信号通路相关分子的变化

目的探讨心脏手术过程中,人心肌组织缺血再灌注后Notch信号分子表达的变化。方法 20例接受体外循环心脏手术的患者,于体外循环前和心脏复跳后15 min后获取心肌样品,以Western Blotting检测Notch信号途径相关受体Notch1胞内区(NICD)和下游分子Hes1表达变化,分析NICD和Hes1在心脏缺血再灌注前后的变化。结果缺血再灌注后心肌组织NICD和Hes1的表达明显减弱,缺血再灌注前后NICD的western blotting信号强度与β-actin信号强度比值分别为:(4.28±0.45)和(1.55±0.36),P0.01;Hes1信号强度与β-actin信号强度比值分别为:(4.61±0.52)和(1.31±0.32),P0.01。结论缺血再灌注过程导致心肌组织Notch途径相关受体Notch1胞内区和下游分子Hes1表达下降,提示Notch信号途径可能在人心肌缺血再灌注损伤中发挥调控作用。     

Notch1信号途径的激活及其对宫颈癌细胞凋亡的影响

目的探讨Notch1信号途径在宫颈癌细胞中的激活，并研究其对宫颈癌细胞凋亡的影响。方法扩增入胎盘组织细胞内的全长NICD，并构建pcDNA3．1-NICD真核表达载体。通过脂质体转染宫颈癌细胞，筛选稳定表达NICD的宫颈癌细胞株。通过RT—PCR及Western blotting检测Notch1和Hes1基因的表达，并通过流式细胞仪观察其对宫颈癌细胞凋亡的影响。结果未处理及转染pcDNA3．1和pcDNA3．1-NICD的Hela细胞中均存在Notch1及Hes1基因的表达，表明该信号通路在Hela细胞中处于激活状态。然而，转染NICD的宫颈癌细胞株Notch1及Hes1的表达明屈升高，提示该通路可能在外源NICD的影响下处于过度激活状态。流式细胞仪检测结果显示，在未处理和转染pcDNA3．1的Hela细胞中，细胞凋亡率差异无统计学意义（P〉0．05）；但与未处理的和转染pcDNA3．1的Hela细胞相比，稳定表达NICD的Hela细胞的细胞凋亡率明显增加（P〈0．01）。结论外源的NICD通过Notch1信号途径能引起宫颈癌细胞的凋亡，提示Notch1可能成为治疗宫颈癌的分子靶点。     

靶向封闭CapG基因对胰腺癌细胞运动侵袭能力的影响

目的观察靶向封闭CapG基因对胰腺癌细胞株BxPC3运动侵袭能力的影响。方法设计并体外合成靶向CapG的小干扰RNA,将其转染到BxPC3细胞中,蛋白质印迹法检测转染前后细胞中CapG蛋白的表达,采用Transwell小室检测转染前后细胞运动侵袭能力的改变。结果CapGsiRNA能有效降低BxPC3细胞中CapG的表达,CapG在蛋白质水平的表达抑制率达80％左右。抑制BxPC3细胞中CapG的表达后,BxPC3细胞的运动侵袭能力明显下降,穿过人工基底膜的细胞数显著低于阴性对照组和空白对照组（P〈0．05）。结论封闭CapG表达能明显抑制胰腺癌细胞BxPC3在体外的运动侵袭能力。     

电穿孔结合苦参素注射液对胰腺癌裸鼠BxPC-3细胞凋亡的影响

目的观察电穿孔结合苦参素对胰腺癌裸鼠BxPC-3细胞凋亡的影响。方法2008年3月至2008年9月．用胰腺癌BxPC-3细胞系建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,随机分为电穿孔结合苦参素组（B＋E＋）、苦参素组（B＋E-）、电穿孔组（B—E＋）和阴性对照组（B—E-）,采用原位末端标记法分别观察各组胰腺癌裸鼠的细胞凋亡率。结果在电穿孔和苦参素的共同作用下,胰腺癌裸鼠的细胞呈凋亡改变,且电穿孔结合苦参素组的细胞凋亡率明显高于其他3组。结论电穿孔结合苦参素可以有效抑制胰腺癌细胞的增殖,提高胰腺癌细胞的凋亡率。     

外磁场作用下特异性磁性NICD对脊髓神经干细胞增殖与凋亡的影响

目的研究Notch信号通路在脊髓损伤部位高表达后,对内源性脊髓神经干细胞再生能力的影响,探讨其在脊髓损伤修复中的作用。方法构建鼠NICD（Notch intracellular domain,NICD）质粒,用经典的氧化还原法将NICD质粒结合至葡聚糖磁性纳米颗粒（dextran magnetic nanoparticles,DMN）上,参照Alivisatos和Conwell方法构建纳米化目的基因,在外磁场作用下转染体外培养鼠脊髓神经干细胞,检测转染前后细胞增殖与凋亡情况。结果纳米化NICD-DMN转染体外培养内源性脊髓神经干细胞后,细胞明显增多,而凋亡明显减少,统计学有显著意义（P〈0.05）。结论特异性磁性NICD在外磁场协助下明显促进内源性脊髓干细胞增殖,抑制其凋亡。     

Notch1、Jagged1在肝细胞癌组织中的表达及临床意义

目的探讨Notch1、Jagged1在肝细胞癌组织中的表达及临床意义。方法选择2010年3月～2012年6月手术治疗并经病理证实为肝细胞癌的患者35例,每例患者均取癌组织及癌旁组织（距癌组织2～3 cm处）,其中肝细胞癌组织35例,癌旁肝硬化组织13例,癌旁正常肝组织22例。采用实时荧光定量PCR法检测Notch1mRNA、Jagged1 mRNA在肝细胞癌组织、癌旁肝硬化组织及癌旁正常肝组织中的表达;免疫组织化学染色法检测Notch1、Jagged1蛋白的表达,并分析两种蛋白的表达与肝细胞癌临床病理特征的关系。结果①肝细胞癌组织中Notch1 mRNA、Jagged1 mRNA的表达分别为（4.58±0.77）、（4.96±0.87）,显著高于癌旁正常肝组织,差异有统计学意义（P〈0.05）;与癌旁肝硬化组织[（1.16±0.37）、（1.42±0.58）]比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;而癌旁正常肝组织与癌旁肝硬化组织比较差异无统计学意义（P〉0.05）。②肝细胞癌组织中,Notch1、Jagged1的阳性表达率分别为71.4%（25/35）、68.6%（24/35）;癌旁正常肝组织中,Notch1、Jagged1的阳性表达率分别为36.4%（8/22）、40.9%（9/22）;癌旁肝硬化组织中,Notch1、Jagged1的阳性表达率分别为30.8%（4/13）、30.8%（4/13）。Notch1、Jagged1的阳性表达率在肝细胞癌组织中明显高于癌旁正常肝组织（χ^2otch1=6.81,χ^2agged1=4.24,P〈0.05）及肝硬化组织（χ^2otch1=6.55,χ^2agged1=5.57,P〈0.05）。Notch1、Jagged1的阳性表达率在癌旁正常肝组织与肝硬化组织间差异无统计学意义（P〉0.05）。Spearman相关分析显示,肝细胞癌组织中Notch1的表达与Jagged1的表达呈正相关（r=0.38,P〈0.05）。③Notch1、Jagged1蛋白的阳性表达率与患者的年龄、性别、肿瘤直径、数目、有无癌栓形成无关（P〉0.05）;与有无淋巴结转移、病理分级密切相关。有淋巴结转移者Notch1、Jagged1阳性表达率高于无淋巴结转移者;低分化癌组织Notch1、Jagged1的阳性表达率明显高于中高分化癌组织,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 Notch信号通路中Notch1、Jagged1对肝细胞癌的发生发展起促进作用,可为判断临床预后提供参考价值。     

hsa-miR-335靶基因预测及生物信息学分析

目的对hsa-miR-335进行系统的生物信息学分析,预测hsa-miR-335可能参与的生物学过程,为本研究小组深入研究其在脂肪细胞分化中的功能和机制奠定基础。方法通过miRbase获取并分析hsa-miR-335序列特征;应用TargetScan,PicTar及miRanda预测hsa-miR-335的靶基因,并结合已证实的靶标基因,进行功能注释（Gene Ontol-ogy）和Pathway富集分析（Pathway Enrichment）。应用NCBI Mapviewer、UCSC Genome Browser等工具对hsa-miR-335进行启动子相关预测。结果 miR-335在各物种之间具有高度保守性,其靶基因功能富集于胰腺外分泌、脂质激酶活性调控、wnt受体信号的调控、细胞周期等生物学过程（P〉0.01）,其靶基因信号通路富集于促性腺激素释放激素信号通路、MAPK信号通路、胰岛素信号通路、细胞周期等信号转导通路（P〈0.05）。启动子预测提示hsa-miR-335为基因内miRNA,在基因组上下游10kb以内存在CpG岛,转录起始位置（TSS）、Poly A信号、转录因子结合位置（TFBS）。结论 hsa-miR-335预测的靶基因集合富集于多个生物学过程,与肥胖密切相关,并可能存在其独立的转录调控机制。为后续miR-335在肥胖人脂肪细胞中生物学功能研究奠定基础。     

胰腺癌组织Stat3、HIF-1α与VEGF表达及意义

目的探讨信号转导与转录活化因子3（Stat3）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）在胰腺导管腺癌组织中的表达及其与胰腺癌临床病理特征的关系。方法采用免疫组化SABC方法检测49例胰腺导管腺癌和lO例正常胰腺组织中Stat3、HIF-1α、VEGF的表达。结果Stat3、HIF-1α、VEGF在正常胰腺组织中的阳性表达率分别为10．0％、0、20．0oA,而在胰腺癌组织中的阳性表达率分别为75．5％、73．5％、71．4％,两组比较差异有显著性（x2=7．323～14．429,P〈0．05）。在胰腺癌组织中,Stat3的表达与病理分级、临床分期和淋巴结转移有关（x2=3．287～14．352,P〈0．05）,HIF-la的表达与临床分期和淋巴结转移有关（x2=9．511、5．200,P〈0．05）,VEGF的表达与肿瘤标志物CA19—9、病理分级和临床分期有关（X2=6．005～11．876,P〈0．05）。在胰腺癌组织中,3种因子的表达均呈正相关（r=0．729~0．792,P〈0．05）。结论Stat3、HIF-lα、VEGF在胰腺癌组织中高表达,三者可能在胰腺癌的发生发展中起重要作用。在胰腺癌的发生发展过程中,Stat3可能直接或者通过HIF-1α间接促进VEGF的表达。