RNAi沉默polβ基因部分逆转食管鳞癌细胞顺铂耐药性

目的 通过RNA干扰（RNAi）技术沉默DNA聚合酶polβ的表达,观察其对食管癌细胞顺铂（cDDP）耐药性的影响。方法 构建靶向polβ基因的siRNA重组慢病毒pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1、pRNAT-U6.2/Lenti-polβ2及阴性对照载体pRNAT-U6.2/Lenti-polβC,将其感染人食管鳞癌顺铂耐药细胞系EC9706/cDDP,通过RT-PCR、蛋白质印迹分析和免疫荧光实验观察细胞polβ的表达情况,采用MTT法观察不同浓度顺铂对细胞生长的抑制作用并计算50%细胞生长抑制所需的药物浓度（IC₅₀）和耐药指数（RI）。结果 靶向polβ的siRNA重组慢病毒pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1和pRNAT-U6.2/Lenti-polβ2感染EC9706/cDDP后均可下调polβ的mRNA和蛋白表达水平,其中前者效果更为显著。顺铂以剂量依赖方式抑制EC9706/cDDP细胞增殖,感染pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1、pRNAT-U6.2/Lenti-polβC的EC9706/cDDP细胞及未感染EC9706/cDDP细胞对顺铂的IC₅₀分别为55.71、62.41、63.11 μg/mL,耐药指数分别为13.9、15.5、15.7,其中前者与后二者相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论 polβ的表达与食管鳞癌细胞系EC9706/cDDP顺铂耐药性有关,沉默其表达可部分逆转EC9706/cDDP细胞对顺铂的耐药性。     

polβ高表达与食管癌细胞耐药的相关性

目的:建立人食管癌顺铂耐药细胞系及稳定高表达人野生型DNA聚合酶beta(polβ)的食管癌细胞系,分析polβ高表达与食管癌细胞耐药的相关性.方法:顺铂(cDDP)中等浓度、间歇作用法历时9 mo建立耐药细胞系Ec9706/cDDP;同时脂质体转染法将人野生型polβ重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-AC3转染入Ec9706细胞,经G418筛选得到稳定转染细胞系.荧光显微镜观察转染效果,普通倒置显微镜观察细胞形态变化.RT-PCR方法分别检测耐药细胞与转染细胞中polβmRNA的表达水平,MTT法检测各组细胞对cDDP的敏感性.结果:荧光显微镜下转染细胞荧光强,转染效率高,倒置显微镜下耐药细胞与转染前后细胞形态无明显改变.RT-PCR结果表明耐药细胞Ec9706/cDDP中polβ表达较亲本细胞增加,转染细胞的polβ表达较空载体转染细胞、对照细胞也增加.Ec9706/cDDP细胞耐药指数为15.70;转染后细胞对cDDP的敏感性降低,耐药指数为1.78.结论:成功建立了耐药细胞系Ec9706/cDDP与稳定高表达人野生型polβ的Ec9706细胞系,polβ的高表达可引起耐药性的产生,耐药细胞中polβ的表达也增高.polβ的表达与食管癌细胞的耐药性有一定相关性.     

GST-π表达水平与人食管鳞癌耐顺铂的关系研究

目的拟通过调控GST-π的表达水平,观察其对食管癌细胞耐药性的影响。方法构建GST-π基因的真核表达载体,转染入亲本细胞EC9706细胞后观察GST-π的过表达是否会促使食管癌细胞耐药性的产生。结果 GST-π的表达载体pIRES2-AcGFP1-GST-π转染入EC9706细胞后,RT-PCR检测GST-πmRNA表达增强,Western blotting见其蛋白表达增强,MTT实验显示该细胞针对顺铂的耐药性增强,耐药指数达2.36。结论该实验说明增加食管癌细胞内GST-π的表达会促使食管癌细胞的耐药性产生。     

靶向CXCR4的siRNA对人食管鳞癌EC9706细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的 探讨CXCR4 siRNA对人食管鳞癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 建立人食管鳞癌细胞株EC9706裸鼠移植瘤动物模型,瘤旁注射化学合成CXCR4 siRNA,同时以瘤旁注射阴性对照siRNA和PBS为对照.监测肿瘤生长变化,测量瘤质量.HE染色观察肿瘤病理学变化,RT-PCR、免疫组化方法检测CXCR4 mRNA和蛋白变化.结果 裸鼠体内实验结果显示,与对照组比较,CXCR4 siRNA组肿瘤生长受到明显抑制,瘤质量下降;HE染色显示对照组肿瘤体积大、异形明显;RT-PCR、免疫组化结果表明CXCR4 siRNA处理组CXCR4 mRNA和蛋白表达下调.结论 CXCR4 siRNA能抑制人食管鳞癌EC9706细胞株裸鼠皮下移植瘤的形成,且能在体内有效下调CXCR4 mRNA和蛋白的表达.     

食管癌放射抗拒细胞P-gp和GST-π表达的研究

目的研究食管癌放射抗拒细胞多药耐药基因的表达。方法以食管癌EC9706细胞为研究对象,采用长期、间隔、γ射线照射的方法建立放射抗拒的食管癌EC9706细胞系EC9706-R,MTT法测定EC9706-R的耐药指数,免疫细胞化学法和RT-PCR法分别测定P-gp、GST-π的蛋白和mRNA的表达。结果EC9706-R细胞耐药指数是EC9706细胞的1.24倍,P-gp和GST-π的蛋白均有表达,mRNA表达比EC9706细胞高。结论诱导建立的食管癌放射抗拒细胞EC9706-R的化疗耐药性有所增高,原因多为放疗增加了P-gp和GST-π的表达。     

药物诱导与耐药基因转染两种方法建立的人食管癌顺铂耐药细胞系的比较

目的比较药物诱导和耐药基因转染两种方法所建立的人食管癌顺铂耐药细胞系的不同特点。方法顺铂(cDDP)中等浓度、间歇作用法历时9个月建立食管癌耐药细胞系Ec9706/cDDP;同时采用脂质体转染法将人野生型DNA聚合酶β(polβ)的重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-AC3转染入食管癌细胞Ec9706,经G418筛选得到稳定转染细胞系Ec9706-AC3。荧光显微镜观察转染效果,普通倒置显微镜观察细胞形态变化。绘制生长曲线,计算群体倍增时间。RT-PCR方法检测细胞中polβmRNA的表达水平,MTT法测细胞对顺铂的敏感性,并观察冻存复苏、撤药培养对耐药性的影响。结果两种方法所获耐药细胞与亲本细胞相比形态无明显变化,polβmRNA表达均增加。Ec9706/cDDP耐药指数为15.70±1.16,冻存复苏对耐药指数影响不大,而撤药培养可使耐药性降低,细胞群体倍增时间延长;Ec9706-AC3细胞耐药指数为1.78±0.67,不受冻存复苏、撤药培养的影响,细胞群体倍增时间不变。结论用不同方法成功建立两种人食管癌顺铂耐药细胞,不同方法获得的耐药细胞生物学特性有所不同。     

靶向survivin的RNA干扰下调肺耐药相关蛋白逆转肝癌细胞耐药性的研究

背景 survivin和肺耐药相关蛋白（LRP）都与肝癌耐药有关,但二者之间的关系尚不十分明确。本研究的目的是观察在体外和体内survivin表达下调后,对LRP表达的影响以及逆转肝癌耐药的效果。 方法 应用RT-PCR和Western-blotting检测SMMC-7721细胞和SMMC-7721/ADM细胞中survivin的表达。应用MTT检测两种细胞对ADM的敏感程度。靶向survivin的siRNA转染SMMC-7721/ADM细胞,检测survivin的表达变化、SMMC-7721/ADM细胞对ADM的敏感程度的变化以及LRP的表达变化。建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型。分别应用靶向survivin的siRNA、不同浓度的ADM以及二者联合对裸鼠肝癌皮下移植瘤进行处理,观察抑瘤效果,并观察全身毒性反应。检测瘤体内LRP的表达变化。两样本均数的比较采用t检验。 结果 SMMC-7721/ADM细胞中survivin的表达强于SMMC-7721细胞（P﹤0.05）。转染靶向survivin的siRNA后,survivin的表达与对照组相比显著下调（P﹤0.05）,肝癌耐药细胞对ADM的敏感程度明显增加,LRP的表达与对照组相比显著下调（P﹤0.05）。裸鼠皮下移植瘤转染靶向survivin的siRNA后,肿瘤体积从第8天起,与对照组相比显著减小（P﹤0.05）。联合治疗组中的裸鼠肿瘤体积与其它各组相比显著抑制（P﹤0.05）。siRNA组和联合治疗组中的裸鼠无明显毒性反应。瘤体内LRP的表达与对照组相比显著抑制（P﹤0.05）。 结论 通过RNA干扰下调survivin的表达,在体外及体内都能够增加肝癌的化疗敏感性,通过抑制LRP的表达使肝癌耐药性发生逆转。     

调控CIAPIN1基因表达对食管癌细胞生长及侵袭性的影响

目的 采用重组慢病毒CIAPIN1表达载体和CIAPIN1沉默载体感染食管癌EC9706细胞,观察调控CIAPIN1基因表达对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及体外侵袭转移的影响.方法 构建CIAPIN1表达慢病毒载体和CIAPIN1 siRNA慢病毒载体,包装得到重组慢病毒;分别感染食管癌EC9706细胞,筛选得到稳定C...     

癌胚抗原基因抑制对溶瘤腺病毒H101治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤的影响

目的:观察癌胚抗原(CEA)特异性基因沉默对溶瘤腺病毒H101杀伤食管癌EC9706细胞作用的影响,以探讨影响H101敏感性的内在因素.方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,构建针对人食管癌EC9706细胞的CEAsiRNA载体,通过基因转染,在EC9706细胞中建立稳定的CEA基因沉默体系,并以空载体转染和未进行转染的EC9706细胞作对照,建立人食管癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,用H101进行瘤内注射.采用Real Time PC和Western Blot方法检测移植瘤组织中CEA的表达,测量肿瘤体积.结果:降低CEA在mRNA和蛋白质水平的表达,对人食管癌EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤成瘤时间和体积无影响,经H101瘤内注射治疗后,干扰组、空载体组和对照组肿瘤体积分别为(50.16±19.01)、(208.13±72.29)、(219.46±46.56)mm3,干扰组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),而空载体组与对照组比较差异无统计学意义(P<0.05).论:抑制食管癌EC9706细胞中CEA的表达,可引起H101敏感性增加.     

靶向重组腺病毒载体逆转肝癌细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,mdr1)反义RNA重组腺病毒载体靶向逆转甲胎蛋白阳性(AFP+)的肝癌多药耐药细胞HepG2R的疗效及作用机制.方法 将携带AFP启动子和EGFP基因的重组腺病毒载体Adeno-EGFP转染人正常肝细胞LO2(AFP-)、人宫颈癌细胞HeLa(AFP-)及HepG2(AFP+)细胞,检测EGFP基因在各细胞的转录水平,证实重组腺病毒载体的靶向性;将携带AFP启动子和mdr1基因反义核苷酸片段的重组腺病毒载体Adeno-asmdr转染HepG2R细胞和HepG2R裸鼠皮下移植瘤模型,检测Adeno-asmdr在体外和体内逆转HepG2R的活性.结果 EGFP基因在AFP阳性的HepG2细胞可得到显著的转录,而在LO2细胞和HeLa细胞,其转录和表达量极少,显示了该载体的良好转录活性以及靶向特异性;Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后,mdr1转录水平下降;Rhodamine 123在细胞内聚集量有所下降;在裸鼠皮下移植瘤实验中,经Adeno-asmdr+ADM处理组,移植瘤体积无增大,TUNEL法检测移植瘤内凋亡细胞增加,而经PBS和ADM处理组移植瘤体积明显增大(P<0.05),ADM处理组移植瘤中出现少量的凋亡细胞,而PBS处理组移植瘤未见凋亡细胞.结论 实验构建的Adneo-asmdr重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2R细胞内特异靶向性表达目的 基因,有效降低mdr1基因产物P-gp170的表达,从而达到对HepG2R细胞MDR的逆转作用;结合化疗药物的作用,可以导致裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡增加,阻止瘤体生长.     

慢病毒载体的构建及低表达和过表达CEA EC9706细胞株的建立

目的:构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒siRNA和表达载体并包装成感染性病毒颗粒,获得稳定低表达和过表达CEA的EC9706细胞.方法:构建CEA siRNA载体:依据siRNA靶序列设计原则,针对人CEA的cDNA序列,设计并合成编码siRNA的3对寡核苷酸序列,克隆入siRNA载体(pRNAT-U6.2/Lenti)中构建3个重组体pRNAT-U6.2-SCEA.构建CEA表达载体:以人CEA的测序质粒为模板,PCR扩增CEA全长,装入pLentiGFP转移质粒,经过测序证实其序列与标准序列完全一致.然后进行重组慢病毒分剐感染EC9706细胞,G418筛选得到稳定感染细胞株.分别用荧光定量Real-time RT-PCR和Western blot检测EC9706细胞中CEA基因表达抑制或增强的效果.结果:EC9706病毒感染48 h后荧光显微镜观察CEA慢病毒载体在细胞中高效表达.经过RTPCR和Western-blot验证:得到3株稳定CEA低表达的EC9706细胞株,其中一个CEA的表达几乎得到完全抑制,1株稳定CEA过表达的EC9706细胞株(EC9706-CEA).结论:建立了稳定低表达和过表达CEA的EC9706细胞株,成功调控食管癌EC9706细胞中CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

肝素酶特异性RNAi对人食管癌移植瘤组织中Hpa基因表达的影响

目的:应用RNAi技术沉默肝素酶(heparanase,Hpa)基因,探讨其对人食管癌裸鼠移植瘤组织中Hpa基因表达的影响.方法:①先转染后成瘤:采用浓度为15 μmol/L体外合成的Hpa小分子干扰RNA(siRNA)转染EC9706细胞72 h,另设无关序列组及空白对照组.然后将转染后的EC9706细胞种植于裸鼠皮下构建裸鼠食管癌移植瘤,待瘤体长至足够大时,取瘤组织;②先成瘤后转染:构建裸鼠食管癌移植瘤模型,待肿瘤长出1周后,依每次3 μg/只腹腔注射siRNA及无关序列,连续3 d,另1组仅注射PBS作空白对照,然后取瘤组织.采用免疫组化及原位杂交技术观察各组瘤组织中肝素酶蛋白及mRNA的表达.结果:无论是先转染后成瘤组还是先成瘤后转染组siRNA均可下调裸鼠食管癌移植瘤组织中Hpa蛋白及mRNA的表达,与无关序列组及空白对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:应用RNAi技术沉默Hpa基因可以有效下调裸鼠食管癌移植瘤组织中Hpa蛋白及mRNA的表达,为临床防治食管癌浸润转移奠定了一定的理论基础.     

RNA干扰对人食管癌裸鼠移植瘤组织中血管内皮生长因子C表达的影响

目的:观察RNA干扰对人食管癌裸鼠移植瘤组织中血管内皮生长因子C(VEGF-C)表达的影响.方法:将转染VEGF-C小分子干扰RNA(siRNA)载体质粒(HX1、HX2和HX3)的EC9706细胞分别注射于裸鼠皮下,以转染无关序列和正常EC9706细胞为对照,SPF环境饲养4周后处死,取移植瘤组织,分别采用RT-PCR和免疫组化SP法检测VEGF-C mRNA和蛋白的表达.结果:5组移植瘤体积、质量及VEGF-C蛋白和mRNA相对表达量差异均有统计学意义(F分别为3.372、3.948、7.621和8.916,P均<0.05).与正常细胞对照组和无关序列组相比,HX1、HX2及HX3转染组移植瘤组织中VEGF-C蛋门及mRNA表达明显降低(P<0.01).结论:VEGF-C siRNA能有效抑制裸鼠食管癌移植瘤组织中VEGF-C mRNA及蛋白的表达.     

人食管癌顺铂耐药细胞系DNA聚合酶β的表达

目的:建立人食管癌顺铂(cDDP)耐药细胞系,测定耐药细胞系DNA聚合酶β(polβ)的表达。方法:以临床食管磷癌化疗用药的最低剂量换算终浓度,采用cDDP(10mg/L)反复间歇 24h暴露法作用于食管癌细胞系ECa -109,建立cDDP耐药细胞系ECa 109 /cDDP;MTT法测定药物敏感性,倒置显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞的周期分布,Westernblot测定细胞内DNApolβ表达水平。结果:与ECa- 109细胞比较,ECa -109 /cD DP细胞形态发生了改变,对cDDP的耐药指数为 1. 56;细胞周期发生了变化,S期细胞增多,G0 /G1 期细胞减少,细胞内DNApolβ表达水平增高(P<0. 05或 0. 01)。结论:ECa-109 /cDDP具有耐药表型,其耐药性产生可能与细胞内DNApolβ表达增高有关。     

人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型的建立及耐药性检测

目的建立人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型,并检测其多药耐药性,为进行肿瘤多药耐药逆转剂的筛选和体内实验研究奠定基础。方法采用皮下接种法建立裸鼠移植瘤模型;观察裸鼠生长状况;移植瘤生长情况;进行瘤重及瘤体积比较;移植瘤P-gp耐药蛋白表达;原代培养细胞,检测移植瘤模型多药耐药性。结果人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤组织病理学检查为低分化腺癌,移植瘤组织原代细胞培养后,P-gp表达强阳性+++,具有多药耐药性,模型建立成功。结论成功建立了人胃癌SGC7901/VCR裸鼠多药耐药移植瘤模型,为胃癌耐药研究提供了较理想的动物模型。     

SDZ PSC833和维拉帕米逆转宫颈癌耐药的对照研究

目的:对照研究耐药逆转剂SDZ PSC833和维拉帕米(Verapamil,VER)体内逆转宫颈癌细胞对丝裂霉素(mitomycin,MMC)耐药的效果。方法:利用人宫颈癌耐药细胞亚系HeLa/MMC裸鼠移植瘤模型,观察裸鼠体内MMC联合应用SDZ PSC833和VER后荷瘤裸鼠肿瘤体积、瘤重、生长曲线及其瘤组织形态学变化,评价SDZPSC833和VER逆转宫颈癌细胞对MMC耐药的效果。结果:裸鼠体内单用MMC抑瘤率为35.79%,联合应用SDZ PSC833和VER后,抑瘤率分别为83.18%和73.24%,分别提高了1.32倍和1.0倍,统计学分析有高度显著差异(P<0.01)。结论:无毒剂量的SDZ PSC833和VER裸鼠体内能基本逆转HeLa/MMC细胞对MMC的耐药性,且SDZ PSC833逆转耐药作用强于VER。     

抑制Wnt-1基因对肺腺癌细胞顺铂耐药性的影响

目的研究siRNA抑制Wnt-1基因对逆转人肺腺癌细胞株A2/cDDP耐药性的影响。方法采用MTT法确定siRNA处理前后A2/cDDP细胞对顺铂的敏感性。结果抑制Wnt-1基因后,能明显逆转A2/cDDP耐药性,差异具有统计学意义(P0.05)。结论抑制Wnt-1基因能体外逆转A2/cDDP对顺铂的耐药性,临床上应引起注意。     

人宫颈癌顺铂耐药细胞系SiHa/cDDP的建立

目的建立人宫颈癌SiHa细胞对顺铂(cDDP)的耐药细胞系并分析其生物学特性。方法用化疗药物cDDP与人宫颈癌细胞系SiHa共培养,逐步增加培养液中cDDP浓度以诱导细胞产生耐药性,建立SiHa细胞对cDDP的耐药细胞系。利用MTT法绘制细胞生长曲线,计算细胞倍增时间并检测肿瘤细胞耐药指数(RI)。免疫细胞化学法检测细胞P-糖蛋白(P-gp)、胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶(GST-π)、拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)蛋白的表达。结果成功建立耐药细胞系SiHa/cDDP(耐cDDP 2μg/mL),倍增时间(45.82±3.69)h,对cDDP的RI为16.131,对多种化疗药物有不同程度交叉耐药。耐药细胞P-gp、GST-π表达较亲代细胞增多(P<0.01),TopoⅡ表达与亲代细胞间差异无统计学意义。结论本研究建立了人宫颈癌顺铂耐药细胞系SiHa/cDDP,为肿瘤细胞体外研究提供了理想的实验模型。     

上调stathmin基因表达对食管鳞癌EC9706细胞的作用

目的 构建stathmin基因真核表达载体,研究上调stathmin基因表达对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用RT-PCR扩增stathmin cDNA,克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体.重组载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株.显微镜观察转染细胞形态学变化,Western印迹法检测转染细胞stathmin蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖活性,平板克隆形成实验观察细胞克隆形成,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠移植瘤实验研究转染细胞的成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pcDNA3.1(+)载体,获得pcDNA3.1-stathmin重组表达载体.Western印迹法证实重组载体上调EC9706细胞stathmin蛋白表达,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组细胞比较,pcDNA3.1-stathmin转染细胞形态变大、多核、有丝分裂障碍;pcDNA3.1-stathmin转染细胞倍增时间延长(25～28 h)、增殖活性降低、细胞克隆形成率下降(34.5%±6.9%),细胞分裂阻滞于G2/M期(21.7%±3.4%),裸鼠体内致瘤性降低,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 重组质粒pcDNA3.1-stathmin上调stathmin基因表达能够抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖和致瘤性,stathmin可能成为食管鳞癌患者治疗的理想靶点.     

PHF8基因对食管鳞状细胞癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的 利用慢病毒(lentivirus)介导的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)建立人食管鳞状细胞癌(esophageal squamous-cell carcinoma,ESCC,以下简称食管鳞癌)裸鼠移植瘤模型,观察锌指蛋白8(plant homeodomain finger protein 8,PHF8)对移植瘤生长的影响。方法 分别将未感染慢病毒(空白对照组)、感染Nonsilencing-shRNA慢病毒(阴性对照shRNA组)和PHF8 shRNA慢病毒(PHF8 shRNA组)的人食管鳞癌细胞系TE-1接种于裸鼠背部皮下,建立食管鳞癌裸鼠移植瘤模型。定期测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。4周后处死裸鼠,定量PCR及Western blotting法检测肿瘤组织中PHF8的表达。结果 PHF8 shRNA组较阴性对照shRNA组、空白对照组的裸鼠致瘤能力明显减弱,PHF8 mRNA和蛋白的表达水平显著降低。结论 慢病毒介导的shRNA干扰能有效减少食管鳞癌裸鼠移植瘤中PHF8的表达,而降低PHF8的表达能抑制食管鳞癌移植瘤的生长。