核因子-κB受体活化因子配体诱导大鼠骨髓破骨细胞形成的实验研究

目的探讨核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)对成年大鼠破骨细胞生成的影响.方法培养依赖于巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的大鼠骨髓巨噬细胞作为前体破骨细胞,观察在含RANKL和/或M-CSF的15%胎牛血清培养基中破骨细胞的生成情况.在盖玻片和牛股骨皮质片上培养1、3、5和7d后,利用形态学观察、TRAP染色以及骨吸收陷窝检测对破骨细胞的生成进行鉴定,并对生成的TRAP( )细胞进行计数和统计分析.结果当培养细胞在RANKL和M-CSF联合作用下,TRAP阳性染色的单核和多核破骨细胞可在3d内迅速形成,骨片吸收实验显示在第5天时骨片上出现明显的骨吸收征象;RANKL呈剂量依赖型诱导TRAP阳性细胞生成.结论在M-CSF的协同作用下,RANKL可明显诱导成年大鼠骨髓破骨细胞的生成.     

小鼠破骨细胞骨髓诱导模型的建立及功能观察

目的 获得大量高质量小鼠破骨细胞,为体外研究破骨细胞骨吸收功能提供丰富的细胞来源.方法 采用巨噬细胞集落刺激因子(maerophage colony stimulating factor,M-CSF)和破骨细胞分化因子(receptor activator of nuclearfactor-κB ligand,RANKL)诱导小鼠骨髓单核细胞分化为破骨细胞,并通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phos-phatase,TRAP)染色和骨吸收实验来鉴定破骨细胞及其噬骨能力.结果 诱导3 d后可见TRAP( )多核细胞出现,诱导5 d后骨片上可见蓝紫色的吸收陷窝.随着培养时间的延长,TRAP( )多核细胞数目和吸收陷窝呈现时间依赖性增长趋势(P<0.05).结论 M-CSF和RANKL诱导小鼠骨髓单核细胞可产生大量的具有活跃噬骨能力的破骨细胞.     

类风湿关节炎患者外周血单核细胞诱导转分化为破骨样细胞

目的 建立类风湿关节炎(RA)患者外周血单核细胞(PBMCs)转分化的培养体系,并对所培养的破骨样细胞(OLC)进行鉴定.方法 抽取RA患者外周静脉血,密度梯度离心法获得PBMCs,分别接种于玻片和骨磨片.随机分为单核细胞集落刺激因子(M-CSF)组(A组),加入25μg/L M-CSF;协同作用组(B组),分别加入不同浓度的核因子κB受体活化子配体(RANKL),5、10、20、25、50μg/L)和25μg/L M-CSF.培养至4、12和20 d时,取玻片行HE染色和抗酒石酸磷酸酶染色计数OLC,取骨磨片行甲苯胺兰染色检测OLC骨吸收活性.结果 对OLC转分化的影响:各组细胞分别于4、12、20 d染色,显示RANKL呈浓度及时间依赖性诱导OLC形成(P<0.05).对OLC骨吸收活性的影响:RANKL和M-CSF协同诱导骨磨片上吸收陷窝的形成,RANKL呈浓度及时间依赖性增强OLC的吸收活性(P<0.05);单独M-CSF刺激不能形成骨吸收陷窝.结论 RANKL和M-CSF可协同诱导RA患者PBMCs转分化为OLC,该培养方法稳定、有效,具有可重复性.     

体外应用不同方法培养破骨细胞的实验对比研究

目的:研究体外应用不同培养方法对所生成的破骨细胞数量及功能的影响?方法:体外采用3种方法培养破骨细胞:A组小鼠骨髓细胞中加入10 ng/ml 巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)培养24 h,未贴壁细胞30 ng/ml M-CSF预诱导3 d后,50 ng/ml M-CSF + 100 ng/ml核因子κB受体活化因子配体(RANKL)继续诱导;B组小鼠骨髓细胞与小鼠颅骨成骨细胞以10∶1的比例混合培养,加入1 × 10-6 mol/L 前列腺素E2(PGE2)和1 × 10-8 mol/L 维生素D3(VitD3);C组小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7中加入100 ng/ml RANKL诱导培养?检测每组细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色情况及牙本质磨片吸收陷窝情况,Real-time PCR检测各组破骨细胞NFATc1?c-Fos表达情况?结果:各组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在牙本质磨片上形成吸收陷窝?B组所形成的破骨细胞数量最多,C组次之,A组最少;B组骨吸收陷窝数目最多,陷窝总面积最大,A组其次,C组最差;B组NFATc1?c-Fos表达高于C组及A组,A组表达最差?结论:3种培养破骨细胞的方法相比较,B组在破骨细胞分化和吸收功能方面优于A?C组?A?C组相比较,A组培养的破骨细胞骨吸收功能更强,C组所培养的破骨细胞分化更佳?     

APE1／Ref-1在外周血单核细胞破骨样分化中的作用研究

目的探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)在核因子κB受体活化因子配体(RANKL)及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导外周血单个核细胞(PBMCs)破骨样分化过程中的作用。方法采用密度梯度法分离提取人PBMCs;将构建的APE1siRNA表达载体导入分离获得的单个核细胞中。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测是否为破骨样细胞(OCL),蛋白免疫印记法(Western blot)检测单个核细胞APE1蛋白表达,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测OCL中组织蛋白酶K(cathepsin K,CK)及V-ATPase基因表达水平。结果 APE1siRNA可明显降低PBMCsAPE1蛋白表达,与未感染APE1siRNA细胞相比,差异有统计学意义(P<0.05);在RANKL/M-CSF作用下单个核细胞可分化为TRAP阳性的OCL,CK及V-ATPase的表达在基因水平升高;但经APE1siRNA处理后,诱导分化的OCL数量减少,CK和V-ATPase的表达在基因水平降低。结论 PBMCs经RANKL/M-CSF诱导培养后可产生大量OCL,APE1siRNA能明显抑制单个核细胞的破骨样分化,APE1参与调节单个核细胞破骨样分化过程。     

CD147对体外破骨细胞分化成熟的影响

目的建立破骨细胞(osteoclasts,OCs)体外分化成熟的模型,研究CD147对OCs分化成熟的影响。方法从外周血分离单个核细胞贴壁培养,使用破骨细胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-κβligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)诱导OCs生成。实验分为对照组、诱导组(RANKL+M-CSF)及阻断组(RANKL+M-CSF+CD147Ab),应用免疫荧光染色和流式细胞术检测CD147在破骨前体细胞(osteo-clast precursor cells,OPCs)的表达;抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色观察OCs的分化成熟情况及Real-time PCR技术检测CD147及TRAP mRNA在OPCs中的表达变化。结果①CD147分子在OPCs细胞膜上表达。②流式细胞术测得细胞膜表面平均荧光强度对照组(159.55±1.65)、诱导24 h组(171.18±3.46)、诱导48 h组(1...     

OPGL诱导小鼠外周血单核细胞分化为破骨细胞及其破骨活性

目的 :观察在小鼠外周血单核细胞培养中破骨细胞抑制因子配基 (osteoprotegerinligand ,OPGL)诱导单核细胞分化为破骨细胞的作用 ,以及地塞米松对破骨细胞分化和骨吸收活性的影响 .方法 :将外周血单核细胞分组培养 ,在A组中加入巨噬细胞集落刺激因子和OPGL ,B组中再加入地塞米松 .多核巨细胞形成后行抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartratere sistantacidphosphatase,TRAP)及甲苯胺蓝染色 .将象牙骨片上骨吸收面积经计算机图像分析以确定其差异 .结果 :外周血单核细胞培养 7～ 10d ,可以见到大量的多核巨细胞 ,体积巨大 .B组中 ,多核巨细胞出现较A组早 .几乎所有的多核巨细胞表现为TRAP强阳性 ,而多数单核细胞和巨噬细胞为TRAP阴性或弱阳性 .在象牙骨片上有大量的骨吸收陷窝形成 ,A、B两组的骨吸收无明显差异 (P >0 .0 5 ) .结论 :OPGL可以诱导小鼠外周血单核细胞分化为破骨细胞并具有骨吸收活性 .地塞米松可加速OPGL诱导的破骨细胞分化作用 ,但对于破骨细胞的骨吸收活性无影响     

人外周血CD68+单核细胞体外的分选及诱导分化为破骨细胞

目的建立高纯度人活性破骨细胞方法,用于对破骨细胞生物化学和分子生物学的研究。方法用免疫磁珠法在人类外周血单核细胞中分选出CD68 细胞,用流式细胞仪分析分选效能,体外在10-8 mol/L地塞米松及25 μg/L巨噬细胞集落刺激因子的培养条件下用16 μg/L可溶性核因子κB受体活化子配体诱导(s-RANKL)分化,用降钙素受体抗体免疫组化染色及抗酒石酸磷酸酶染色鉴定,扫描电镜观察骨片贴壁细胞及骨吸收陷窝。结果分选获得CD68 单核细胞纯度为(93.06±0.61)%(n=4),经核因子κB受体活化子配体诱导后降钙素受体抗体免疫组化染色阳性,抗酒石酸磷酸酶染色,扫描电镜观察有骨吸收陷窝形成。结论人外周血单核细胞中CD68 细胞是破骨前体细胞,在RANKL在诱导下分化为成熟破骨细胞。     

成纤维母细胞样基质细胞促进假体周围骨溶解

目的 探讨松动假体周围的假膜组织中成纤维母细胞样基质细胞在假体周围骨溶解中的作用.方法 从人工假体周围的假膜标本中分离成纤维母细胞样基质细胞并作体外培养,传代后与外周血单核细胞共培养,并向各组内分别加入骨水泥颗粒和破骨细胞形成抑制因子(OPG)等,检测是否有破骨细胞形成及其活性;并采用半定量RT-PCR法检测成纤维母细胞样基质细胞中核因子κ B受体活化因子配基(RANKL)和OPG等破骨细胞调节因子mRNA表达量的变化.结果 细胞共培养结束时观察到抗酒石酸磷酸酶(TRAP)和玻璃蛋白酶受体(VNR)阳性的多核细胞及骨吸收陷窝形成,这一过程可被OPG彻底阻断;骨水泥颗粒组骨吸收陷窝的数量较对照组增加.同时基质细胞表达RANKL和OPG mRNA,骨水泥颗粒组的表达量较对照组分别增加,并且RANKL/OPG的比率增大.结论 人工假体周围假膜中成纤维母细胞样基质细胞表达膜蛋白型及可溶性RANKL,支持破骨细胞分化及其骨吸收活性,从而促进假体周围骨溶解.     

肿瘤坏死因子-α诱导外周血单核细胞分化为破骨细胞

目的:验证肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是否可以直接诱外周血单核细胞(PBMCs)分化为具有骨吸收作用的破骨细胞. 方法:小白鼠PBMCs体外培养中加入TNF-α和白细胞介素-1α(IL-1α)及巨噬细胞克隆集落刺激因子(M-CSF);同时,分别加入细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的拮抗剂RANK:Fc和抗TNF-α中和抗体. 对培养终末细胞作组织化学染色,检测破骨细胞特征性标志物抗酒石酸磷酸酶(TRAP)的表达;并以象牙磨片上虫蚀样骨吸收陷窝的形成为指标检测其生物学活性. 结果:PBMCs体外培养形成大量TRAP阳性的多核细胞(MNCs);象牙磨片上见到虫蚀样骨吸收陷窝,后者的面积对TNF-α呈剂量依赖性. RANK:Fc对此现象无抑制作用,而抗TNF-α中和抗体可完全阻断该现象的发生. 结论:TNF-α能够直接诱导PBMCs分化为具有骨吸收功能的破骨细胞.     

骨片上培养的破骨细胞样细胞及其细胞器对成骨细胞影响的实验研究

目的探讨骨片上培养的破骨细胞及其亚细胞结构对成骨细胞生长和功能的影响。方法C57雌性小鼠,经尾静脉注射5氟尿嘧啶(5FU)后,取其脾脏细胞,在白细胞介素(IL)3、6和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、1α,25(OH)2D3的诱导下获得大量的破骨细胞样细胞(OLC)。OLC在牛皮质骨骨片上培养即获得骨片上的OLC。NaF、两种OLC、离心去除OLC的培养基及其亚细胞结构———细胞核、线粒体与成骨细胞共培养5d后,检测成骨细胞增殖、碱性磷酸酶和骨钙素含量以及Cbfα1的表达活性。结果两种OLC的细胞质和离心去除OLC后的培养基虽然不能促进成骨细胞数量的增多,但可显著增加骨钙素和碱性磷酸酶的比活性以及Cbfα1蛋白质水平的表达(P<0.05);并且以骨片上生长的OLC细胞质和培养基的作用更大。其中,OLC细胞质(0.1100±0.0007)、50%骨片上培养的OLC培养基(0.1200±0.0041)和骨片上培养的OLC细胞质(0.1550±0.0065)对成骨细胞骨钙素比活性的促进作用显著大于10μmol/L的NaF(0.0825±0.0025,P<0.05);OLC细胞质(1.850±0.033)、50%OLC培养基(2.074±0.065)、骨片上培养的OLC细胞质(1.246±0.037)和50%骨片上培养的OLC培养基(1.718±0.048)对成骨细胞碱性磷酸酶比活性的促进作用显著大于10μmol/L的NaF(1.027±0.024,P<0.05);50%骨片上培养的OLC培养基(54.0%±2.1%)和骨片上培养的OLC细胞质(48.7%±3.5%)对成骨细胞Cbfα1蛋白质表达的促进作用与10μmol/L的NaF(57.6%±2.6%)差异无统计学意义。结论两种OLC的亚细胞结构和离心去除OLC后的培养基对成骨细胞的功能均有促进作用,并以骨片上生长的OLC作用更大。     

乳腺癌细胞MDA-MB-231诱导破骨细胞成熟方法研究

目的:探索乳腺癌细胞诱导小鼠骨髓源性破骨细胞成熟最佳条件。方法:采用贴壁分选法和贴壁前加入15 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）贴壁分选法分离得到小鼠骨髓单核细胞。两种分选方法得到的小鼠骨髓单核细胞用30 ng/mL M-CSF处理3 d后,分别均分为两组,一组用50 ng/mL核因子κB受体活化因子配体（RANKL）,30 ng/mL M-CSF和20% MDA-MB-231细胞上清处理7 d;另一组用50 ng/mL RANKL和30 ng/mL M-CSF处理2 d后再用50 ng/mL RANKL,30 ng/mL M-CSF和20% MDA-MB-231细胞上清处理7 d,TRAP染色,统计分析TRAP阳性细胞数和直径大小。结果:50 ng/mL RANKL,30 ng/mL M-CSF和20% MDA-MB-231细胞条件培养基诱导,细胞发生炎症反应;50 ng/mL RANKL和30 ng/ml M-CSF处理2 d后,50 ng/mL RANKL,30 ng/mL M-CSF和20% MDA-MB-231细胞条件培养基能够诱导出成熟的破骨细胞;相比直接贴壁分选,贴壁前加入15 ng/mL M-CSF贴壁分选能够分选出更多具有活力的前体破骨细胞。结论:诱导破骨细胞分化最佳条件为:贴壁前加入15 ng/mL M-CSF处理24 h,30 ng/mL M-CSF 处理3 d后,用50 ng/mL RANKL和30 ng/mL M-CSF处理2 d,再用50 ng/mL RANKL,30 ng/mL M-CSF和20% MDA-MB-231细胞条件培养基诱导7 d。     

神经元特异性烯醇化酶和U266细胞株对破骨样细胞作用的研究

目的：探讨神经元特异性烯醇化酶（NSE）和人多发性骨髓瘤细胞U266对人破骨样细胞（OLC）功能的影响。方法采用正常人外周血单个核细胞加用细胞核因子κB受体激治蛋白配体（RANKL）＋巨噬细胞集落刺激因子（M‐CSF）的方法诱导培养OLC ;实验分3组,NSE组：将6孔培养板中培养14 d的OLC ,分别加入100 ng／mL重组人NSE培养24、48、72 h;共培养组：将6孔Transwell小室下室中培养14 d的OLC ,各上室分别加入1×105／孔U266细胞进行共培养24、48、72 h;对照组：单独培养的OLC。通过实时荧光定量PCR比较NSE和U266细胞株对OLC的RANKL、扩胃蛋白（OPG）、IL‐6和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP） mRNA转录水平的影响。结果共培养组、NSE组和对照组RANKL、OPG、IL‐6 mRNA在OLC均不表达;与对照组相比,共培养组、NSE组的TRAP mRNA表达水平升高,差异有统计学意义（P＜0．01）;TRAP mRNA表达水平的升高尤其以48 h和72 h明显。结论本试验中OLC表达TRAP ,NSE是促进骨髓瘤骨病中OLC分化和成熟的因素,提示NSE能增强OLC的活性。     

人羊膜上皮细胞向卵泡样结构转分化的实验研究

目的研究人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cells ,hAECs）在人卵泡液的长时间刺激下能否转分化为卵泡样结构。方法在前期实验结果基础上,体外分离培养hAECs,5%人卵泡液为诱导条件,延长诱导时间至44 d,倒置显微镜观察细胞形态学改变,化学发光免疫技术检测培养基上清液中雌激素（estradiol,E ₂ ）水平的变化,实时荧光定量-聚合酶链式反应（real time-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测雌性生殖细胞特异性基因（GDF9、DAZL、SCP3）表达情况。 结果诱导组（添加有5%卵泡液的培养基）在培养第10天出现卵母细胞样细胞（OLCs）,随着时间延长,OLCs体积增大,周围见透明带样环变,随后减小,部分消失;对照组无上述现象。诱导组DAZL及GDF9的mRNA表达水平较对照组升高（P<0.05）,并且具有两个高峰;诱导组SCP3mRNA表达水平与对照组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。诱导组有E ₂ 生成,其水平随时间先下降后升高再下降;对照组无E ₂ 生成。结论在体外,hAECs具有向卵泡样结构转分化的潜能。     

硼替佐米对多发性骨髓瘤患者破骨细胞分化和功能的影响

目的观察硼替佐米在多发性骨髓瘤患者破骨细胞体外诱导分化成熟过程中对分化和功能的影响。方法取患者外周血,进行单个核细胞经核因子κB受体活化因子配体(RANKL)及单核细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导破骨细胞分化,采用0.5、1.0、2.5、5.0nmol/L硼替佐米进行处理,14d后观察TRAP(+)破骨细胞数量,检测各孔培养液中的耐酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性,28d后观察骨片上骨陷窝的数量。结果2.5、5.0nmol/L硼替佐米组破骨细胞数量为(157±21)和(98±15)个,较对照组(307±25)个明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);骨陷窝形成数量分别为对照组的(53±24)%和(29±7)%(P均<0.05);上清液中破骨细胞活性分别为对照组的(86±24)%和(60±25)%(P均<0.05)。结论硼替佐米能抑制骨髓瘤患者破骨细胞的分化和功能,可能成为骨髓瘤骨病治疗的新方法。     

葡萄糖浓度波动对人外周血内皮祖细胞增殖、凋亡及内皮型一氧化氮合酶活性的影响

目的 研究葡萄糖浓度波动对人外周血内皮祖细胞(EPCs)增殖、凋亡及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响.方法 采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,经含血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和10%胎牛血清的M199培养基培养7 d,贴壁细胞鉴定为EPCs.细胞同化后给予葡萄糖浓度5.5 mmol/L(正常对照组)、30 mmol/L(糖浓度固定组)和20或40 mmol/L(平均浓度为30 mmol/L,波动间期为3 h,糖浓度波动组).干预6、12、24、48、96 h后,采用WST-1细胞增殖检测试剂盒处理细胞,酶标仪检测细胞增殖;以AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒处理细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡;以一氧化氮合酶检测试剂盒处理细胞,荧光酶标仪检测eNOS活性.结果 当平均浓度相同时,与糖浓度固定组相比,糖浓度波动组抑制EPCs增殖及eNOS活性的作用显著增强(P值均＜0.05),凋亡率显著增高(P＜0.05);糖浓度固定组与糖浓度波动组的增殖率、凋亡率、eNOS活性的差值与干预时间呈正相关(r值分别=0.937、0.927、和0.951,P值均＜0.05).结论 葡萄糖浓度波动作为独立因素促进EPCs的凋亡、抑制EPCs的增殖并降低eNOS的活性.EPCs对葡萄糖浓度波动的适应性差.     

肿瘤坏死因子α对小鼠破骨细胞分化的影响

目的:在诱导破骨细胞分化的体外骨髓细胞培养系统中,研究破骨细胞分化因子(RANKL)存在和不存在的情况下,肿瘤坏死因子α(TNF-α)对破骨细胞分化的影响.方法:选用小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)依赖性非附着性骨髓细胞,在含有25μg/L M-CSF和0,l,10,100μg/L TNF-α的α-MEM培养液中培养5 d后,观察抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)阳性多核细胞的形成;细胞在含有25 μg/L M-CSF和30μg/L sRANKL的α-MEM培养液中进行培养,比较加入和不加人10μg/L TNF-α培养4、5、6和9 d后,所形成的TRAP( )多核细胞的数目和骨吸收面积.结果:TNF-α在没有RANKL的情况下,不能诱导小鼠骨髓细胞形成破骨细胞.在RANKL存在的情况下,TNF-α可促进破骨样细胞的形成和骨吸收,但对破骨细胞分化的促进作用仅表现在培养的早期.结论:在RANKL存在的情况下TNF-α可促进破骨细胞的分化,但不能取代RANKL.TNF-α加速破骨细胞的形成,却并不延长其生存时间.     

锝［99Tc］亚甲基二膦酸盐抑制类风湿关节炎患者外周血单核细胞向破骨样细胞转分化

目的：研究锝［99Tc］亚甲基二膦酸盐（technetium［99Tc］ methylenediphosphonate,99Tc-MDP）对核因子κB受体活化子配体（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor,M-CSF）诱导类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血单核细胞 (peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)向破骨样细胞转分化的影响。方法：从6例RA患者外周血中分离单核细胞,于RPMI-1640培养液中培养,RANKL（25 μg/L）和 M-CSF（25 μg/L）诱导转分化,用不同浓度99Tc-MDP干预（5,10,20,50 mg/L）,在不同时间点（4,12,20 d）终止培养并行HE染色,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色。结果：RA患者外周血单核细胞培养至第12～16天,可见大量TRAP染色强阳性多核巨细胞,99Tc-MDP可显著抑制上述变化,且其抑制作用随浓度的增加而增强（P＜0.05）。结论：99Tc-MDP可通过抑制破骨样细胞转分化而达到延缓RA骨质破坏的作用。     

Raw264.7细胞向破骨细胞分化诱导培养体系的改良

目的：通过改良细胞培养方案建立体外诱导Raw264.7 细胞分化形成成熟破骨细胞（OC）的高效培养体系。方法：向Raw264.7细胞培养液α-MEM中添加50 μg•L^-1 M-CSF、100 μg?L-1 RANKL和1×10^-8 mol•L^-1 1α,25-（OH）2D3， 于5% CO2 、 37℃孵箱中培养12 d，每3　d换液1次，每次换液前对细胞进行短暂消化。倒置显微镜下观察细胞形态变化，并利用HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、FITC-phalloidin染色和免疫荧光染色鉴定OC是否成熟并具有吞噬功能。结果：通过改良培养方法，在诱导过程中培养孔内的大部分区域始终保持单层细胞的生长状态。镜下观察和HE染色，诱导第12天时OC胞体覆盖培养面积的70%；FITC-phalloidin染色，伴随着OC成熟，伪足内出现的束状伪足小体逐渐变为环形，最终融合带状肌动蛋白环环绕在胞质周围；免疫荧光染色，诱导12 d后OC表达的降钙素受体(CTR)较前体细胞显著增加，TRAP染色显示OC胞浆内呈现大量红色颗粒。提示获得的OC成熟并具有吞噬功能。结论： 本实验通过改良培养方法，联合应用细胞因子50 μg•L^-1 M-CSF、100 μg•L-1 RANKL和1×10^-8 mol•L^-1 1α,25-（OH）2D3建立了体外诱导Raw264.7 细胞分化形成成熟OC的高效培养体系。     

VEGF,b-FGF诱导的人外周血单个核细胞向血管内皮祖细胞分化的研究

目的:研究在VEGF, b-FGF诱导下人外周血单个核细胞向血管内皮祖细胞(EPCs)分化的方法. 方法: 采集健康志愿者外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在加有VEGF, bFGF的M199培养基中培养,培养第7 d,免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达. 结果: 人外周血单个核细胞(MNCs)经体外VEGF, b-FGF的诱导分化,表达EPCs的表面标志KDR, CD133和CD34. 结论: 外周血来源的MNCs能在一定的培养条件下可以诱导分化为EPCs.